奶牛乳房炎致病菌多重Taq-Man熒光PCR檢測方法的建立

張莉莉，丁慧妍，魏瑞成，龐茂達，何濤，包紅朵，王冉

(江蘇省農業科學院，江蘇 南京 210014)

奶牛乳房炎通常是指奶牛乳腺組織受到微生物感染、機械損傷、熱損傷和化學物品刺激而引起的一種炎性病變，是奶牛養殖業中最常見的感染性疾病之一，給奶牛養殖業帶來重大的經濟損失[1]。研究表明引起奶牛乳房炎的病原微生物多達150多種，但臨床上常見的病原菌則以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和鏈球菌為主，三者占總致病菌的80%～90%[2-4]。病原菌的感染不但會引起產奶量和乳品質量下降，而且會造成食品安全隱患，甚至危害人體健康[5]。我國臨床型乳房炎發病率在9.7%～55.6%，而隱性乳房炎發病率卻高達 61.03% ～79.62%[6]。隱性乳房炎由于已感染卻沒有明顯的臨床癥狀，加大了預防和控制的難度。因此，如何對奶牛乳房炎的進行早期診斷，并采取有效的措施，就成了畜牧和食品安全行業關注的重點，對病原體的快速、特異性檢測提出了迫切的要求。

Taq-Man實時熒光定量PCR檢測方法，克服了傳統PCR耗時長、易污染和擴增后還需電泳等缺點，具有快速、敏感和特異性高等優點，已成為各種病原微生物(如非洲豬瘟病毒、埃博拉病毒、中東呼吸道綜合征冠狀病毒)核酸定量檢測的重要方法[7-9]。本研究建立了奶牛乳房炎3種主要致病菌的熒光定量PCR檢測方法，具有較好的特異性、敏感性和重復性，可完成大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的同時檢測，實現了一管多檢，提高了奶牛乳房炎的診斷效率和治愈率，從而及時有效控制病原菌傳播，對奶牛乳房炎的臨床監測、防控及診治具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

大腸桿菌、金黃色葡萄球、無乳鏈球菌、腸炎沙門菌、肺炎克雷伯菌和鮑曼不動桿菌菌株均由本實驗室從奶牛乳房炎樣品中分離、測序鑒定和保存。

1.2 主要試劑及儀器

細菌基因組DNA提取試劑盒購自Omega Bio-Tek公司；2×Premix Ex Taq (Probe qPCR)、RNase-free water和pMDTM18-T 載體克隆試劑盒購自寶生物工程有限公司；SanPrep柱式質粒DNA小量抽提試劑盒和DH5ɑ 感受態細胞購自生工生物工程(上海)股份有限公司；LightCycler?480實時熒光定量PCR儀購自羅氏診斷產品(上海)有限公司。

1.3 引物與探針設計

參考大腸桿菌(GenBank:CP017061.1)、金黃色葡萄球菌(GenBank:CP047021.1)和無乳鏈球菌(GenBank:CP053027.1)，使用MEGA5.0軟件進行序列比對，在16S rRNA與23S rRNA之間的高度保守區域，采用Beacon Designer 7.0進行引物和Taq-Man探針的設計，由擎科引物公司合成，引物和探針序列見表1。

表1 實時熒光PCR擴增引物和探針

1.4 陽性質粒的制備

分別根據GenBank中大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌的標準參考序列，人工合成相應基因的模板序列，與T載體連接，轉化感受態細胞并提取重組質粒，分別構建3種含有目的基因的重組質粒，并經PCR和序列分析驗證。

1.5 細菌DNA的提取

將保存的細菌接種于TSB液體培養基中，37 ℃，180 r/min振蕩培養12～16 h。根據Omega Bio-Tek公司的細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌DNA。DNA提取完成后于-20 ℃下保存備用。

