豬瘟病毒E2蛋白單克隆抗體的制備及阻斷ELISA抗體檢測方法的建立

趙少若,郝麗影,王同燕,賀筍,鄭丁丁,李俊輝,白晨雨,王遵寶,宋歡歡,鄧均華*,田克恭,*

(1.洛陽普泰生物技術有限公司，河南 洛陽 471000；2.國家獸用藥品工程技術研究中心，河南 洛陽 471000；3.普萊柯生物工程股份有限公司，河南 洛陽 471000；4.天康生物股份有限公司，新疆 烏魯木齊 830032)

豬瘟(classical swine fever，CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)引起豬的高度接觸性、致死性傳染病。該病以發病急、持續高熱、全身出血和白細胞減少為特征，對我國養豬業的危害極其嚴重，造成了巨大的經濟損失。CSFV 屬于黃病毒科(Flaviviridae)瘟病毒屬(Pestivirus)[1]，該屬成員還包括牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)和邊界病毒(border disease virus，BDV)。CSFV與BVDV的氨基酸序列同源性在85%以上，存在抗原交叉性和血清學交叉反應，豬感染BVDV可出現類似于豬瘟的臨床癥狀和病理變化。豬瘟疫苗在生產過程中易受BVDV污染，導致病毒含量和疫苗效力嚴重下降，使免疫后的豬群產生大量針對BVDV的抗體,對豬瘟疫苗免疫后抗體水平監測造成影響，且BVDV污染的豬瘟疫苗免疫后可使豬群感染BVDV，給豬瘟的防控帶來極大的安全隱患和不確定因素[2-3]。CSFV是單股正鏈RNA病毒，包括4種結構蛋白(C、Erns、E1、E2)和8種非結構蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)[4]。其中，E2蛋白是主要的免疫原性蛋白，也是建立CSFV血清學檢測方法的首選抗原，參與病毒感染過程以及誘導機體產生中和抗體[5]。它由ORF編碼的690(Arg)至1060(Leu)之間的370個氨基酸組成，靠近E2蛋白N端上游有一段信號肽序列，在其C端有一段跨膜區[6]。以CSFV E2蛋白作為免疫原制備的單克隆抗體具有病毒中和能力，及高度的特異性和敏感性，能夠識別病原結構的微小差異，且已有研究證明E2蛋白上存在可以區分BVDV和CSFV的抗原表位，因此CSFV E2在血清學診斷方法中具有重要的應用價值。

疫苗免疫是豬瘟防控的重要手段，特別是我國研制的豬瘟兔化弱毒疫苗對我國及全世界的豬瘟防控發揮了重要作用[7]。豬瘟抗體檢測是評價疫苗免疫效果和制定疫苗免疫程序的依據，OIE推薦的方法有過氧化物酶聯中和試驗(NPLA)、熒光抗體病毒中和試驗(FAVN)、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。NPLA和FAVN需要培養病毒、耗時耗力且不能實現大量樣品的快速檢測，并且存在生物安全風險，而ELISA方法以其快速、簡便且能實現高通量檢測被廣泛應用。豬瘟病毒難純化，使用重組CSFV E2蛋白作為ELISA試劑盒的包被抗原，不僅能大量生產，而且生物安全風險又小[8]。目前，用原核系統表達的CSFV E2蛋白多以包涵體形式存在，且缺少糖基化修飾[9-10]。而用桿狀病毒表達系統表達的重組E2蛋白，不僅可分泌表達，而且表達的蛋白也可進行糖基化修飾[11-12]。本研究通過桿狀病毒表達系統表達CSFV不含跨膜區的E2蛋白，經純化后免疫BALB/c小鼠制備單克隆抗體，研究證明1株單克隆抗體可用作診斷試劑。因此，將重組E2蛋白作為包被抗原，以HRP標記的單克隆抗體作為酶標試劑，建立了豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法，為豬瘟疫苗免疫效果評價和CSFV和BVDV的鑒別診斷提供了重要的技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

CSFV C株、CSFV陽性血清、CSFV抗原板由洛陽普泰生物技術有限公司提供；4～6周齡和6～8周齡的SPF BALB/c小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；Bac-to-Bac?HBM TOPO?Secreted Expression System試劑盒、sf9昆蟲細胞購自上海Invitrogen公司；質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；His親和層析柱購自美國GE公司；HRP標記鼠抗His單克隆抗體購自MBL公司；HRP標記的羊抗豬IgG、HRP標記的羊抗鼠IgG購于Sigma公司；DAB顯色試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。

