殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒斷奶大鼠回腸菌群結(jié)構(gòu)及代謝產(chǎn)物的影響

馮丹，張民揚(yáng)，田時(shí)祎，汪晶

(國(guó)家動(dòng)物消化道營(yíng)養(yǎng)國(guó)際聯(lián)合研究中心，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

動(dòng)物腸道內(nèi)寄居著大量的微生物，這些復(fù)雜而龐大的微生物群落對(duì)宿主的健康起到非常重要的作用[1]，如塑造上皮細(xì)胞[2]，提供能量[3]，預(yù)防病原菌感染[4]以及調(diào)節(jié)免疫[5]等，然而這些過(guò)程可能會(huì)被腸道微生物組成變化所改變。動(dòng)物斷奶時(shí)由于受到應(yīng)激的影響，并且腸道微生物區(qū)系的穩(wěn)態(tài)也尚未形成，因此容易被外源腸道病原菌如大腸桿菌等入侵，引起腸道疾病甚至死亡。研究指出，日糧是影響腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能的重要因素之一[6-7]。因此，通過(guò)日糧策略調(diào)控腸道菌群結(jié)構(gòu)是促進(jìn)宿主健康的一種有效手段。

以殼聚糖和無(wú)機(jī)鋅鹽為原料制備的螯合物殼聚糖螯合鋅(CS-Zn)是本課題組前期研制的一種新型鋅制劑。殼聚糖具有良好的生物相容性和生物降解活性，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、化工、食品等領(lǐng)域[8]。諸多研究表明，不同鋅源降低斷奶仔豬腹瀉可能是通過(guò)調(diào)控腸道微生物菌群豐度和多樣性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。另有研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖螯合鋅減低腸道內(nèi)容物中大腸桿菌、沙門菌數(shù)量，提高了乳酸桿菌的數(shù)量。然而關(guān)于殼聚糖對(duì)炎癥機(jī)體的腸道微生物多樣性和豐度的調(diào)控機(jī)制知之甚少。雖然大腸中細(xì)菌含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于小腸，但小腸是腸道和日糧之間的第一個(gè)接觸點(diǎn)，在進(jìn)入大腸之前許多微生物定植在回腸，并且主要在回腸發(fā)酵[9]。因此，本試驗(yàn)采用16S rRNA高通量技術(shù)手段分析殼聚糖螯合鋅對(duì)回腸菌群結(jié)構(gòu)的影響，探討殼聚糖螯合鋅通過(guò)調(diào)節(jié)腸道菌群對(duì)機(jī)體腸道健康產(chǎn)生有益作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

無(wú)特定病原(SPF)斷奶Sprague-Dawley(SD)大鼠，初始體重(55.65±0.28)g，購(gòu)自南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁育場(chǎng)，正式試驗(yàn)前適應(yīng)3 d。殼聚糖螯合鋅(CS-Zn)，由本課題組前期研制，鋅含量為7.77%。七水合硫酸鋅(ZnSO47H2O)為分析純，鋅含量為22.74%。大腸桿菌O157來(lái)自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院惠贈(zèng)。菌種在液體LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基中搖床220 r/min，37 ℃震蕩培養(yǎng)12 h復(fù)蘇大腸桿菌，取菌液在麥康凱選擇培養(yǎng)基上劃線，并于37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h左右，挑取單個(gè)菌落進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)完成后的大腸桿菌菌液于4 000 r/min 離心10 min，然后將菌液用無(wú)菌PBS重懸至2.5×109CFU/mL，每只大鼠每天灌胃4 mL，每次灌胃2 mL，于4 h內(nèi)全部灌完。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

