中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr1 RNA最佳干擾片段的篩選

郭麗娜，趙慧婷，任有蛇，徐 兵，姜玉鎖*

(1. 山西農業大學動物科技學院，山西太谷 030801；2. 山西農業大學生命科學院，山西太谷 030801； 3. 山西農業大學工學院，山西太谷 030801)

中華蜜蜂Apisceranacerana是我國特有的蜜蜂品種，其善于利用零星蜜粉源，對我國山區和低溫開花植物授粉有著極其重要的作用，而中華蜜蜂傳粉行為與其嗅覺系統中的相關蛋白的功能有著密切的關系。蜜蜂的嗅覺系統是需要多種蛋白分子參與的復雜的化學信號通訊過程，其嗅覺感知起始于特異性的氣味受體(Olfactor Receptor, ORs)蛋白與氣味分子的結合后激活信號轉導級聯反應，打開離子通道，從嗅覺感覺神經元向大腦發送電信號并產生氣味相關動作電位。Kriger等最早發現意大利蜜蜂ApismelliferaAmelR2與果蠅DrosophilaOr83b和岡比亞按蚊AnophelesgambiaeAgOr7同源，表達于意蜂觸角毛型感器和板形感器中(Kriegeretal., 1999; Liuetal., 2013)。隨后，Liu等從意大利蜜蜂A.mellifera全基因組中鑒定出177個ORs(Liuetal., 2012)，Wanner等從東方蜜蜂Apiscerana全基因組鑒定出119個ORs(Wanneretal., 2007)。和其他的昆蟲相比，蜜蜂擁有較多種類的氣味受體基因，這可能與蜜蜂群體內化學通訊及蜜蜂和花之間的化學通訊存在著密切的關系(Miuraetal., 2009)。

RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在雙鏈RNA(dsRNA)誘發下同源靶基因mRNA被特異地降解，從而導致轉錄后靶基因表達沉默，引起相應的功能表型缺失的現象。該技術已成為研究基因功能的重要工具，具有高效、快速、穩定、特異性強等特點(Uryuetal., 2013; 馮小艷和張樹珍, 2017)。在蜜蜂中，該技術已經在調控目標基因的表達、級型分化、病蟲害防治中進行了大量的研究。調控目標基因表達方面：Beye等(2002)首次在蜜蜂上應用RNAi技術成功阻斷了E30靶基因在整個胚胎中的表達。隨后，Gatehouse等(2004)通過對采集蜂注射dsRNA能使其咽下腺的淀粉酶活性顯著降低。Amdam等(2006)通過RNAi技術下調蜜蜂卵黃蛋白基因的表達水平導致工蜂味覺反應增強。Costa等(2017)敲除意大利蜜蜂鞣化激素基因AmBursα和AmBursβ能阻止表皮的黑化和硬化過程。級型分化方面：Aronstein等(2006)證實沉默蜜蜂跨膜蛋白Sid-1表達后，結果使蜜蜂大量死亡和形態發生變異。Patel等(2007)發現敲除蜜蜂營養能量感應激酶TOR(target of rapamycin)基因能阻止幼蟲發育成蜂王。Kucharski等(2008)研究發現，當抑制DNA甲基化轉移酶Dnmt3能破壞剛孵化的蜜蜂幼蟲朝蜂王方向的發育，從而決定幼蟲發育方向。防治蜜蜂病毒病方面：Maori等(2009)發現飼喂意蜂以色列急性麻痹病毒(Israeli acute paralysis virus, IAPV) dsRNA能夠使IAPVA表達受到抑制，阻止蜂群崩潰失調病(CCD)的發生。Desai等(2012)以蜜蜂畸翅病毒(Deformed Wing Virus，DWV)為靶標，飼喂幼蟲和成蜂dsRNA時發現能顯著降低死亡率和畸翅癥狀。Zhang等(2016)對感染中蜂囊狀幼蟲病(Chinese sacbrood virus, CSBV)的幼蟲進行RNAi研究時發現，飼喂中蜂幼蟲CSBV結構蛋白VP1基因dsRNA后，能顯著降低中蜂幼蟲死亡率。以CSBV RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)基因為靶標干擾結果更顯著，幼蟲死亡率更低(史紅霞等，2019)。