1.2 重組E2蛋白的表達、鑒定及純化

參考豬瘟病毒C株(GenBank登錄號AF531433)基因組序列，選擇E2蛋白去除上游信號肽及下游跨膜區的序列，在蛋白末端添加His標簽。將本公司已構建好的重組質粒Bacmid-E2轉染sf9細胞，待80%細胞病變后收集上清作為P1代重組桿狀病毒rBac-E2。將P1代rBac-E2感染sf9細胞，用CSFV陽性血清進行間接免疫熒光試驗(IFA)鑒定。然后將rBac-E2感染sf9細胞擴大培養，分別收獲感染上清和細胞沉淀，通過SDS-PAGE和Western blot鑒定E2蛋白分泌情況。將獲得的重組E2蛋白按His親和層析柱試劑盒說明書進行純化，用BCA試劑盒測定其濃度后，分裝后于-80℃保存備用。

1.3 動物免疫及間接ELISA方法的建立

將純化的CSFV E2蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化混勻，背部皮下多點免疫BALB/c小鼠，100 μg/只。免疫間隔為2周，二免和三免使用弗氏不完全佐劑。三免后7 d采血，采用間接ELISA方法檢測血清抗體效價，將純化的CSFV E2蛋白稀釋至0.5 μg/mL包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃孵育16～24 h，洗板后加入封閉液，150 μL/孔，4 ℃封閉16～24 h。洗板后加入稀釋后的待檢血清，同時設置陰、陽性對照，37 ℃孵育1 h。洗板后加入1∶10 000稀釋的HRP標記的羊抗鼠IgG，37 ℃孵育30 min。洗板后分別加入顯色劑A、B液，37 ℃顯色15 min，用2 mol/L H2SO4終止反應，50 μL/孔。陰性對照OD450<0.2時，試驗成立，S/N (待檢樣品OD450/陰性對照OD450)≥2.1時，判為陽性；S/N<2.1時，判為陰性，待檢樣品的效價為陽性孔對應的樣品最高稀釋度。

1.4 細胞融合及篩選

選取三免后血清效價最高的小鼠進行沖擊免，3 d后按照常規方法進行細胞融合。采用1.3建立的間接ELISA方法對雜交瘤細胞進行篩選，經過3次篩選及亞克隆后，獲得穩定分泌特異性McAb的陽性雜交瘤細胞株。

1.5 CSFV陽性血清阻斷試驗

用純化的CSFV E2蛋白包被酶標板，封閉過夜，加入陽性雜交瘤細胞上清，同時設置陰、陽性對照及空白對照，37 ℃孵育1 h，洗板后加入CSFV陽性血清，37 ℃孵育1 h，洗板后加入HRP標記的羊抗豬IgG，37 ℃孵育30 min，最后進行顯色和終止反應，酶標儀讀數并計算阻斷率。

1.6 McAb識別抗原表位的鑒定

根據已報道的CSFV E2蛋白抗原表位[13]，選擇了1個能區別CSFV和BVDV的線性表位序列TAVSPTTLR，構建重組GST表位多肽。以pGEX-6P-1空質粒為模板，設計引物引入表位序列及酶切位點NcoⅠ/XhoⅠ，PCR擴增出重組表位多肽序列。將其克隆于表達載體pET-28a構建重組質粒，轉化至BL21，經IPTG誘導表達后，超聲裂解破碎。將重組表位多肽的菌體裂解液進行SDS-PAGE，轉印至硝酸纖維素膜上，5%脫脂乳4 ℃封閉過夜，加入陽性雜交瘤細胞上清，室溫孵育1 h，以HRP標記的羊抗鼠IgG為二抗，用DAB顯色液進行顯色。

1.7 McAb的制備、純化與標記

取6～8周齡雌性BALB/c小鼠，腹腔注射液體石蠟，0.5 mL/只，1周后腹腔注射陽性雜交瘤細胞，15萬個/只。7～10 d后采集腹水，10 000 r/min離心5 min，上清即為單克隆抗體。將單克隆抗體用辛酸-飽和硫酸銨沉淀法和DE-52離子交換層析法[14]純化后，再用改良過碘酸鈉法[15]進行HRP標記。