24只斷奶大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)日糧(AIN-93G，由青龍山動(dòng)物繁育公司提供)；試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)日糧+640 mg/kg殼聚糖螯合鋅(含鋅50 mg/kg)。試驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為14 d，在第10 d，所有大鼠每天灌胃總數(shù)為1010CFU/只大鼠的大腸桿菌菌液，連續(xù)灌胃3 d。飼喂在溫度為22～25℃，相對(duì)濕度為55%～70%的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境中，12 h晝夜循環(huán)(8:00—20:00)循環(huán)，飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物飼料，自由采食和飲水，保持衛(wèi)生環(huán)境。動(dòng)物試驗(yàn)經(jīng)南京農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 樣品采集

試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天，處死實(shí)驗(yàn)大鼠，用手術(shù)刀將大鼠在無(wú)菌狀態(tài)下解剖，分離回腸，將腸段中的內(nèi)容物(微生物)收集到無(wú)菌的凍存管中，并迅速置于液氮中保存，以備后續(xù)分析。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 回腸食糜DNA提取與PCR擴(kuò)增

參考Wang等[10]的方法，按照CTAB法提取回腸食糜總DNA。取0.3 g食糜樣品，加入CTAB破壁細(xì)胞，使用酚-氯仿-異戊醇抽提DNA，再用冰乙醇去除雜質(zhì)，最后加入TE buffer溶解DNA。完成微生物DNA抽提后，將樣品進(jìn)行高通量測(cè)序。以稀釋后的基因組DNA為模板，使用帶Barcode的特異引物(319F:ACTCCTACGGGAGGCAGCA，806R：GGACTACHVGGGTWTCTAAT)對(duì)提取出的回腸食糜微生物DNA的16S rRNA的V3-V4區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，最后，使用Illumina PE250平臺(tái)進(jìn)行Miseq文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)測(cè)序，測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

1.4.2 生物信息學(xué)分析

使用 Cutadapt(V1.9.1,http://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/)[11]減去低質(zhì)量Reads，截去Barcode和引物序列初步質(zhì)控后即可得到原始數(shù)據(jù)(Raw Reads)。將獲得的Raw Reads序列通過(guò)UCHIME Algorithm與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)嵌合體序列，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Reads)。再使用Uparse軟件(V7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)[12]對(duì)所有樣品的Clean Reads按照97%的一致性聚類成OTUs(Operational Taxonomic Units)，隨后進(jìn)行物種注釋。使用Mothur方法與SILVA123(http://www.arb-silva.de/)數(shù)據(jù)庫(kù)在閾值為0.8～1范圍內(nèi)進(jìn)行物種注釋分析，獲得各級(jí)別的分類學(xué)信息。使用R軟件(V3.5.3,https://www.r-project.org/)的R包(vegan)計(jì)算微生物α多樣性Shannon和Simpson指數(shù)。使用vegen包計(jì)算bray-curtis距離矩陣，并基于bray-curtis 距離矩陣，使用ggplot2包繪制主坐標(biāo)分析(PCoA,principal coordinate analysis)圖。門水平和屬水平的差異使用Execl 2016、SPSS 22.0和GraphPad Prism 7.0統(tǒng)計(jì)計(jì)算并作圖。最后，使用R包Tax4Fun基于16S物種豐度預(yù)測(cè)細(xì)菌群落代謝功能，并使用STAMP軟件(V2.1.3,http://kiwi.cs.dal.ca/Software/STAMP)[13]對(duì)KEGG level2水平上的通路進(jìn)行統(tǒng)計(jì)作圖。所有原始序列數(shù)據(jù)均已上傳至NCBI的SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)：PRJNA624221。使用R包Hmisc和corrplot包進(jìn)行皮爾森相關(guān)性分析并作圖。

