細胞周期檢查點激酶1的表達對豬卵母細胞體外成熟的影響

韓國波，李英花，葉孟傲然，許永男,2*

(1.延邊大學農學院，吉林 延吉 133000；2.吉林省延邊黃牛種質資源保護工程研究中心，吉林 延吉 133000)

卵母細胞的成熟是指卵母細胞在受到多種因素的影響下其活性得以激活，完成第一次減數分裂進入到第二次減數分裂中期的過程，其中生發泡破裂(GVBD)是減數分裂恢復的標志。卵母細胞開始減數分裂前的停滯和從MI到MII是其減數分裂的兩個非常重要的時期,也是阻礙其成熟的兩個主要原因[1-2]。Chk1是細胞周期中的一套保證DNA復制和染色體分配質量的檢查機制，是一類負反饋調節機制。當細胞周期進程中出現異常事件，如DNA損傷或DNA復制受阻時，這類調節機制就被激活，及時地中斷細胞周期的運行，待細胞修復或排除故障后，細胞周期才能恢復運轉[3-4]。研究Chk1在豬卵母細胞中的表達和定位及其對豬卵母細胞減數分裂的影響，對于改善豬卵母細胞體外成熟具有重要意義。

有研究表明，Chk1對小鼠卵母細胞減數分裂前的停滯是必需的，消耗Chk1會加速小鼠卵母細胞的GVBD，其過表達會使小鼠卵母細胞紡錘體組裝檢查點(SAC)活化，并阻礙卵母細胞的成熟[5]；而豬卵母細胞的成熟不需要Chk1，但Chk1的敲低會延緩卵母細胞的成熟，并對染色體的排列有影響[6]。卵母細胞減數分裂的重新開始與細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)的活動密切相關，Chk1可抑制細胞周期調控因子Cdc25，使CDK1和CDK2失活，DNA不能被復制；此外，它有助于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Wee1/Myt1)的磷酸化，使Wee1/Myt1更穩定[7-8]。Chk1也在SAC調節中發揮作用，在有絲分裂中SAC通過延緩姐妹染色單體分離，直到所有姐妹染色單體的著絲粒與兩極的紡錘絲相連接，來防止染色體的異常分離[9]。停在減數分裂初期的卵母細胞，其CDK1的活性由幾個因素調節而維持在較低程度。細胞周期蛋白B(Cyclin B)是CDK1相關蛋白，通過去磷酸化來激活CDK1；Cdc25磷酸酶在哺乳動物中包括Cdc25A、Cdc25B、Cdc25C，負責CDK1的Thr14、Tyr15位點的去磷酸化來激活CDK1；Wee1/Myt1激酶家族通過磷酸化CDK1的Thr14和Tyr15位點負調控CDK1；Gwl激酶通過與ENSA/ARPP19相互作用抑制蛋白磷酸酶2A(PP2A)的激活，PP2A可負調節CDK1的活化。在G2中，由于CDK1在Thr14和Tyr15被Wee1/Myt1激酶家族磷酸化，因此，卵母細胞促成熟因子(MPF)被抑制，當細胞進入M期時，磷酸酶Cdc25被激活，通過去磷酸化CDK1在Thr14和Tyr15的磷酸位點來激活CDK1，CDK1反過來磷酸化自己的調節器，從而增強Wee1/Myt1抑制和Cdc25激活[10-13]。

已知chir-124是一種基于喹諾酮的小分子，在結構上與其他已知的Chk1抑制劑無關，它在體外有效地和選擇性地抑制Chk1[14]。本研究采用chir-124代替向卵母細胞內注射干擾RNA的方法來消耗Chk1，以進一步研究Chk1對豬卵母細胞減數分裂成熟的影響，并為進一步提高豬卵母細胞成熟的效率提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

組織培養基(TCM-199)、磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)、透明質酸酶(Hy)、聚乙烯醇(Hepes-TL-PVA)、Triton X-100、anti-tubulin、Hoechst 33342均購自Sigma公司。立體顯微鏡購自OLYMPUS公司；共聚焦顯微鏡購自尼康公司；熒光定量PCR儀購自安捷倫公司；培養箱購自ESCO公司。