本課題組之前的研究從中華蜜蜂中克隆并鑒定出1個傳統的氣味受體ORs(conventional receptors)基因AcerOr1(GenBank登錄號：JN 792580)，在工蜂和雄蜂不同發育階段的觸角中均能夠檢測到表達(趙慧婷，2013)。蜜蜂的氣味受體在其采集食物、親屬辨認、工蜂監督和防御等行為上起著重要的作用(Hallemetal., 2006)，但是與其他昆蟲如果蠅和蚊子等相比，有關蜜蜂Ors功能的研究很少，因此本研究通過構建相應的AcerOr1基因干擾質粒，并篩選出最佳的干擾序列，為進一步研究AcerOr1的功能提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試蜜蜂

中華蜜蜂Apisceranacerana飼養于山西農業大學中蜂實驗場。取封蓋子脾放置于人工氣候箱(溫度32℃、RH 65% ±5%)，待出房后將蜜蜂放置于飼喂盒(10 cm×5 cm)中，將培養箱溫度調整為28℃，濕度不變。

1.1.2主要試劑、菌株、質粒

Trizol?Reagent、PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit和SYBR SYBR?Premix Ex TaqTMII Kit購自TaKaRa；JM109、T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒、Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒和pGEM?-T Easy載體購自Promega；EcoRI和BamHI購自NEB；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自Omega；Plasmid Mini Kit購自康為世紀；感受態細胞TOP10、昆蟲細胞蛋白提取試劑盒購自生工；辣根過氧化物酶酶標羊抗兔β-actin、蛋白酶抑制劑PMSF、BCA蛋白定量試劑盒、ECL超敏發光底物等購自Boster；AcerOr1多克隆抗體購自北京京成天脈。

1.2 實驗方法

1.2.1AcerOr1基因dsRNA的合成

以NCBI上AcerOr1(JN792580)和GFP(JQ064510.1)基因CDS區為模板，使用Primer Premier 6.0設計3個不同片段大小的引物(見表1)，并在引物5′端添加T7啟動子序列：TAATACGACTCACTATAGGG。以克隆測序后含有目的基因AcerOr1部分序列的質粒DNA作為模板進行PCR擴增(條件：94℃ 3 min，94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 45 s，35個循環，72℃ 10 min)。使用Wizard?SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒對PCR產物進行純化并對純化后的PCR產物定量，使其滿足體外合成dsRNA的量。根據T7 RiboMAXTM Express RNAi System試劑盒操作手冊使用T7 RNA聚合酶將上述回收的DNA產物體外合成dsRNA，濃度測定后，-80℃保存備用。

表1 AcerOr1 dsRNA合成和mRNA表達分析所需引物

1.2.2中華蜜蜂飼喂dsRNA實驗

試驗設置dsAcerOr1-1，dsAcerOr1-2，dsAcerOr1-3 3個處理組和dsGFP1個對照組。新羽化出房的蜜蜂置于飼喂盒中饑餓處理(排便)2 d，使用移液槍對蜜蜂進行dsRNA飼喂，每頭蜜蜂飼喂10 μg dsRNA，對照組飼喂等量dsGFP，每組飼喂30頭，飼喂后的蜜蜂置于(溫度28℃，RH 65%±5%)恒溫箱中飼養。每天更換新鮮飼料。

1.2.3干擾效果檢測

(1)qPCR檢測干擾效果

采集飼喂dsRNA后4日齡的蜜蜂液氮速凍，提取RNA，反轉錄cDNA，進行qPCR檢測飼喂dsRNA后蜜蜂體內AcerOr1表達情況。(qPCR反應體系為20 μL：cDNA模板2 μL，上、下游引物(20 mM)各0.8 μL，SYBR Green Premix 10 μL，Rox 0.4 μL，ddH2O 6 μL。擴增條件為：95℃ 30 s，95℃ 5 s，57℃ 40 s，72℃ 30 s，72℃ 5 min，35個循環)(所用引物見表1)。

