毒死蜱降解菌降解特性及其降解條件優化

杜曉敏，王金花，朱魯生，王軍，楊莉莉，林琳

（山東農業大學資源與環境學院，山東省高校農業環境重點實驗室，山東 泰安271018）

毒死蜱作為廣譜性有機磷殺蟲劑具有高效、中等毒性等優點，是目前全球范圍內應用最廣泛的5種殺蟲劑之一，廣泛應用于蔬菜、棉花等作物[1-3]。毒死蜱在農業生產上大量使用，其殘留問題也引起了人們的關注。隨著使用量的增加，毒死蜱有可能通過多種途徑進入地表水、地下水，對水生生物存在高風險，并最終影響環境生物和人體健康[4-5]。Smalling 等[6]發現在加利福尼亞州沿海中心河口處，魚類和無脊椎動物體內頻繁檢測出毒死蜱的存在。Campillo 等[7]在地中海沿海的一個流入灣湖的永久性河道口中發現，毒死蜱含量在所監測到殺蟲劑中最高。毒死蜱在全球范圍內的廣泛使用，導致其在全球很多地區都可以被檢測到，雖然這種殘留量還不會導致水生生物養殖區和自然水體中水生生物的大量死亡或滅絕，但是會通過生物富集或者其他方式間接進入人體，最終影響人類健康[8]。有研究表明，日常暴露在毒死蜱污染環境下的人群的呼吸系統患癌率要高于其他人群[9]。調查顯示，農業生產中使用的毒死蜱大部分最終會進入土壤環境，對土壤環境產生負面影響，毒死蜱施用到水稻土中，土壤中真菌數量明顯減少，土壤酶活性也受到一定影響[10]。因此，毒死蜱污染土壤修復需求越來越迫切。

微生物修復技術是目前應用最廣的農藥污染土壤生物修復技術。自20 世紀70 年代以來，已分離并鑒定出多株以毒死蜱為碳源和能源的真菌和細菌，其中黃桿菌（Flavobacterium sp.）[11]是最早發現并被報道的毒死蜱降解菌。另外，已報道的毒死蜱降解菌主要有青枯菌（Ralstonia sp.）[12]、鐮孢霉屬（Fusarium LK.ex Fx）[13]和糞產堿桿菌（Alcaligenes faecalis）[14]等。Yadav等[15]篩選獲得的一株假單胞菌（Pseudomonas sp.）可以有效降解高濃度毒死蜱，毒死蜱濃度為500 mg·L-1時的24 h 降解率為60%。張群等[16]篩選出一株寡養單胞菌（Stenotrophoomonas sp.），在100 mg·L-1毒死蜱溶液中，pH 7.0、溫度30 ℃培養條件下，4 d 內毒死蜱降解率為59%。盡管目前對毒死蜱生物降解的研究已經取得了明顯進步，但仍需要分離更多降解菌以適應不同環境的需要。為進一步豐富毒死蜱降解菌菌種資源，優化菌株降解條件，本研究從大田土壤中篩選分離出1 株毒死蜱高效降解菌，并對其進行鑒定，采用響應面分析法對菌株降解條件進行優化以提高降解效率，以期為毒死蜱污染土壤原位生物修復提供材料和方法基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

毒死蜱原藥（97%）由山東華陽集團提供。氣相色譜分析所用試劑為分析純。

LB 液體培養基：NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH 到7.0 左右，在121 ℃下高壓滅菌20 min。

無機鹽基礎培養基：K2HPO45.8 g，KH2PO44.5 g，（NH4）2SO42.0 g，MgSO40.16 g，CaCl20.02 g，Na2MoO40.002 g，FeSO40.001 g，MnCl20.001 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH 到7.0 左右，在121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

LB 固體培養基：NaCl 10.0 g，蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，瓊脂粉15.0 g，蒸餾水1 000 mL，調節pH 到7.0左右，在121 ℃條件下高壓滅菌20 min。

毒死蜱母液：取1 g 毒死蜱，以丙酮為溶劑，定容到100 mL 容量瓶中，充分搖勻，配成10 000 mg·L-1母液。

毒死蜱溶液：取0.25 mL 毒死蜱母液放入100 mL無機鹽溶液中，使其濃度為25 mg·L-1。

1.2 毒死蜱降解菌的富集與分離

取5 g 土壤加入到50 mL 100 mg·L-1的毒死蜱無機鹽富集培養液中，置于30 ℃、150 r·min-1恒溫搖床培養7 d，以后每隔7 d按10%接種量取培養液接入新鮮毒死蜱無機鹽基礎培養基中，以一定濃度梯度提高毒死蜱用量，至培養液濃度達到1 000 mg·L-1，如此馴化約2 個月。采用平板劃線法，將最后一次培養液進行分離，4 ℃冰箱保存。