1.2 方法

1.2.1 卵母細胞的收集和培養

從屠宰場收集豬卵巢放入到添加有75 ng/L青霉素G和50 ng/L硫酸鏈霉素的磷酸鹽緩沖鹽水(DPBS)中運輸到實驗室。用配備有18號針頭的10 mL注射器反復抽取卵巢上的2～8 mm卵泡，將卵泡液放入15 mL離心管中，在37 ℃水浴中靜置15 min后棄去上清液，加入Hepes-TL-PVA清洗液重懸沉淀，再次靜置15 min后棄去上清液，反復2次。將重懸液放入直徑為90 mm培養皿中，在顯微鏡下，用口吸管挑選卵丘包裹3層以上且細胞質均勻的卵丘細胞-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complexes，COCs)。挑選完成后用培養液洗滌3遍，轉入培養皿中平衡4 h左右的成熟培養液滴內(25枚/100 μL)，放入培養箱里(39 ℃，5% CO2),用礦物油覆蓋。

1.2.2 不同濃度chir-124處理卵母細胞

將chir-124溶于二甲基亞砜(DMSO)中保存，使用時用TCM199培養液稀釋。將GV期卵母細胞分別放入含有0、0.1、0.5和1 μmol/L的chir-124 TCM199培養基中，覆蓋石蠟油后在39 ℃，5% CO2培養箱中培養。在15 h時收集卵母細胞，進行免疫熒光染色(使用Hoechst 33342對卵母細胞進行活染，觀察其細胞核)，并統計卵母細胞處于各時期(GV-Ⅰ，GV-Ⅱ，GV-Ⅲ，GV-Ⅳ 4個時期)的數量。隨后在18 h時收集卵母細胞，觀察并統計到達GVBD的卵母細胞。

1.2.3 0.5 μmol/L chir-124處理卵母細胞

使用0.5 μmol/L chir-124在卵母細胞成熟的不同時期進行處理，處理時間分別為0～24 h、0～44 h、24～44 h(分別對應GV期到GVBD期、GV期到MII期、GVBD期到MII期)，隨后統計各階段卵母細胞的比率。

1.2.4 減數分裂相關基因的檢測

應用實時熒光定量PCR進行檢測。分別在0和0.5 μmol/L chir-124處理組各取20個GVBD期卵母細胞放入不含Ca2+和Mg2+的PBS中清洗，于液氮中迅速冷凍，-80 ℃保存備用。使用Dynabeads mRNA Kit提取mRNA，利用Oligo(dT)12-18引物和SuperScript逆轉錄酶對RNA進行反轉錄，獲得cDNA。用特異性引物(見表1)對chk1、cdk1、cdc25C、cyclinb1、gwl的mRNA進行實時熒光定量PCR檢測。根據DyNSmo SYBR Green qPCR Kit方法進行反應。PCR反應程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性10 s，退火30 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。熔解曲線分析：65～95 ℃，加熱速率0.2 ℃/s，連續熒光測量，在實時熒光定量PCR反應中加入SYBR Green，得到最終冷卻到12 ℃的熒光數據。通過生成熔解曲線對實時熒光定量PCR產物進行分析。應用2-ΔΔCt法分析基因表達的相對定量。

表1 引物序列

1.2.5 免疫熒光染色

將卵母細胞經0.1% PVA-PBS洗滌3次后，放入添有3.7%多聚甲醛的PVA-PBS中，在室溫下固定20 min，然后轉移到含0.5%的Triton X-100的PVA-PBS中透膜1 h；室溫下用PBS(含1% BSA)清洗5～8次，每次3 min，放入 PBS(含1% BSA)中在室溫下封閉1 h，之后在一抗中避光、4 ℃孵育過夜，抗體的稀釋比例是anti-tubulin(1∶200)，anti-chk1(1∶200)；第二天用PBS(含0.1% Tween 20 和 0.01% Triton X-100)室溫洗脫一抗6次，每次3 min，然后用二抗稀釋液在室溫下孵育1 h，稀釋液用PBS(1∶100 Alexa Fluor 488 goat-anti-mouse IgG)；PBS(含0.1% Tween 20 和 0.01% Triton X-100)清洗6次，用Hoechst 33342 復染核；最后將卵母細胞放到玻璃載玻片上封片，在共聚焦顯微鏡下拍照。使用Image J軟件進行熒光強度分析。