1.4.3 回腸食糜短鏈脂肪酸和乳酸含量的測(cè)定

使用氣相色譜法測(cè)定回腸食糜短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFAs)的濃度。首先稱取約0.3 g食糜樣品，置于2 mL離心管中，加入1.2 mL雙蒸水，充分混勻后，10 000 r/min離心10 min，取上清0.8 mL于新的離心管中，加入0.16 mL 25%偏磷酸巴豆酸混合溶液，-20 ℃保存過(guò)夜。測(cè)定前解凍，4 ℃，12 000 r/min，離心10 min。吸取上清通過(guò)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾后待測(cè)。參照Wang等[10]的方法設(shè)置氣相色譜條件：毛細(xì)吸管柱(柱長(zhǎng)為30 m，內(nèi)徑為0.32 mm，膜厚為0.25 μm，Sigma-Aldrich，美國(guó))，柱溫135 ℃，進(jìn)樣口溫度200 ℃，采用氫火焰離子檢測(cè)器，檢測(cè)溫度200 ℃，載氣為氫氣，壓力為60 kPa，氧氣壓力為50 kPa。嚴(yán)格按照乳酸試劑盒(南京建成生物工程研究所)說(shuō)明書(shū)對(duì)回腸內(nèi)容物中乳酸的含量進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2016整理計(jì)算，使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件先對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，當(dāng)數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)，進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)；當(dāng)數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布時(shí)，采用兩個(gè)獨(dú)立樣本Mann-Whitney U檢驗(yàn)。用Excel 2016、GraphPadPrism 7和R語(yǔ)言將得到的數(shù)理統(tǒng)計(jì)結(jié)果分別制作成圖表。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸食糜微生物多樣性的影響

由表1得知，對(duì)照組和試驗(yàn)組回腸微生物OTU覆蓋率大于0.99，能夠覆蓋回腸微生物絕大部分的物種，且試驗(yàn)組大鼠Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著的低于對(duì)照組(P<0.05)，表明日糧添加殼聚糖螯合鋅可以顯著降低大腸桿菌攻毒大鼠回腸微生物α多樣性。如圖2所示，即回腸微生物β多樣性結(jié)果，基于OTU水平的PCoA分析結(jié)果顯示試驗(yàn)組與對(duì)照組微生物顯著分開(kāi)。

表1 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸微生物α多樣性的影響

圖1 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸微生物β多樣性的影響

2.2 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸食糜微生物菌群結(jié)構(gòu)的影響

如圖2A所示，根據(jù)各組樣品在門水平的分布顯示回腸微生物優(yōu)勢(shì)菌門為厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門和放線菌門。對(duì)回腸微生物門水平的豐度統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)(圖2B)，試驗(yàn)組大鼠厚壁菌門相對(duì)豐度極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，擬桿菌門、變形菌門和疣微菌門的相對(duì)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。表2所示為回腸食糜微生物屬水平豐度排名前20的菌屬。從圖中可以看出試驗(yàn)組大鼠回腸Romboutsia屬和蘇黎世桿菌屬(Turicibacter)相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，而狹義梭菌屬(Clostridiumsensustricto)和脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

表2 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸微生物屬水平的影響

2.3 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸食糜微生物Tax4Fun基因功能預(yù)測(cè)分析

基于16S的測(cè)序數(shù)據(jù)使用Tax4Fun對(duì)腸道微生物基因的功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)KO編號(hào)和KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)應(yīng)預(yù)測(cè)各層級(jí)代謝通路豐度，圖3即為回腸微生物預(yù)測(cè)在KEGG第二層級(jí)水平上有顯著差異的代謝功能。結(jié)果顯示，在高豐度的代謝功能中，試驗(yàn)組大鼠回腸微生物在“能量代謝”功能上的豐度顯著低于對(duì)照組(P<0.05)，在“膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“外源物質(zhì)生物降級(jí)和代謝”和“其他氨基酸代謝”功能上的豐度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

注：*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)圖2 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸微生物門水平的影響

圖3 回腸食糜微生物在KEGG第二層級(jí)水平上的功能預(yù)測(cè)

2.4 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸食糜微生物代謝產(chǎn)物的影響

對(duì)回腸食糜中短鏈脂肪酸和乳酸的濃度進(jìn)行測(cè)定，如表3所示，試驗(yàn)組丙酸和丁酸的濃度顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，且總短鏈脂肪酸有增加的趨勢(shì)(0.05

