柔嫩艾美耳球蟲配子體基因Etgam56的克隆表達與鑒定

劉悅，汪飛燕，葉狀，宿世杰，侯照峰，許金俊，陶建平，劉丹丹*

(1.揚州大學獸醫學院，江蘇 揚州 225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創新中心，江蘇 揚州 225009)

雞球蟲病是一種危害嚴重的寄生性原蟲病，每年給全球養雞業造成巨大的經濟損失。雞球蟲病通常由7種艾美耳屬球蟲單獨或混合感染引起，其中柔嫩艾美耳球蟲是致病性最強的蟲種，重度感染可引起急性盲腸球蟲病。目前國內外主要通過化學藥物防控球蟲病，隨著抗球蟲藥大量廣范使用，耐藥性的產生以及藥物殘留引起的食品安全問題也逐漸為人們所重視，而傳統活疫苗免疫的方法也存在散播病原的風險且穩定性較差，因此重組亞單位疫苗成為更被關注的球蟲病防治手段[1]。已有研究報道巨型艾美耳球蟲配子體基因Emgam56和Emgam82的原核表達重組蛋白免疫雛雞，可以有效降低卵囊產量和病變記分，具有一定的免疫保護力[2]，且2種配子體蛋白GAM56和GAM82在卵囊壁形成過程中發揮重要作用，推測其可能通過免疫阻斷作用阻斷卵囊發育[3-4]。本文對柔嫩艾美耳球蟲配子體蛋白編碼基因gam56(Etgam56)進行了克隆和序列分析，構建原核表達載體并進行體外誘導表達，并對表達產物的抗原性進行了評價，旨為研制新型球蟲亞單位疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 蟲株

柔嫩艾美耳球蟲揚州株，由揚州大學獸醫學院寄生蟲學教研室經單卵囊分離建株，定期經無球蟲污染的雞傳代保種。

1.2 主要試劑材料

pMD20-T載體，購自TaKaRa公司。大腸桿菌DH5α和BL21菌株、表達載體pET-28a(+)，均由本實驗室保存。PrimeSTAR GXL DNA Polymerase，Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR，Hind Ⅲ、BamHⅠ限制性內切酶，TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit等，均購自寶生物工程(大連)有限公司；Ni-NTA親和層析介質，購自金斯瑞生物科技公司；6×Loading Buffer，購自碧云天公司；硝酸纖維素膜，購自默克公司；ECL化學發光試劑，購自Tanon公司；Anti-6×HIS標簽小鼠單抗和HRP標記的家兔抗小鼠IgG，購自BBI公司；HRP標記的綿羊抗雞IgG，購自HPL公司。

1.3 引物設計

根據GenBank中收錄的柔嫩艾美耳球蟲Etgam56基因序列(XM_013376832.1)，使用Primer 5.0軟件設計3條特異性引物，F1：5′-ATGACTCGCCTCAGCCTCT-3′；F2：5′-TTACGGAGGAACGGGGCCGAA-3′；F3：5′-TACAGCTACAGGTACCCCTCC-3′。引物由華大基因科技股份有限公司合成。

1.4 球蟲卵囊總DNA的提取

取實驗室提取、保存的柔嫩艾美耳球蟲配子體，按TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit說明提取基因組DNA。

1.5 Etgam56基因的擴增

參照PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase說明書，PCR法擴增Etgam56，以F1為上游引物、F2為下游引物擴增基因全長序列，由于該基因下游GC含量較高，為保證擴增序列的準確性，以F3為上游引物、F2為下游引物單獨擴增高GC片段。50 μL PCR反應體系：5×PrimeSTAR GXL Buffer 10 μL，dNTP混合物(每種2.5 mmol/L)4 μL，F1/F2/F3引物(10 mmol/L)各1 μL，模板(30 ng/μL)2 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase (1.5 U/μL)1 μL，滅菌水31 μL，反應條件為：98 ℃ 3 min；98 ℃ 10 s，68 ℃ 1.5 min，30個循環；72 ℃ 5 min。預計擴增目的片段分別為1 425 bp(引物F1和F2)和573 bp(引物F3和F2)。