1.3 統計分析

每個試驗設有3次重復，試驗數據均使用SAS程序進行差異顯著性分析，所有數據用平均值±標準誤表示，以P<0.05為差異顯著性判斷標準。

2 結果

2.1 Chk1在豬卵母細胞成熟過程中的表達和定位

Chk1在豬卵母細胞減數分裂4個階段的表達與定位分別見圖1與圖2。結果表明，chk1 mRNA在GV期向GVBD期過渡階段的表達水平下降，在GVBD期到MI期階段的表達水平顯著升高(P<0.05)，并且持續到MII期(圖1)。同時，Chk1蛋白在GV期主要定位在生發泡內，在 GVBD期主要定位在核的周圍，在MI期和MII期主要定位在紡錘體上(圖2)。

注：不同字母表示差異顯著(P<0.05)；相同字母或無字母標注表示差異不顯著(P>0.05)。下同圖1 chk1 mRNA在豬卵母細胞成熟過程中各個時期的表達水平

2.2 不同濃度chir-124對豬卵母細胞恢復減數分裂的影響

GV期卵母細胞的四個階段如圖3所示，用不同濃度(0、0.1、0.5及1 μmol/L)的chir-124對GV期的豬卵母細胞進行處理后，觀察卵母細胞處于各個時期的比例如圖4和圖5所示。用0.5μmol/L的chir-124處理的卵母細胞在GV期前3個階段的影響與其他3組無顯著差異；但是在GV-IV階段其影響顯著高于其他3組(P<0.05)。而且0.5μmol/L chir-124處理的卵母細胞到達GVBD期的百分率顯著高于其他3組(P<0.05)。

DAPI.細胞核(藍色熒光)；Chk1.Chk1蛋白(紅色熒光)；Merged.合成圖圖2 Chk1蛋白在豬卵母細胞成熟過程中各個時期的定位(40×)

圖3 豬卵母細胞GV期的4個階段(40×)

圖4 不同濃度chir-124對GV期豬卵母細胞比率的影響

圖5 chir-124對豬卵母細胞GV期達到GVBD期比率的影響

2.3 降低Chk1的表達水平對卵母細胞GVBD及隨后成熟的影響

為了進一步研究Chk1在豬卵母細胞成熟過程中的作用，用0.5 μmol/L chir-124在卵母細胞成熟的不同時期進行處理，結果見圖6。從GV期開始處理卵母細胞后，發育到GVBD期(圖6A)和MII期(圖6B)的比率均顯著高于對照組(P<0.05)。然而，從GVBD期開始處理卵母細胞，到達MII期的比率與對照組相比差異不顯著(圖6C)。

A.0～24 h；B.0～44 h；C.24～44 h圖6 chir-124處理不同時期豬卵母細胞的GVBD與MII百分率

2.4 chir-124處理豬卵母細胞對減數分裂相關基因表達的影響

如圖7所示，與對照組相比，0.5 μmol/L chir-124處理chk1 mRNA表達水平顯著降低(P<0.05)，同時gwlmRNA表達水平也顯著降低(P<0.05)，cdc25C、cdk1和cyclinb1 mRNA表達水平的與對照組相比，有增加但無顯著差異。

圖7 chir-124處理對減數分裂相關基因表達的影響

2.5 Chk1的表達對第二次減數分裂的影響

如圖8所示，通過共聚焦顯微鏡觀察紡錘體的變化，與試驗組相比，對照組MI期染色體沒有完全分離；試驗組MI期、MII期紡錘體發生了很大變化，而對照組兩個時期的紡錘體幾乎沒有變化。

DAPI.細胞核(藍色熒光)；Tubulin.紡錘體(綠色熒光)；Merged.合成圖圖8 豬卵母細胞MI期和MII期的紡錘體形態(大圖10×；小圖40×)