1.3 高效毒死蜱降解菌的篩選

將保存的純化菌株接種至LB 固體培養基中，劃線分離單菌落。挑取單菌落至LB 液體培養基中，30 ℃、150 r·min-1恒溫振蕩培養至對數生長期后期。連續活化2 代后，用生理鹽水將培養液離心洗滌兩次并使菌體重懸。以3% 接種量接種至毒死蜱無機鹽基礎培養基中，振蕩培養24 h 后檢測毒死蜱含量，從中挑選降解毒死蜱能力最強的菌株。

1.4 形態特征鑒定

肉眼觀察降解菌的菌落形狀、顏色、透明度、隆起和邊緣特征，利用掃描電鏡觀察菌體大小和表面形態。

1.5 16S rDNA基因序列的測定

細菌基因組DNA 采用EasyPure Genomic DNA Kit試劑盒進行DNA 提取和純化，對菌株的16S rDNA基因進行PCR 擴增，細菌通用引物序列F：5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-GGCTACC TTGTTACGACT-3′[17]。PCR 反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循環30 次；72 ℃終延伸10 min。待反應結束后，取PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，于凝膠圖像成像儀中觀察凝膠電泳結果。由生工生物工程（上海）股份有限公司完成后續PCR擴增產物測序。

1.6 毒死蜱降解菌降解率的測定

毒死蜱濃度采用安捷倫7890B 氣相色譜儀測定。檢測器為FID，檢測器溫度為300 ℃，進樣口溫度為260 ℃；柱溫為程序升溫，初始溫度為140 ℃，以15 ℃·min-1升到200 ℃，保持1 min；載氣流量為7 mL·min-1；壓力為209 kPa，恒壓模式；空氣流量為300 mL·min-1，H2流量為40 mL·min-1；尾吹流量為10 mL·min-1；進樣量為1 μL，保留時間4.6 min。本研究采用外標法，方法檢出限為0.05 μg·L-1，定量限為1.7 μg·L-1。毒死蜱降解率計算公式：

式中：A0為未接菌對照培養液中毒死蜱的濃度，mg·L-1；A為接菌處理培養液中毒死蜱的濃度，mg·L-1。

1.7 毒死蜱降解菌降解特性

1.7.1 環境條件對菌株降解毒死蜱的影響

（1）時間對毒死蜱降解率的影響

以3% 接種量將菌懸液接種至50 mL 毒死蜱無機鹽培養液中，培養時間為12、24、48、72、96 h，pH 為7.0，恒溫培養箱25 ℃、150 r·min-1振蕩培養，底物濃度為25 mg·L-1條件下，取樣測定，計算毒死蜱降解率。

（2）溫度對毒死蜱降解率的影響

以3% 接種量將菌懸液接種至50 mL 毒死蜱無機鹽培養液中，底物濃度為25 mg·L-1，pH 為7.0，調整培養溫度分別為15、20、25、30、35 ℃，150 r·min-1條件下振蕩培養，48 h后分別取樣測定并計算毒死蜱降解率。

（3）pH對毒死蜱降解率的影響

將毒死蜱濃度為25 mg·L-1的無機鹽培養液調整pH 為4.0、6.0、7.0、8.0、10.0，高溫滅菌后接種降解菌，接種量為3%，在25 ℃、150 r·min-1條件下振蕩培養，48 h后取樣測定并計算毒死蜱降解率。

1.7.2 響應面實驗

在單因素試驗基礎上，利用Design-Expert 8.0.6軟件中Box-Behnken design（BBD）模型進行3 因素3水平實驗設計，以培養時間（A）、pH（B）、溫度（C）為自變量，以降解率為唯一響應值，實驗設計因素水平見表1。

1.7.3 降解酶定位實驗

（1）降解酶提取方法

培養24 h 的菌H27 培養液于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心6 min，將下層菌體冷凍保存，加入適量的（NH4）2SO4于上清液中，混勻后使飽和度達到90% 以上，4 ℃鹽析過夜，離心后收集下層沉淀，加入0.05 mol·L-1、pH 為7.5 的PBS 緩沖液重懸，用相同緩沖液透析至無，收集透析液即為胞外酶[18]。

