不同葉綠素測定方法的比較研究

趙京東，宋彥濤，何 暢，徐鑫磊，烏云娜，李琳琳

(大連民族大學 環境與資源學院，遼寧 大連 116605)

高等植物體中葉綠素主要包括葉綠素a和葉綠素b，均是參與光合作用的重要色素[1]，其含量的多少是衡量植物光合作用強弱的重要指標[2]。目前，研究者們測量植物體內葉綠素含量主要有兩種方法。其一是實驗室化學分析，即使用丙酮、乙醇等有機溶劑浸泡植物葉片后，根據葉綠素在溶劑中對特定波長的光有最大吸收，采用分光光度計測定在該波長下葉綠素溶液的吸光度，再根據相關公式推導即可計算葉綠素含量[3]，但由于該方法所需儀器較多，耗時較長，不適于樣品量較多的野外實驗。其二是使用便攜式SPAD 葉綠素儀，其特點是測量過程中不需試劑，在保證植物與葉綠素儀接觸的情況下可直接得出葉綠素的相對含量，即SPAD值，具有無損、實時檢測等諸多優點，彌補了傳統實驗室分析的不足，深受廣大學者們的青睞[4]。先前的研究表明，葉綠素儀已在羊草葉片、黑麥草葉片、煙葉、草莓葉片、西葫蘆葉片以及小麥葉片等葉綠素含量預測中得到了廣泛的應用[5-10]，但不同物種利用SPAD值預測葉綠素含量的模型準確度還存在一些差異[5]，針對同一環境下不同的功能群和物種，便攜式SPAD葉綠素儀和傳統實驗室分析兩種方法是否均適用，還需要進一步驗證。

本研究對大連民族大學經濟技術開發區校區校園內的四類功能群共八種植物的SPAD值和葉綠素含量進行了測定，探討不同功能群和物種間的SPAD值和葉綠素含量差異以及SPAD 值與葉綠素含量之間是否存在相關性，為利用SPAD值預測不同物種間的葉綠素含量提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗地概況

實驗地點位于大連民族大學經濟技術開發區校區(遼寧省大連市經濟技術開發區遼河西路18號)校園內。該校區位于大連經濟技術開發區中心地帶，屬暖溫帶半濕潤大陸性季風氣候，年均降水量550-950毫米，年均氣溫10.5℃左右，最高氣溫35.3℃左右，最低氣溫在-18.8℃左右。

1.2 實驗設計與取樣方法

于2017年9月晴朗天氣，在大連民族大學校園內選取八種常見物種，共四類功能群，每類功能群兩種植物。分別為：喬木：加楊、銀杏；灌木：紫丁香、冬青；藤本：紫藤、蘿藦；草本：苦賣菜、車前草。采用便攜式SPAD(502)葉綠素儀測定和丙酮浸取法測定兩種方法進行植物葉綠素的測定。

便攜式SPAD葉綠素儀測定法：在植物葉片上隨機選取五個位置進行SPAD值的測定，最后取平均值，記錄相應數據后采摘裝袋，標記后帶回實驗室進行丙酮法測定。每種植物隨機測定30片樣品。

丙酮浸取法測定：將帶回的鮮葉用打孔器取樣并稱重(與SPAD測量的葉片相同)，然后放置于標號的試管中，在每個試管中用移液管加入10 ml的80%的丙酮溶液，用封口膜封口置于陰暗處放置48 h。48 h后分別在吸光度663 nm和646 nm下以80%的丙酮為空白測定吸光度，記錄數據。采用Lichtenthaler[11]公式計算葉綠素a(Ca)、葉綠素b(Cb)以及總葉綠素(Ca+b)含量。

1.3 數據分析

將功能群、物種作為固定因子進行一般線性模型分析，不同功能群和物種間進行多重比較(Tukey檢驗)，采用一般線回歸分析度量SPAD和葉綠素之間的線性相關，顯著性水平α=0.05。統計分析在SPSS 26中完成，Sigmaplot 12.5和Excel2018作圖表。