3 討論

3.1 Chk1在豬卵母細胞成熟過程中的表達和定位

Chk1被報道在卵母細胞成熟的每個階段都有表達[5-6]。為此，本研究在豬卵母細胞成熟的4個階段(GV、GVBD、MI和MII期)分別檢測了Chk1的表達與定位。結果顯示，Chk1從GV期到MII期的各個時期都有表達，在MI期和MII期含量急劇升高，這表明細胞周期在這兩個階段容易受到干擾。此外，研究還發現Chk1隨著紡錘體的形成而產生變化，也表明Chk1可能通過影響紡錘體功能進而影響豬卵母細胞的成熟。

3.2 不同濃度chir-124對豬卵母細胞恢復減數分裂的影響

卵母細胞GV期可以根據待成熟時受抑制狀態的生發泡的發育程度進一步分為GV-Ⅰ、GV-Ⅱ、GV-Ⅲ和GV-Ⅳ 4個階段[15]。根據Tao等[16]的研究，本研究用不同濃度的chir-124對GV期的豬卵母細胞進行處理，然后將卵母細胞分別定位于GV期的不同階段。結果顯示，所有處理組處于GV-Ⅰ期的卵母細胞比率均比對照組低，說明Chk1的消耗加快了卵母細胞從GV-Ⅰ期發育到GV-Ⅳ期的速度，且用0.5μmol/L的chir-124處理時卵母細胞達到GV-Ⅳ的比率顯著高于對照組。因此，在后續的試驗中都使用了這個濃度。

3.3 降低Chk1的表達水平對卵母細胞GVBD及隨后成熟的影響

在小鼠中，降低Chk1的表達可以促進卵母細胞到達GVBD的速率，但是對后續的減數分裂進程沒有影響[5]。然而在豬卵母細胞中，Chk1的耗竭會降低卵母細胞成熟的速率，并對MI期卵母細胞的染色體排列產生不利影響[6]。本研究中，用0.5 μmol/L chir-124對GV期豬卵母細胞進行處理后，發現Chk1的消耗顯著增加了豬卵母細胞達到GVBD的比率，并且相應地增加了達到MII期的比率，但是在GVBD后再處理chir-124消耗Chk1時，這種促進效果消失。因此，推測Chk1只是在GVBD前對豬卵母細胞的成熟有影響，即加快卵母細胞到達GVBD 的速率，但對隨后的成熟沒有影響。這與Nie等[6]的結果相反，可能是由于處理方法不同，對Chk1相關基因的表達產生了不同的影響，具體機制仍有待探究。

3.4 chir-124處理豬卵母細胞對減數分裂相關基因表達的影響

DNA損傷檢查點由ATM、ATR、Chk1或Chk2、Cdc25和其他相關的下游蛋白組成，通過信號通路ATM/ATR-Chk1/Chk2-Cdc25對細胞生長具有廣泛的作用[17-18]。其中Cdc25的磷酸化會導致CDK1的失活，而細胞減數分裂的開始與CDK1的活性密切相關[19]。本研究檢測了MII期卵母細胞中與CDK1相關基因的表達量，發現Chk1的消耗顯著降低了gwl基因的表達，并且略微提升了cdc25C和cyclinb1基因的表達水平。其中，gwl基因負反饋調節cdk1基因，cdc25C和cyclinb1正反饋調節cdk1基因的去磷酸化，使其保持相對較高的活性水平[20-22]，進而促進卵母細胞恢復減數分裂的進程。

3.5 Chk1的表達對第二次減數分裂的影響

Chk1對于SAC的功能和將BubR1募集到動粒中是必需的[23]。在小鼠卵母細胞中，Chk1的消耗對于SAC的功能沒有影響，但是Chk1的過表達激活了SAC并阻止同源染色體的分離[5]。在豬卵母細胞中，Chk1的消耗減少了SAC相關蛋白的表達量[6]。本研究發現，對照組MI期和MII期卵母細胞的染色體數量與狀態一致，即卵母細胞沒有渡過MI期，停滯在MI期；而chir-124處理組的卵母細胞，MII期的染色體數量相較于MI期明顯減半，說明Chk1的表達會活化SAC，從而阻止同源染色體的分離，將卵母細胞固定在MI期。

4 結論

在豬卵母細胞體外成熟的GV期添加0.5 μmol/L chir-124來抑制Chk1的活性，可以促進豬卵母細胞恢復減數分裂，并促進后續的成熟。