表3 殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸食糜短鏈脂肪酸和乳酸濃度的影響

2.5 回腸食糜微生物與代謝產(chǎn)物的相關(guān)性分析

使用皮爾森相關(guān)性分析方法對(duì)回腸食糜微生物和代謝產(chǎn)物的相關(guān)關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4所示，首先對(duì)回腸微生物之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門的豐度與擬桿菌門、變形菌門和疣微菌門的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Romboutsia屬和蘇黎世桿菌屬的豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)。變形菌門的豐度與疣微菌門和脫硫弧菌豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與Romboutsia屬和蘇黎世桿菌屬的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，Romboutsia屬豐度與蘇黎世桿菌屬的豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，狹義梭菌屬于Romboutsia屬和蘇黎世桿菌屬的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。然后對(duì)回腸微生物與代謝產(chǎn)物之間的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，丙酸濃度與厚壁菌門和Romboutsia屬的豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與變形菌門和疣微菌門的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，丁酸濃度與厚壁菌門、Romboutsia屬和蘇黎世桿菌屬的豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，同時(shí)也與變形菌門和疣微菌門的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。同時(shí)，乳酸濃度與厚壁菌門和Romboutsia屬的豐度呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，與變形菌門的豐度呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。

注：藍(lán)色表示正相關(guān)，紅色表示負(fù)相關(guān)，＊表示相關(guān)性顯著圖4 回腸食糜微生物與代謝產(chǎn)物的皮爾森相關(guān)性分析

3 討論

16S rRNA高通量測(cè)序技術(shù)已經(jīng)成為近些年來(lái)腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)研究的主要手段，具有高準(zhǔn)確性、高靈敏度等突出優(yōu)勢(shì)。因此，本試驗(yàn)采用16S rRNA V3-V4區(qū)域基因擴(kuò)增子技術(shù)，在Illumina Miseq測(cè)序平臺(tái)上對(duì)大鼠回腸食糜樣本進(jìn)行高通量測(cè)序，研究殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒斷奶大鼠回腸菌群結(jié)構(gòu)的影響，在門和屬水平找出不同腸段的差異菌，揭示殼聚糖螯合鋅對(duì)攻毒大鼠腸道微生物區(qū)系的影響。

動(dòng)物腸道中復(fù)雜而多樣的微生物共存并處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，它們對(duì)機(jī)體健康具有重要作用。本試驗(yàn)中，回腸微生物Simpson指數(shù)和Shannon指數(shù)結(jié)果顯示，殼聚糖螯合鋅處理后回腸微生物菌群的多樣性顯著降低。Shannon指數(shù)的計(jì)算公式是：H=-∑(Pi)(log2Pi)，Pi表示某種個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)比例。個(gè)體分配越均勻，Shannon指數(shù)就越大。Simpson指數(shù)的計(jì)算公式為：D=1-∑(Ni/N)2，表示隨機(jī)取樣的兩個(gè)個(gè)體屬于同種的概率，樣本越均勻，Simpson指數(shù)的值越大。由此可以推測(cè)日糧添加殼聚糖螯合鋅使得回腸菌群發(fā)生改變。