1.6 Taq-Man熒光定量PCR擴增

以3種致病菌所提取的基因組DNA為模板，并與其相對應的引物分別進行單重熒光定量PCR擴增，RNase-free ddH2O作為陰性對照。反應體系：2×Premix ExTaq(probe qPCR)10 μL，上下游引物及探針終濃度均為0.1 μmol/L，模板DNA 2 μL，RNase-free ddH2O 7.5 μL，總體系為20 μL。反應程序：95 ℃預變性30 s，1個循環；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s(收集熒光信號)，40個循環；50 ℃ 30 s，1個循環。結果判定采用軟件中的閾值時間(Threhold time)方法。

1.7 多重Taq-Man熒光定量PCR體系的優化

以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌3種菌所提取的基因組DNA模板作為多重PCR反應模板，比較單重PCR結果，再對多重熒光定量PCR的引物濃度以及探針濃度進行優化，最終篩選出最優反應條件。

1.8 多重Taq-Man熒光定量PCR特異性試驗

利用已優化的PCR反應體系，以大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌、腸炎沙門菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌的基因組DNA作為模板，檢驗反應體系的特異性。

1.9 多重Taq-Man熒光定量PCR敏感性試驗和標準曲線的建立

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌3種菌的重組質粒分別用RNase-free ddH2O稀釋至109～102拷貝數/μL，將各個稀釋度的DNA按照1.7優化的反應條件完成多重Taq-Man熒光定量PCR。以重組質粒拷貝數濃度的對數值作為橫坐標，并以PCR反應的Ct值為縱坐標作圖，進而繪制相對定量的標準曲線。

1.10 多重Taq-Man熒光定量PCR重復性試驗

按照1.7優化的PCR反應體系，以濃度為109～102拷貝數/μL的重組質粒為模板，每個濃度設置3個平行樣，計算3個平行樣之間Ct值的變異系數(CV%)，以此評價該方法的重復性。

1.11 臨床樣品檢測

對江蘇省某養牛場提供的24份臨床奶樣，按照已建立的多重Taq-Man實時熒光定量PCR進行檢測。

2 結果

2.1 多重Taq-Man熒光定量PCR體系建立及優化

大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的單重熒光PCR擴增效果良好，均擴增出明顯對數增長期的S型曲線，肺炎克雷伯菌作為陰性對照、RNase-ddH2O water和提取空白產物作為空白對照菌，均大于判斷標準，判斷為陰性。

通過固定大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、無乳鏈球菌3種菌的基因組DNA模板濃度，對多重PCR反應體系的引物濃度、探針濃度進行優化。最終確定最優PCR反應體系為：2×Premix ExTaq(Probe qPCR) 10 μL，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌引物終濃度分別為0.2、0.15和0.25 μmol/L，探針終濃度分別為0.3、0.35和0.3 μmol/L，DNA模板2 μL，RNase-free ddH2O補足20 μL。采用以下擴增循環反應條件:95 ℃預變性30 s，1個循環；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s(收集熒光信號)，40個循環；50 ℃ 30 s，1個循環。

若待檢測樣品無熒光擴增曲線或Ct值大于30，則判定樣品未檢出奶牛乳房炎。若待檢測樣品有熒光擴增曲線，且Ct值應小于等于30時，則判斷樣品中檢出奶牛乳房炎。

2.2 多重Taq-Man熒光定量PCR特異性試驗

多重Taq-Man熒光定量PCR方法的特異性的結果如表2所示。靶細菌顯示良好的PCR擴增信號，表現為陽性結果；非靶細菌Ct值大于30，表現為陰性結果。該試驗表明，本試驗所采用的引物及探針對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌具有良好的特異性，對其他非靶細菌有很好的排他性。