1.8 阻斷ELISA方法的建立及最佳工作濃度的確定

1.8.1 阻斷ELISA方法的建立

將重組CSFV E2蛋白用PBS稀釋至一定濃度包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃包被16～24 h。洗滌液洗滌3次，用含20%小牛血清的PBS在37 ℃下封閉2 h，200 μL/孔。洗滌液洗滌3次，每孔加入樣品稀釋液50μL，空白孔除外。將樣品、陽性對照、陰性對照加入酶標板，50 μL/孔，37 ℃反應30 min。洗滌液洗滌5次，HRP標記的單克隆抗體按一定比例稀釋后加入，100 μL/孔，空白孔除外，37 ℃反應30 min。洗滌液洗滌5次，加入顯色液避光顯色15 min。最后加入2 mol/L硫酸終止反應，酶標儀450 nm波長測定吸光值。

1.8.2 最佳工作濃度的確定

將純化的重組CSFV E2蛋白在橫排倍比稀釋：1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1 600，1∶3 200，1∶6 400，1∶12 800，酶標單抗在縱排做倍比稀釋：1∶1 000，1∶2 000，1∶4 000，1∶8 000，1∶16 000，1∶32 000，用棋盤法確定最佳工作濃度。

1.9 阻斷ELISA方法臨界值的確定

用1.8建立的阻斷ELISA方法檢測250份CSFV抗體陽性血清和250份CSFV抗體陰性血清，根據統計學原理，確認該方法的cut-off值。

1.10 阻斷 ELISA方法的評價

1.10.1 特異性試驗

用建立的阻斷ELISA方法對11份特異性樣品進行檢測，包括BVDV抗體陽性血清、偽狂犬病病毒(PRV)抗體陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)抗體陽性血清、豬細小病毒(PPV)抗體陽性血清、豬圓環病毒2型(PCV-2)抗體陽性血清及6份CSFV抗體陰性血清。

1.10.2 敏感性試驗

將免疫過氧化物酶單層細胞試驗(IPMA)效價為1∶12 800的CSFV抗體陽性血清進行一系列稀釋，用建立的阻斷ELISA方法測定其各稀釋度的血清效價。

1.10.3 重復性試驗

按建立的阻斷ELISA方法，分別進行批內和批間重復性試驗：在同一批次的酶標板中，隨機取出1塊，檢測5份CSFV陽性血清和1份CSFV陰性血清，每份樣品設置5個復孔；另外，取5塊不同批次的酶標板，檢測5份CSFV陽性血清和1份CSFV陰性血清，每份樣品設置3個復孔。取A值計算每份樣品的算術平均值(X)和標準偏差(SD)，求得變異系數SD/X。

1.10.4 應用

用建立的阻斷ELISA方法，對已知背景的豬瘟活疫苗免疫豬的系列血清進行檢測。

2 結果

2.1 CSFV E2蛋白的表達

重組質粒Bacmid-E2轉染sf9細胞，27 ℃培養72 h后，可見細胞出現明顯病變，體積增大、細胞內顆粒增多甚至破裂、未形成致密的細胞單層，而正常細胞為大小均一、折光性良好、輪廓清晰、并形成致密的單層細胞。收獲感染的sf9細胞上清，即重組桿狀病毒，命名為CSFV-E2株。將接種重組桿狀病毒的sf9細胞和接種野生型桿狀病毒的sf9細胞用冷丙酮固定后，加入CSFV陽性血清進行IFA特異性鑒定，結果接種重組桿狀病毒的細胞孔可見明顯的綠色熒光(圖1A)，野毒感染的細胞對照孔無綠色熒光(圖1B)，表明重組CSFV E2蛋白表達成功。

A.感染重組桿狀病毒的sf9細胞；B.野毒感染的sf9細胞圖1 重組桿狀病毒CSFV-E2株接種Sf9細胞IFA鑒定結果

2.2 CSFV E2蛋白的鑒定及純化

將CSFV E2重組桿狀病毒感染后的sf9細胞上清和細胞沉淀分別進行SDS-PAGE及Western blot鑒定。經HRP標記的鼠抗His單克隆抗體孵育，顯色后在sf9細胞上清和細胞裂解后的沉淀中約48 kDa處出現目的條帶(圖2)。富集細胞上清中的目的蛋白，經不同濃度的咪唑Tris-NaCl(pH值8.0)緩沖液洗脫后電泳(圖3)，結果顯示當咪唑的濃度為300 mmol/L時，純化效果最好。