對(duì)回腸微生物門水平分析發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門和擬桿菌門為優(yōu)勢(shì)菌門，且殼聚糖螯合鋅組厚壁菌門和擬桿菌門變化明顯。研究指出，與人類腸道微生物組成一樣，小鼠體內(nèi)最豐富的兩個(gè)細(xì)菌門是厚壁菌門(60%～80%)和擬桿菌門(20%～40%)[14]。厚壁菌門/擬桿菌門這一比值是一種有效的指示動(dòng)物腸道微生物狀態(tài)的指標(biāo)，尤其是厚壁菌門的變化將直接影響機(jī)體能量攝取和脂肪代謝作用機(jī)制。厚壁菌門和擬桿菌門的豐度與脂肪沉積存在相關(guān)關(guān)系，綜合表現(xiàn)為脂肪沉積高的厚壁菌門/擬桿菌門較高[15]。本試驗(yàn)中，殼聚糖螯合鋅顯著上調(diào)了回腸微生物厚壁菌門的相對(duì)豐度，并有下調(diào)擬桿菌門豐度的趨勢(shì)。Turnbaugh等[16]表示肥胖與厚壁菌門和擬桿菌門的變化有關(guān)，并且他們使用宏基因組和生化分析發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠腸道微生物DNA中富含有一些編碼裂解多糖起始酶的環(huán)境基因標(biāo)記，并且在腸道中發(fā)現(xiàn)丁酸和乙酸等發(fā)酵終產(chǎn)物增加，由此說(shuō)明，高厚壁菌門/擬桿菌門比例會(huì)影響小鼠腸道微生物的代謝潛能，從而使肥胖微生物從日糧中獲得能量的能力增強(qiáng)。以上結(jié)果與本試驗(yàn)有著一致的腸道菌群類型，即高比例的厚壁菌門和低比例的擬桿菌門，說(shuō)明殼聚糖螯合鋅可能通過(guò)改變腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)而影響大腸桿菌攻毒大鼠回腸微生物發(fā)酵能力來(lái)提供機(jī)體能量，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育。另外，回腸殼聚糖螯合鋅試驗(yàn)組變形菌門、放線菌門和疣微菌門相對(duì)豐度都顯著的低于對(duì)照組。變形菌門是革蘭陰性菌的主要菌門，包括多種病原微生物，如大腸桿菌、沙門菌、志賀桿菌等，可能導(dǎo)致某些特性疾病，如炎癥性腸病[17]。放線菌門的范圍很廣，既包括腸道共生菌雙歧桿菌，又包括一些致病菌，如結(jié)核分枝桿菌、鏈霉菌等[18]。而疣微菌門則主要由一些環(huán)境微生物組成。

在屬水平上，添加殼聚糖螯合鋅顯著增加了回腸微生物中Romboutsia屬和蘇黎世桿菌屬的相對(duì)豐度，此外，雖然乳桿菌屬組間差異不顯著，但作為豐度最高的屬，試驗(yàn)組有益菌乳桿菌屬相對(duì)豐度在數(shù)值在遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對(duì)照組。有報(bào)道指出，Romboutsia屬和蘇黎世桿菌屬均表現(xiàn)出益生性，張李榮等[19]研究發(fā)現(xiàn)乳雙歧桿菌可顯著提高Romboutsia屬、乳桿菌屬等有益菌含量；劉佳星等[20]在四神丸對(duì)腹瀉型腸易激綜合征大鼠腸道菌群影響的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，四神丸組蘇黎世桿菌屬和Romboutsia屬豐度顯著增加。而殼聚糖螯合鋅試驗(yàn)組狹義梭菌屬豐度顯著降低可能是由于乳酸桿菌屬、Romboutsia屬和蘇黎世菌屬所占比例很高，導(dǎo)致其他屬于厚壁菌門的菌屬所占比例相對(duì)減少所致。另外，變形菌門主要變化菌屬脫硫弧菌屬在添加殼聚糖螯合鋅的試驗(yàn)組中極顯著的降低了。脫硫弧菌屬是腸道菌群中主要的硫酸鹽還原菌(SRB)，有報(bào)道指出硫酸鹽還原菌在厭氧呼吸過(guò)程中將硫酸鹽還原為硫化氫，干擾上皮細(xì)胞氧化代謝，可能導(dǎo)致上皮細(xì)胞損傷死亡以及黏膜炎癥[21-22]。Rowan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸脫硫弧菌豐度顯著增加。綜上所述，日糧補(bǔ)充殼聚糖螯合鋅對(duì)大腸桿菌攻毒大鼠回腸微生物菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，增加了厚壁菌門/擬桿菌門的比值以及有益菌Romboutsia屬、蘇黎世菌屬的相對(duì)豐度，同時(shí)降低了促炎菌脫硫弧菌屬的相對(duì)豐度。