表1 實驗設計因素水平表Table 1 Factors and levels of experiment design

將上一步保存的菌體溶于10 mL 0.005 mol·L-1、pH 為7.5 的Tris-HCl 緩沖液中，25 ℃振蕩20 min，再次4 ℃、8 000 r·min-1離心6 min，下層菌體重懸于冷超純水中，冰浴振蕩6 min后離心，上清液即為細胞周質酶。

用現配的0.05 mol·L-1、pH為7.5的PBS緩沖液將保存收集的菌體洗滌3 次，收集的菌體按3 mL·g-1緩沖液重懸，超聲破碎480 s（功率300 W，工作時間4 s，間隔2 s），將破碎細胞液于4 ℃、8 000 r·min-1條件下離心10 min，上清液即為胞內酶[18]。

（2）降解酶定位

將試驗提取的3 種粗酶液各取1 mL 加入到50 mL 毒死蜱降解培養液中，30 ℃、150 r·min-1培養6 h，并設不加酶液的對照組，測定體系中毒死蜱濃度，并計算降解率及酶活力，進而確定酶在細胞中的分布情況。定義毒死蜱活力單位（U）為30 ℃條件下，1 mL酶液1 h轉化1 mol毒死蜱所需酶量。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離及鑒定

經分離和純化獲得一株毒死蜱高效降解菌，降解率在80% 以上，命名為H27。菌株H27菌落培養特征和掃描電鏡圖如圖1 所示。其形態學特征如下：細胞呈桿狀，能產生芽孢；無鞭毛，不能運動。在LB 平板上的菌落形態：圓形，乳白色半透明，邊緣整齊，中間隆起，較黏稠。

通過將菌株16S rDNA 序列與GenBank 上其他16S rDNA 序列進行Blast 分析（圖2），發現菌株H27與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的相似性為100%。綜合菌株形態特征以及16S rDNA 序列分析結果，初步鑒定菌株H27為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.2 環境因素對菌株H27降解毒死蜱效果的影響

圖1 菌株H27菌落形態及掃描電鏡圖Figure 1 Colony of strain H27 and scanning electron microscopic

圖3 為不同時間、不同溫度和不同pH 對菌株H27 降解毒死蜱效果的影響。降解菌H27 對毒死蜱的降解隨培養時間的變化如圖3A所示。從圖中可以看出，隨著培養時間的延長，降解菌對毒死蜱的降解率不斷增大，在第24 h 時降解已經趨于穩定狀態，平均降解率在80% 以上，說明H27 對毒死蜱具有高效降解效果。

降解菌H27 對毒死蜱的降解隨溫度的變化如圖3B 所示。從圖中可以看出，隨著培養溫度的升高，降解菌對毒死蜱的降解率不斷增大，在25 ℃時達到最大值，隨著溫度繼續升高，毒死蜱的降解速率受到明顯抑制。

降解菌H27 對毒死蜱的降解隨pH 的變化如圖3C 所示。從圖中可以看出，降解菌對毒死蜱的降解率隨pH 增大先增大后減小，在pH 為7.0 時達到最大值，為87.2%。

2.3 菌株H27降解毒死蜱條件的優化

綜合考慮各因素對菌H27毒死蜱降解率的影響，在單因素降解試驗基礎上，利用響應面分析法對降解時間、溫度、pH 3 個因素分析得到菌H27 的最佳降解條件。菌H27 響應面分析實驗設計及結果如表2 所示，對表2 中的數據進行多元回歸擬合，獲得菌H27對自變量溫度、時間、pH 的二元多次回歸方程為：降解率=88.46+0.90A+3.06B-0.80C-1.40AB+0.18AC-0.43BC-1.03A2-5.99B2-5.60C2。由表2 可以看出零點實驗點的降解率較穩定，均在88%左右。

圖3 時間、溫度、pH對菌株H27降解毒死蜱的影響Figure 3 Effects of time，temperature and pH on chlorpyrifos degradation by H27

圖2 菌株H27的16S rDNA系統發育樹Figure 2 Phylogenetic tree of strain H27 on the 16S rDNA sequence