M.蛋白質相對分子質量標準;1.重組桿狀病毒CSFV-E2株感染后的sf9細胞上清;2.重組桿狀病毒CSFV-E2株感染后的sf9細胞裂解液上清;3.重組桿狀病毒CSFV-E2株感染后的sf9細胞裂解液沉淀;4.sf9正常細胞圖2 抗His單抗Western blot鑒定重組E2蛋白

1～5.洗脫蛋白的咪唑(pH8.8)濃度為20 mmol/L,30 mmol/L,300 mmol/L,600 mmol/L和1 mol/L;M.蛋白質相對分子質量標準圖3 重組E2蛋白經不同濃度咪唑洗脫后的SDS-PAGE

2.3 雜交瘤細胞的制備

細胞融合后經過3次亞克隆篩選出了45株能夠穩定分泌抗CSFV E2蛋白單克隆抗體的雜交瘤細胞。取細胞上清進行CSFV陽性血清阻斷試驗，結果顯示4株McAbs具有較高的阻斷活性，均不低于85%。

2.4 McAb識別的抗原表位鑒定

將重組表位多肽經原核表達后進行SDS-PAGE，目的條帶在28 kDa左右。分別與4株具有較高阻斷活性的McAbs 進行Western blot鑒定，結果只有15A9能特異性識別表位多肽，且與對照不反應(圖4)，表明15A9識別的表位為能夠區分CSFV和BVDV的表位TAVSPTTLR。

M.蛋白質相對分子質量標準;1.對照蛋白;2.重組表位多肽圖4 McAb 15A9識別抗原表位的Western blot鑒定結果

2.5 McAb的制備、純化與標記

選擇陽性雜交瘤細胞15A9，利用BALB/c小鼠制備了腹水，經辛酸-飽和硫酸銨沉淀法和DE-52離子交換層析法進行純化，并通過改良過碘酸鈉法進行HRP標記，獲得了HRP標記的單克隆抗體。

2.6 阻斷ELISA方法的建立

根據棋盤滴定法的結果，確定重組CSFV E2蛋白的包被濃度為2.5 μg/mL，HRP標記的抗體稀釋度為1∶8 000。

2.7 阻斷ELISA方法臨界值的確定

用建立的豬瘟病毒阻斷ELISA抗體檢測方法檢測250份CSFV陽性血清和250份CSFV陰性血清，CSFV陽性血清和陰性血清的阻斷率均呈正態分布。以單側94%的可信度計算本方法的cut-off值，其中陰性血清阻斷率平均值為18%，標準差為0.062，其阻斷率臨界值為30.4%；陽性血清阻斷率平均值為63%，標準差為0.117，其阻斷率臨界值為39.6%。據此，將阻斷ELISA方法的cut-off定為：樣品阻斷率≥40%者為CSFV抗體陽性，樣品阻斷率≤30%者為CSFV抗體陰性，樣品阻斷率在30%～40%之間，判為可疑。

2.8 阻斷ELISA方法的評價

2.8.1 特異性試驗

用建立的阻斷ELISA方法檢測11份特異性樣品，結果均為陰性(表1)，說明建立的檢測方法特異性良好。

表1 特異性試驗檢測結果

2.8.2 敏感性試驗

將IPMA效價為1∶12 800的CSFV陽性血清進行梯度稀釋，稀釋后對應的IPMA效價依次為：1∶6 400，1∶3 200，1∶1 600，1∶800，1∶400，1∶200。當豬瘟抗體IPMA效價為1∶800時，檢測結果仍為陽性；當IPMA效價為1∶400和1∶200時，檢測結果為陰性(表2)。

表2 敏感性試驗檢測結果

2.8.3 重復性試驗

阻斷ELISA方法重復性試驗結果顯示，批內重復性試驗變異系數為2.13%～7.56%，批間重復性試驗的變異系數為2.87%～8.49%，均低于10%(表3)，說明該方法的可重復性良好。

表3 批內重復性試驗和批間重復性試驗結果(OD450)