TaxFun4是一個(gè)基于16S rRNA數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)微生物群落功能的軟件包，研究指出，TaxFun4預(yù)測(cè)結(jié)果很好地近似于全基因組鳥(niǎo)槍法測(cè)序方法得到的功能分析[24]。通過(guò)對(duì)功能基因的預(yù)測(cè)和相關(guān)途徑的分析，可能發(fā)現(xiàn)能夠降解有毒有害代謝物的新基因或新的酶，從而幫助宿主抵抗病原體入侵。本研究結(jié)果顯示，回腸中添加殼聚糖螯合鋅，回腸微生物在“膜轉(zhuǎn)運(yùn)”、“外源物質(zhì)生物降級(jí)和代謝”和“其他氨基酸代謝”等功能上的富集增加，在“能量代謝”功能上的富集降低，此結(jié)果與Li等[25]的研究結(jié)果一致，當(dāng)發(fā)生腹瀉時(shí)，機(jī)體的代謝過(guò)程發(fā)生了變化，包括“碳水化合物代謝”富集降低，“氨基酸代謝”、“能量代謝”的富集水平增加。

微生物發(fā)酵可以產(chǎn)生一系列的代謝產(chǎn)物，如乙酸、丙酸、丁酸等，這些產(chǎn)物的濃度可以作為衡量腸道內(nèi)微生物活性和腸道健康的標(biāo)志[26]。一方面，短鏈脂肪酸為腸黏膜提供能量，另一方面，腸道內(nèi)短鏈脂肪酸可以降低腸道內(nèi)pH值，營(yíng)造了一個(gè)不適合有害菌如大腸桿菌等生長(zhǎng)的酸性環(huán)境，進(jìn)而抑制有害菌的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，添加殼聚糖螯合鋅使得回腸丙酸、丁酸濃度顯著增加，并且總短鏈脂肪酸濃度有增加的趨勢(shì)。Tedelind等[27]發(fā)現(xiàn)短鏈脂肪酸尤其是丁酸可以通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的TNF-α激活NF-κB來(lái)發(fā)揮抗炎作用。另有研究表明，高水平的短鏈脂肪酸可以抑制某些病原菌的生長(zhǎng)，比如沙門菌、大腸桿菌等[28]。皮爾森相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)丙酸和丁酸的濃度與Romboutsia屬和蘇黎世菌屬豐度呈顯著正相關(guān)，因此短鏈脂肪酸的增加可能是由于產(chǎn)酸菌Romboutsia屬和蘇黎世菌屬豐度的增加所引起的。另外，殼聚糖螯合鋅處理還增加了乳酸的濃度，乳酸鹽是小腸內(nèi)重要的細(xì)菌發(fā)酵產(chǎn)物，能降低小腸內(nèi)的pH值，抑制病原菌的活性。研究指出乳酸并不會(huì)在腸道中積累，通常會(huì)被不同的乳酸利用菌代謝成乙酸、丙酸和丁酸[29]。并且，相關(guān)性分析也同樣指出乳酸的濃度與Romboutsia屬和蘇黎世菌屬豐度呈顯著正相關(guān)。總之，日糧添加殼聚糖螯合鋅通過(guò)增加產(chǎn)酸菌的相對(duì)豐度來(lái)增加腸道內(nèi)短鏈脂肪酸和乳酸濃度從而有助于維持大腸桿菌攻毒大鼠的腸道健康。

4 結(jié)論

殼聚糖螯合鋅通過(guò)上調(diào)有益菌Romboutsia屬和蘇黎世菌屬的相對(duì)豐度，同時(shí)下調(diào)促炎菌脫硫弧菌的豐度，調(diào)節(jié)大腸桿菌攻毒大鼠回腸微生物菌群，使得微生物代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸和乳酸的濃度增加，有利于維持腸道健康。