實驗結果的回歸分析見表3。對菌H27 降解率的回歸方程進行檢驗，建立的模型是否有意義取決于P值大小，P值遠小于0.01，說明建立的模型有意義；失擬誤差P 值為0.254 6，不顯著，說明方程對實驗擬合情況較好，誤差小；模型校正決定系數R2為0.998 5，說明此模型能解釋99.85% 的響應值變化，即此模型與數據擬合度很高，實驗誤差小；標準偏差（Std）為0.29，平均數為82.52，變異系數（CV）為0.35%，表明該模型具有較高的置信度，能夠有效反映真實值的情況。因此，該模型對菌H27降解毒死蜱條件的優化合理而有效。

根據回歸方程繪制響應面和等高線圖，結果如圖4 所示。由圖4 和表3 可知，降解時間（A）和pH（B）的交互作用顯著，B 影響顯著性大于A，AB 的交互作用顯著。A 和C、B 和C 對降解菌的降解率影響顯著，但AC、BC的交互作用不顯著。

通過Box-Behnken 響應面優化得到枯草芽孢桿菌H27 降解毒死蜱的最佳降解條件為：降解時間54 h，pH 為7.2、溫度為24 ℃時，毒死蜱降解率理論最優值為88.96%。在此條件下進行實際毒死蜱降解實驗，得到實際毒死蜱降解率為88.16%（3 次重復平均值），與理論最優值擬合度達到99.20%，表明通過響應面法對菌H27降解毒死蜱條件的優化合理有效，并具有實際意義。

2.4 毒死蜱降解酶的定位

提取毒死蜱降解酶，分別測定胞外酶、胞內酶和細胞周質酶對毒死蜱降解效果的影響，實驗結果如表4所示。結果表明，胞外粗酶液與毒死蜱反應，30 min內毒死蜱降解率為23.9%；胞內粗酶液的酶活性較強，降解率為49.6%；細胞周質酶活性略有減小，降解率為35.2%。由此推斷出降解菌產生降解毒死蜱的關鍵酶是胞內酶。

表2 菌H27的響應面分析試驗設計及結果Table 2 Experimental design for response surface analysis and corresponding experimental data

3 討論

本研究成功分離出一株能降解毒死蜱的菌株，經鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。目前從不同地方分離出屬于芽孢桿菌屬的毒死蜱降解菌已有很多，如側芽孢桿菌DSP[19]、Dsp-1和Dsp-3[20]，蠟狀芽孢桿菌HY-1[21]、HY-4[22]和FO-36bT[23]等。有報道指出，該屬細菌能降解許多污染物，如石油烴、苯酚、有機磷農藥等[24-25]。已有研究顯示芽孢桿菌屬菌株在污染物微生物修復方面具有巨大潛力。但報道也指出，多數毒死蜱降解菌環境適應性較差，例如側芽孢桿菌DSP 在其降解最適pH 為7.0 時，降解率在60% 以上，而pH為5.0和9.0時，毒死蜱降解率僅為20%和30%，說明該毒死蜱降解菌受pH 影響較大，環境適應性較差。本研究中降解菌H27為枯草芽孢桿菌，屬于典型的有益細菌，具有控制不同類型細胞發育的能力。因此其對外界有害因子抵抗力強，分布于土壤環境、水環境、大氣環境及動物腸道等處。降解菌H27在中性或弱堿性的條件下都具有較高的活性，在pH為4.0以及pH 為10.0 的條件下依然具有明顯的降解效果，即使最低的降解率也達到了54.81%，所以該菌對pH 具有較高的耐受性，可以適應比較寬范圍的pH變化。

表3 菌H27響應分析試驗回歸分析結果Table 3 Results of the regression analysis of response analysis

圖4 時間、溫度和pH及其交互作用對毒死蜱降解率影響的曲面圖和等高線圖Figure 4 Response surface and contour plot of time，temperature，pH and their interactions on degradation of chlorpyrifos

表4 菌H27不同組分對毒死蜱的降解Table 4 Biodegradation of chlorpyrifos in the different component of strain H27