2 結果與分析

2.1 不同植物之間葉綠素的方差分析

SPAD和丙酮法都能體現不同功能群或物種之間的差異，一般線性模型結果顯示：不同功能群和不同物種之間SPAD與葉綠素含量差異極顯著(P≤0.001)，見表1。

2.2 不同功能群葉片SPAD和葉綠素含量的差異

從SPAD值來看，四類功能群SPAD值變化范圍分別為：喬木：34.04～61.44，灌木：48.10～82.14，藤本：29.38～62.00，草本：28.62～66.36。灌木SPAD值最高，顯著高于喬木、藤本及草本(P<0.001)，喬木SPAD值顯著高于藤本和草本，藤本和草本之間無差異(圖1A)。從葉綠素含量來看，四類功能群葉綠素a含量變化范圍分別為：喬木：0.65～2.97 mg·g-1，灌木：0.52～2.75 mg·g-1，藤本：0.03～1.09 mg·g-1，草本：0.39～1.80 mg·g-1。喬木和灌木葉綠素a含量最高，其次為藤本，草本葉綠素a含量最低(P<0.001)(圖1B)；葉綠素b含量變化范圍分別為：喬木：0.01～1.34 mg·g-1，灌木：0.09～1.16 mg·g-1，藤本：0.02～1.99 mg·g-1，草本：0.07～0.59 mg·g-1。藤本葉綠素b含量最高，顯著高于喬木、灌木及草本(P<0.001)，而喬木、灌木以及草本間無差異(圖1C)；總葉綠素含量變化范圍分別為：喬木：0.79～3.74 mg·g-1，灌木：0.62～2.96 mg·g-1，藤本：0.41～2.08 mg·g-1，草本：0.49～2.20 mg·g-1。喬木和灌木總葉綠素含量最高，藤本和草本最低(P<0.001)，如圖1。

2.3 不同物種葉片SPAD和葉綠素含量的差異

從SPAD值來看，八種植物SPAD值變化范圍分別為：加楊：34.04～58.36，銀杏：46.66～61.44，紫丁香：48.10～62.66，冬青：63.54～82.14，紫藤：34.20～62.00，蘿藦：29.38～49.28，苣荬菜：35.34～66.36，車前：28.62～52.28，SPAD值由高到低表現為冬青>紫丁香>銀杏>苣荬菜>紫藤>加楊>蘿藦>車前(圖2A)。從葉綠素含量來看，八種植物葉綠素a含量變化范圍分別為：加楊：0.97～2.97 mg·g-1，銀杏：0.65～1.51 mg·g-1，紫丁香：1.15～2.75 mg·g-1，冬青：0.52～1.71 mg·g-1，紫藤：0.03～0.15 mg·g-1，蘿藦：0.36～1.09 mg·g-1，苣荬菜：0.54～1.80 mg·g-1，車前：0.39～1.03 mg·g-1。葉綠素a含量由高到低表現為紫丁香>加楊>苣荬菜>銀杏>冬青>蘿藦>車前>紫藤(P<0.001)(圖2B)；葉綠素b變化含量分別為：加楊：0.06～1.34 mg·g-1，銀杏：0.01～0.32 mg·g-1，紫丁香：0.20～1.16 mg·g-1，冬青：0.09～0.48 mg·g-1，紫藤：0.42～1.99 mg·g-1，蘿藦：0.02～0.59 mg·g-1，苣荬菜：0.07～0.59 mg·g-1，車前：0.08～0.24 mg·g-1。葉綠素b含量由高到低表現為紫藤>加楊>紫丁香>苣荬菜>冬青>蘿藦>車前>銀杏(P<0.001)(圖2C)；總葉綠素含量變化范圍分別為：加楊：1.09～3.74 mg·g-1，銀杏：0.79～1.67 mg·g-1，紫丁香：1.89～2.96 mg·g-1，冬青：0.62～2.19 mg·g-1，紫藤：0.46～2.08 mg·g-1，蘿藦：0.41～1.38 mg·g-1，苣荬菜：0.62～2.20 mg·g-1，車前：0.49～1.22 mg·g-1?？側~綠素含量由高到低表現為加楊>紫丁香>苣荬菜>紫藤>冬青>銀杏>蘿藦>車前(P<0.001)，如圖2。

2.4 不同方法間的回歸關系

對四類功能群共八種植物葉片SPAD值與葉綠素含量進行線性回歸分析，結果見表2。喬木功能群的加楊和銀杏SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總葉綠素含量之間均存在顯著線性關系；灌木功能群的紫丁香SPAD值與葉綠素a和總葉綠素含量之間存在顯著線性關系，與葉綠素b含量之間無顯著線性關系，而冬青SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總葉綠素含量之間均存在顯著線性關系；藤本功能群的紫藤SPAD值與葉綠素a之間存在顯著線性關系，與葉綠素b和總葉綠素含量之間無顯著線性關系，蘿藦SPAD值與葉綠素a之間存在顯著線性關系，與葉綠素b和總葉綠素含量之間無顯著線性關系；草本功能群的苣荬菜SPAD值與葉綠素b和總葉綠素含量之間存在顯著線性關系，與葉綠素a之間無顯著線性關系，車前SPAD值與葉綠素a和總葉綠素含量之間存在顯著的線性關系，與葉綠素b之間無顯著線性關系。