(2)蛋白質印跡檢測干擾效果

采用昆蟲細胞蛋白提取試劑盒提取細胞總蛋白，以每孔上樣蛋白量20 μg進行12% SDS-PAGE凝膠電泳分離后，半干轉膜儀將分離膠轉至硝酸纖維素膜(NC膜)，TBST洗膜3次，每次10 min。用5%脫脂奶粉室溫封閉1.5 h，TBST洗膜3次，每次10 min。TBST稀釋的一抗AcerOr1(1 ∶1 000)4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10 min。TBST稀釋的二抗驢抗兔IgG室溫溫育2 h，TBST洗膜3次，每次10 min ECL顯色。

1.2.4數據處理

采用SPSS 22.0對數據進行方差分析及差異顯著性檢驗。統計方法采用T-test(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 dsRNA模板合成檢測

以中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr1(JN792580)和GFP(JQ064510.1)全長為模板，克隆得到含有T7啟動子的AcerOr1和GFP基因片段后，測序驗證。結果顯示(圖1，圖2)：氣味受體AcerOr1的3個大小不同片段的dsRNA合成模板和GFP的1個dsRNA合成模板均已加上T7啟動子(綠色)，該產物可以回收用于下一步dsRNA合成。

2.2 體外合成的dsRNA檢測

將合成的大小不同片段的dsRNA經濃度檢測顯示均在8～10 μg/μL之間，隨后各取1 μL 10倍稀釋后電泳檢測，結果如圖3所示：體外合成的中華蜜蜂AcerOr1(1-3)和GFP(7)的dsRNA片段大小與目標片段大小一致，可用于后續的基因沉默。

2.3 最佳干擾片段篩選

qPCR檢測不同片段的干擾效果，結果如圖4所示：飼喂大小不同的3個dsRNA片段后對中華蜜蜂AcerOr1基因的表達干擾效果不同。飼喂429 bp dsAcerOr1-1組與對照組(dsGFP)相比，AcerOr1基因表達量之間不具有顯著的統計學差異性(P>0.05)，而飼喂218 bp的dsAcerOr1-2組和543 bp的dsAcerOr1-3的實驗組與對照組相比，AcerOr1基因表達量均有顯著的抑制，抑制率分別為88.85% ±0.12%和69.16% ±1.06%(P<0.05)。用Western blot進一步檢測不同片段干擾效果，結果如圖5所示：與mRNA檢測結果一致，與對照組相比，飼喂dsAcerOr1-1片段后沒有變化，而飼喂dsAcerOr1-2后AcerOr1蛋白的表達量受到顯著抑制(P<0.05)，綜合上述RNA檢測結果，合成的dsRNA干擾片段在蛋白和RNA水平均能干擾AcerOr1的表達。

3 結論與討論

將外源dsRNA順利導入細胞是誘發RNAi效應成功的關鍵。將外源dsRNA導入昆蟲體內并誘發RNAi常用的方法主要有浸泡法、注射法、飼喂法等(Xiongetal., 2013；Sapountzisetal., 2014)。其中飼喂法最先是由Fire研究小組發現，通過飼喂線蟲C.elegans表達dsRNA的大腸桿菌可以誘發RNA干擾效應(Timmons and Fire, 1998)。隨后在蟋蟀Gryllusbimaculatus(Meyeringvos and Müller, 2007)、白蟻Reticulitermesflavipes(Zhouetal., 2008)、意大利蜜蜂Apismellifera(Nunes and Sim?es, 2009)等多種昆蟲上都通過飼喂法成功干擾相關基因的表達。本研究采用飼喂法并誘發中華蜜蜂體內氣味受體RNA干擾效應，以期為中華蜜蜂AcerOr1基因功能研究提供實驗基礎。

圖1 中華蜜蜂AcerOr1 dsRNA模板Fig.1 dsRNA templates based on genes from AcerOr1 of Apis cerana cerana注：A，B，C分別為片段大小為429 bp，218 bp，543 bp的dsAcerOr1模板(圖中綠色區域為引物兩端加上的T7啟動子序列)。Note: A, B and C are respectively for the fragment size of 429 bp, 218 bp and 543 bp dsAcerOr1 template (green areas for primer T7 has the promoter sequences on both ends).