響應面分析法是結合實驗設計和數學建模的一種方法，目的是尋找多因素系統中的最佳條件，已被廣泛應用到微生物培養基優化中，但利用響應面分析法優化降解條件的研究較少。已報道的降解菌降解特性研究大部分都以單因素實驗為主，例如范瑞娟等[26]研究了不同鹽度和pH 條件下菌株對多環芳烴（PAHs）的降解特性；錢娜等[27]研究了不同pH、溫度和NaCl濃度對降解菌株生長的影響；賀強禮等[28]運用單因素實驗初步確定苯酚降解的最適條件，在此基礎上利用響應面分析法確定其最優降解條件，優化后的最佳降解條件可使菌株對苯酚降解率提高7% 左右；王博等[29]在響應面法優化氨氮降解菌凈化高原地區污水研究中發現，降解時間、pH 和接種量對降解率有顯著影響，且3 因素交互作用對響應值有一定影響，響應面分析法所得最佳降解條件比單因素實驗降解條件下提高8.12%。由此可以看出，與單因素實驗相比，在響應面分析優化后的降解條件下菌株降解率會有一定提高。本研究利用響應面法優化設計，研究了時間、pH 和溫度3 個因素對菌株降解毒死蜱效果的影響，得到最佳降解條件下降解率有一定提高，且實際降解率與預測值接近，說明此方法能有效預測并優化菌株對污染物的降解。在后續研究中可利用研究所得模型與實際農藥降解相結合，最大程度地去除環境中的農藥污染。在研究中發現，通過響應面實驗優化降解條件，一定程度上提高了降解菌降解率，但仍不能達到100%，推測可能是毒死蜱降解產物對毒死蜱降解過程產生了影響。有研究表明毒死蜱初級代謝產物為3，5，6-三氯-2-吡啶酚（TCP），累積的TCP會對環境中細菌、真菌和放線菌產生一定抑制作用，不僅影響微生物自身生長繁殖，還會抑制毒死蜱降解[30-31]。

生物降解是通過生物作用，將大分子物質轉化成小分子化合物的過程。生物降解農藥主要通過微生物及有關酶來進行。目前研究普遍認為毒死蜱主要通過共代謝和礦化作用進行微生物降解[32]。微生物降解化學農藥的作用方式有兩大類：一類是通過酶促反應。首先微生物細胞表面吸附農藥，此過程是動態平衡，降解初期出現“遲緩期”；然后農藥進入細胞內；最后農藥在細胞膜內發生酶促反應，此過程較快。微生物通過酶促反應降解農藥的方式主要有氧化、脫氫、還原和水解等類型[33]。另一類是通過微生物活動改變環境的理化特性，間接作用于農藥[34]。大多數微生物降解農藥反應屬于酶促反應。降解物種類不同，降解酶在微生物細胞中分布位置也不同。已有報道指出，一些降解酶屬于胞內酶和胞外酶，還有一些分布在細胞周質中。劉亞光等[35]研究發現降解菌W2 降解異噁草松關鍵酶是胞內酶；王卓婭等[36]研究發現克雷伯氏菌ZD112 降解氯氰菊酯的關鍵酶位于細胞內；湯鳴強等[37]發現一株降解三唑磷農藥的降解菌，其降解關鍵酶為胞內酶；任明[38]分離出一株高效降解毒死蜱的不動桿菌（Acinetobacter sp.），通過降解酶定位研究發現其降解關鍵酶是胞內酶；徐蓮等[39]發現降解功夫菊酯的芽孢桿菌GF-3 的降解酶是胞外酶。由此可見，微生物不同位置的降解酶可能與污染物降解過程有關[40]。由于微生物對毒死蜱降解過程的復雜性，且芽孢桿菌屬降解毒死蜱的微生物酶定位還不明確。因此，本研究以毒死蜱為研究對象，通過室內實驗研究毒死蜱微生物芽孢桿菌降解酶定域，為降解酶的進一步研究提供了理論基礎。后續研究中應加強對降解機理的研究，開發出更高效的降解酶資源。同時，毒死蜱降解酶基因工程將是今后研究方向之一，通過基因工程技術將毒死蜱降解酶基因克隆到宿主菌中使其高效表達，構建高效農藥降解菌，對于生態農業發展、保護生態環境有著重要的意義。

4 結論

（1）本研究篩選出一株毒死蜱高效降解菌，將其命名為H27。經菌落形態分析和16S rDNA 基因序列鑒定，確定菌株H27 為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

（2）通過單因素實驗確定毒死蜱降解的最適時間為48 h，最適溫度為25 ℃，最適pH 為7.0。采用中心組合實驗設計，結合Box-Behnken 及響應面分析，優化菌株H27 降解條件為：降解時間54 h、pH 7.2、溫度24 ℃，在此條件下該毒死蜱高效降解菌對毒死蜱的降解率可達88.96%。

（3）菌株H27降解毒死蜱的關鍵酶是胞內酶。