2.8.4 應用

用自建的阻斷ELISA方法檢測豬瘟疫苗免疫后0～70 d血清中豬瘟抗體水平，結果顯示，最早檢出時間為免疫后14 d(圖5)。

圖5 豬瘟疫苗免疫后ELISA抗體檢測結果

3 討論

豬瘟病毒E2蛋白為位于病毒粒子表面的囊膜糖蛋白，含有4個相對獨立的抗原區域(A、B、C、D)，其中位于N端的A、B、C是產生中和抗體的主要區域，含有5個潛在的糖基化位點，而缺少糖基化修飾的E2蛋白不能誘導機體產生中和抗體[17-18]。雖然非糖基化和糖基化的重組CSFV E2蛋白均能和豬瘟病毒抗體反應，但后者結合豬瘟抗體的能力優于前者[18-20]。本研究表達的CSFV E2蛋白的目的分子量為43 kDa，經糖基化修飾后，其分子量大小為48 kDa左右。CSFV E2蛋白的C端有疏水的跨膜區(TMR)，表達含跨膜區的CSFV E2蛋白，雖然可獲得與CSFV E2蛋白相同大小的片段，但均為胞內不溶性表達，而表達不含跨膜區的豬瘟病毒E2蛋白，可獲得分泌表達的重組蛋白[10,21-22]。本研究選擇用含蜂素肽信號肽的桿狀病毒載體表達不含跨膜區的豬瘟病毒E2蛋白，雖然有部分CSFV E2蛋白分泌到細胞外，但大部分仍在細胞內，未能有效分泌到細胞外。雖然還不清楚重組豬瘟E2蛋白不能有效分泌到細胞外的原因，但我們分析可能和重組CSFV E2蛋白在細胞內空間折疊有關。將表達重組CSFV E2蛋白的桿狀病毒接種sf9細胞的培養物電泳，在細胞裂解液沉淀中除48 kDa目的條帶外，還出現35～48 kDa條帶，相同情況在其它研究中也有報道，推測可能為重組蛋白在C端發生斷裂[10,18]。同時，為檢測重組桿狀病毒CSFV-E2株接種sf9細胞培養上清存在形式，將經親和層析純化的重組CSFV E2蛋白進行分子篩進一步純化，收集不同峰后進行變性和非變性電泳，結果顯示純化蛋白除單體外，二聚體和多聚體亦存在。

目前對于豬瘟的防治主要依賴于疫苗免疫，ELISA方法以其簡便、檢測樣本量大等優點，多用于疫苗免疫效果的評價。國內研制的間接ELSIA豬瘟抗體檢測的方法雖然靈敏性較好，但不易有效鑒別黃病毒科瘟病毒屬的其他病毒產生的抗體，且包被的抗原一般為原核表達的E2蛋白，缺少糖基化修飾，與天然構像區別較大，可能會影響反應原性。而國外進口試劑盒價格昂貴，所以開發擁有自主知識產權的產品意義重大。本研究利用E2蛋白制備的McAb 15A9具有阻斷活性，識別的表位是能區分CSFV和BVDV的線性表位TAVSPTTLR，且在CSFV不同毒株中高度保守。將重組CSFV E2蛋白作為包被抗原，HRP標記的15A9作為酶標試劑，建立了可以區分CSFV和BVDV的阻斷ELISA抗體檢測方法，該方法可進行大批量樣品檢測，且快速、簡便，可以用于豬瘟疫苗免疫后豬群抗體的檢測，并且可以實現疫苗BVDV污染的鑒別檢測。另外，用本方法檢測免疫后不同時間豬血清中抗體，最早檢出時間為免疫后14 d，免疫后21 d全部轉為陽性。本方法檢測豬瘟疫苗免疫后抗體轉陽時間同Colijn等[23]報道相似，最早檢出時間同中和試驗相當。有報道稱豬瘟疫苗C株免疫后14 d，中和試驗檢測為陽性[24]，因此可用于疫苗免疫后抗體的檢測。

綜上，本研究利用桿狀病毒表達的重組CSFV E2蛋白，制備了作為于診斷試劑的單克隆抗體，建立了能特異性鑒別CSFV和BVDV的阻斷ELISA抗體檢測方法，為豬瘟疫苗免疫后抗體的檢測及豬瘟疫苗中BVDV污染的鑒別檢測提供了重要的技術保障。