圖2 GFP dsRNA模版Fig.2 dsRNA templates based on genes from GFP注：片段大小為625 bp(圖中綠色區域為引物兩端加上的T7啟動子序列)。Note: The fragment size of 625 bp (green areas for primer T7 has the promoter sequences on both ends).

圖3 體外合成dsRNAFig.3 dsRNA synthesized in vitro注：Marker，蛋白標準分子量；1～3分別為片段大小為體外合成的429 bp，218 bp，543 bp的dsAcerOr1片段；4～6為體外合成的dsAcerOr2片段；7為體外合成的dsGFP片段。Note: Marker, Protein molecular weight marker; 1～3, The fragment with the size of 429 bp, 218 bp and 543 bp of dsAcerOr1 synthesized in vitro; 4～6,The fragments of dsAcerOr2 synthesized in vitro. 7, The fragments of dsGFP synthesized in vitro.

圖4 飼喂中華蜜蜂不同大小片段dsAcerOr1對AcerOr1mRNA表達量的影響Fig.4 Effect of different sizesof ds AcerOr1 on the expression of AcerOr1 mRNA in Apis cerana cerana

圖5 飼喂中華蜜蜂不同大小片段dsAcerOr1對AcerOr1蛋白表達量的影響Fig.5 Effect of different sizes of dsAcerOr1 on the expression of AcerOr1 protein in Apis cerana cerana

許多研究證明長鏈dsRNA較短鏈dsRNA在昆蟲中干擾效果更明顯。例如在對果蠅Drosophila胚胎的RNA干擾中發現，長度為300～1 000 bp的dsRNA干擾活性最大，且RNAi干擾效果隨dsRNA鏈的增長增強(Wicheretal., 2008)。而對于同源性很高的基因，長鏈dsRNA則可能造成非靶標基因沉默的現象，這時短鏈dsRNA的干擾效果最好。本研究對中華蜜蜂氣味受體AcerOr1設計并合成了3個不同大小的dsRNA片段進行RNAi，結果顯示，218 bp的短鏈dsRNA沉默效果最好，說明本實驗所選的基因dsRNA片段大小對RNAi作用效果明顯。

特異性是RNAi的關鍵問題，dsRNA能否真正破壞靶基因的表達，靶基因的沉默是否是由于dsRNA引起的值得我們研究。本試驗從以下幾個方面來解決該問題。(1)飼喂dsGFP做對照組。GFP是在水母中發現的一種蛋白質，中華蜜蜂體內沒有該蛋白質，所以在昆蟲RNAi中常被用作對照，以排除核酸本身對中華蜜蜂的影響；通過比較，發現目的基因表達量下降確實是飼喂目的基因dsRNA引起，而不是由飼喂外源基因dsRNA而引起的。(2)Western blot定量檢測干擾后中華蜜蜂體內AcerOr1蛋白表達量。與對照組相比，干擾后實驗組中華蜜蜂體內AcerOr1蛋白相對表達量顯著下降，而內參β-actin蛋白相對表達量沒有發生變化，說明內源性目的基因AcerOr1表達被特異性抑制，而不是由于其他基因的沉默所導致。

綜上所述，本試驗通過飼喂中華蜜蜂dsRNA介導體內RNAi的試驗，干擾氣味受AcerOr1基因體內表達，在mRNA和蛋白水平對干擾效果進行了初步檢測，結果顯示飼喂dsAcerOr1后能顯著降低中華蜜蜂體內AcerOr1mRNA和蛋白表達水平，為后續進一步研究中華蜜蜂氣味受體基因AcerOr1功能打下了基礎。