表2 不同物種葉綠素含量與SPAD值的關系

續表2 不同物種葉綠素含量與SPAD值的關系

2.5 不同物種間葉綠素a和葉綠素b比值的差異

不同物種間葉綠素a/b值均存在極顯著差異(P<0.001)。銀杏葉綠素a/b值最高，紫藤葉綠素a/b值最低，其余六種植物間無顯著差異，如圖3。

3 討 論

葉綠素含量是植物生理的重要指標之一，反映了植物光合能力、發育階段、生長狀況、生理代謝水平及營養條件[4]。本研究發現，不同功能群和物種間SPAD值和葉綠素含量表現出極顯著差異(圖1～2)，這說明便攜式SPAD葉綠素儀和80%丙酮浸取法(鮮葉)兩種方法均適用，但變化趨勢不同。SPAD葉綠素儀通過二極管發射660 nm和940 nm 的紅光和近紅光進行葉綠素 SPAD 值的測定，SPAD值是一個無量綱的比值，在測定植物葉片相對葉綠素含量的同時具有對葉片無損傷的優勢[2]，但不同物種利用 SPAD 值預測葉綠素含量的模型準確度還存在一定差別，需根據測定目標的不同進行具體分析[5]。而傳統實驗室方法雖可避免物種間模型差異，但耗時較長，野外實驗中樣品存放時間過長也會導致葉綠素流失，王凱等[12]研究發現，當以單位鮮重計算葉綠素含量時，含水量高的葉片往往會低于含水量低的葉片，結果會產生一定誤差，因此，兩種方法間存在差異。本實驗測定了八種植物共24組葉綠素數據(表2)，其中與SPAD值達到顯著線性關系的有17組，未達到顯著線性關系的有7組，其中包括葉綠素a一組，葉綠素b四組，總葉綠素兩組，且除加楊和苣荬菜外，其余六種植物SPAD值與葉綠素a回歸系數(R2)均高于葉綠素b，說明SPAD值與葉綠素b的相關性不及葉綠素a。這可能與SPAD葉綠素儀的吸收波長有關(660 nm和940 nm)，葉綠素a和葉綠素b的吸收峰在663 nm和645nm附近[12-13]，相對于葉綠素b，葉綠素a的吸收峰更接近于儀器測定波長，因此線性回歸系數更高。

在SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總葉綠素含量呈顯著線性關系的三種植物中，SPAD值：冬青>銀杏>加楊，總葉綠素含量：加楊>冬青>銀杏，在八種植物當中，加楊的SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總葉綠素含量回歸系數均最高，說明SPAD值可準確預測加楊葉片中葉綠素含量，且加楊和紫丁香葉片中葉綠素總量最高。這可能是由于加楊、銀杏以及紫丁香屬高大喬木，具有較寬的生態位，優先對光能進行利用和截留，但銀杏的總葉綠素含量卻遠遠不及加楊和紫丁香。梁俊林等[14]對9-11月份銀杏葉變色期的研究發現，銀杏葉從微黃變全黃總葉綠素含量從3.999 mg·g-1降到0.077 mg·g-1，本實驗中銀杏的總葉綠素含量為1.89～2.96 mg·g-1，已屬于微黃期，但單從外觀不易分辨，銀杏葉片中葉綠素的不斷降解是其逐漸變黃的成因[14-15]，導致結果偏低。

在本研究中，除紫藤外，其余七種植物葉綠素a、葉綠素b以及總葉綠素含量的變化趨勢一致，葉綠素a含量均顯著高于葉綠素b含量，而紫藤的葉綠素a卻顯著低于葉綠素b含量，導致葉綠素a與葉綠素b比值最低，為0.06，遠低于其他物種(圖3)，這是一個有趣的發現。Hoflacher等[16]研究發現，在葉綠素a與葉綠素b比值中，陰生植物葉綠素a/b值往往小于3，說明紫藤能夠忍受一定程度的遮蔭環境，而除紫藤外，其余七種植物均適合生活在光線充足的向陽處。在研究區內，紫藤位于遮蔭位置，且葉片多呈藍紫色，張春牛[17]研究發現葉綠素b在藍紫光部分的吸收帶較寬，而陰生植物能在散射光下更好的利用藍紫光，與本實驗結果吻合。

4 結 論

通過對四類功能群即八種植物的SPAD值和葉綠素含量進行了測定比較和相關分析，不同功能群和不同物種之間SPAD與葉綠素含量差異極顯著(P≤0.001)，但趨勢不同。其中加楊、銀杏以及冬青葉片SPAD值與葉綠素a、葉綠素b以及總葉綠素含量間均存在顯著線性正相關性，而紫丁香、紫藤、蘿藦、苣荬菜以及車前則存在無顯著關系。因此，在測定不同物種間葉綠素時，如兩種方法間存在顯著相關性，優先選擇方便、快捷且無損的便攜式SPAD葉綠素儀；如出現無顯著關系的結果，在選擇實驗方法時，可根據具體研究目的和內容而定。