表2 多重Taq-Man實時熒光PCR中的引物及探針的菌株特異性分析

2.3 多重Taq-Man熒光定量PCR敏感性試驗和標準曲線的建立

將制備的重組陽性質粒DNA稀釋至109～102拷貝數/μL，將各個稀釋度的DNA按照2.1中已優化的反應體系及條件完成熒光PCR。多重Taq-Man熒光定量PCR反應體系對大腸桿菌的檢出濃度為103拷貝數/μL，金黃色葡萄球菌為102拷貝數/μL，無乳鏈球菌為104拷貝數/μL。以重組質粒模板DNA拷貝數濃度的對數值作為橫坐標，以PCR反應的Ct值為縱坐標作圖，繪制相對定量的標準曲線(圖1)。大腸桿菌熒光PCR反應的相關系數(R2)為0.999，金黃色葡萄球菌熒光PCR反應的相關系數(R2)為0.991，無乳鏈球菌熒光PCR反應的相關系數(R2)為0.999，證明DNA拷貝數濃度的對數值與Ct值之間具有良好的線性關系。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的擴增效率分別為106.27%、107.77%和99.25%。

A.大腸桿菌；B.金黃色葡萄球菌；C.無乳鏈球菌;1～8.109 拷貝數/μL～102 拷貝數/μL模板濃度圖1 3種菌熒光定量PCR擴增曲線及標準曲線

2.4 多重Taq-Man熒光定量PCR重復性檢驗

所建立的多重Taq-Man熒光定量PCR反應體系檢測重組陽性質粒各個拷貝數濃度的變異系數均低于5% (表3)，表明體系的重復性較好。

表3 3種菌熒光定量PCR重復性結果

2.5 臨床樣品的檢測

多重Taq-Man實時熒光PCR對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的陽性率分別為58.3%(14/24)、33.3%(8/24)和33.3%(8/24)。其中，金黃色葡萄球菌與無乳鏈球菌混合感染檢出率為12.5%(3/24)，金黃色葡萄球菌與大腸桿菌混合感染檢出率為25%(6/24)，大腸桿菌與無乳鏈球菌的混合感染檢出率為16.7%(4/24)，3種細菌混合感染檢出率為4.1%(1/24)。

3 討論

近年，我國奶牛乳房炎的發病率呈上升趨勢，但其臨床診斷方法主要基于加州乳房炎檢測法(CMT)和4%氫氧化鈉凝乳試驗法，并不能追蹤病原。病原菌的分離鑒定不但操作繁雜，還耗時較長，進而錯過最佳治療時間，造成更大經濟損失。因此，建立一種簡單、快速、有效的診斷方法，對于加強奶牛乳房炎的早期診斷和提高治愈率具有重要意義。奶牛乳房炎致病菌較多，湖南省、河北省及陜西省等地的奶牛乳房炎奶樣病原菌分離結果表明，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及無乳鏈球菌檢出率最高[10-12]。其中湖南省大腸桿菌陽性檢出率為18.18%，金黃色葡萄球菌陽性檢出率為47.72%，無乳鏈球菌陽性檢出率為13.64%[10]；河北省大腸桿菌陽性檢出率為23%，金黃色葡萄球菌陽性檢出率為46%，無乳鏈球菌陽性檢出率為25.97%，且多數感染均為兩種或兩種以上細菌的混合感染[11]。以上數據表明大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌是奶牛乳房炎的主要致病原，適合建立多重Taq-Man實時熒光PCR檢測體系。與普通PCR相比，Taq-Man實時熒光PCR具有更為顯著的優點，如特異性強、敏感性高和重復性好，且快速簡便，在病原微生物的檢測方面已經廣泛應用[13-15]。本試驗對于送檢的24份奶樣進行多重Taq-Man實時熒光PCR檢測，結果表明大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和無乳鏈球菌的陽性率分別為58.3%、33.3%和33.3%，同時，均存在多種病原的混合感染。傳統的檢測方法(體細胞計數法)僅能判斷是否為奶牛乳房炎，而不能檢測出何種病原感染，且不適合初乳期和泌乳后期，對檢測結果有較強的主觀性。本研究建立的大腸桿菌、無乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌多重Taq-Man熒光定量PCR鑒別檢測方法，特異性強、靈敏度高和重復性好，為3種奶牛乳房炎主要致病原的快速檢測和流行病學提供了有效的技術手段，具有良好的推廣應用價值。