1.6 Etgam56基因的克隆與序列分析

將含有目的片段的PCR產物分別經試劑盒純化回收后，參照Mighty TA-cloning Reagent Set for PrimeSTAR?說明書對純化的PCR產物3′端添加“A”堿基，構建pMD20-T-Etgam56克隆質粒，常規轉化至大腸桿菌DH5α。經藍白斑篩選，隨機挑選白斑，提取質粒，經HindⅢ和BamHⅠ雙酶切鑒定為陽性的克隆，送華大基因科技股份有限公司測序。將測序得到的兩段核苷酸序列進行拼接，并進行生物信息學分析。

1.7 原核表達質粒的構建

根據大腸桿菌蛋白表達系統的密碼子偏嗜性，將Etgam56基因序列進行優化合成后連接至pET-28a(+)，構建原核表達載體pET-28a(+)-Etgam56，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)，挑取陽性重組菌進行體外誘導表達。

1.8 重組蛋白表達條件優化與可溶性分析

1.8.1 IPTG濃度的確定

將陽性重組菌的單菌落接種卡那霉素(100 μg/mL)的LB培養基，37 ℃，200 r/min過夜培養，按1∶100轉接種3 mL含相同濃度卡那霉素LB培養基中，37 ℃，200 r/min培養4 h后，分別加入終濃度為0.10、0.30、0.50、0.70和1.00 mmol/L的IPTG誘導表達4 h；取誘導后重組菌1 mL，PBS洗滌3次后，200 μL PBS重懸菌體，加入40 μL 6×SDS-PAGE上樣緩沖液，12 000 r/min離心10 min，取上清進行12% SDS-PAGE分析。

1.8.2 最佳誘導溫度的確定

將重組菌分組接種到含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB培養基中，37 ℃，200 r/min培養4 h后，分別加入終濃度為0.10 mmol/L的IPTG，分別置于10 ℃、16 ℃、20 ℃、37 ℃環境中誘導表達20 h；取誘導后重組菌1 mL，懸浮于200 μL PBS中，冰浴超聲裂解(功率30%，超聲2 s，間歇3 s，5 min)，4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后分別取上清和沉淀(沉淀用200 μL PBS稀釋)進行SDS-PAGE。

1.8.3 最佳誘導時間的確定

將重組菌分組接種到含有卡那霉素(100 μg/mL)的LB培養基中，37 ℃，200 r/min培養4h后，分別加入終濃度為0.10 mmol/L的IPTG，37℃誘導表達，分別于誘導后1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、8.0、12.0、16.0及20.0 h取重組菌1 mL，PBS洗滌3次后，200 μL PBS重懸菌體，加入40 μL 6 × SDS-PAGE上樣緩沖液，12 000 r/min離心10 min后分別取上清進行12% SDS-PAGE分析。

1.9 重組蛋白的特異性檢測

將誘導的陽性重組菌蛋白、pET-28a(+)質粒轉化菌蛋白以及未經轉化的BL21菌體蛋白進行12% SDS-PAGE電泳，并轉移到NC膜上。轉印結束后參照劉丹丹等[5]方法進行Western blot檢測。其中一抗為6×HIS標簽單抗(用封閉液按1∶5 000倍稀釋)，二抗為HRP標記的兔抗小鼠IgG(用封閉液按1∶15 000倍稀釋)。ECL化學發光顯色，天能5200成像系統觀察顯色結果并掃描保存。

1.10 重組蛋白的純化與復性

取誘導后的重組菌250 mL，離心收集沉淀，經PBS洗滌后重懸于10 mL PBS中，冰浴超聲釋放包涵體；4 ℃ 12 000 r/min 離心 15 min，棄上清，將沉淀重懸于10 mL LE Buffer，冰浴超聲加速包涵體溶解；4℃ 12 000 r/min 離心 15 min，將上清移入Ni-NTA親和純化層析柱中，4℃結合30 min；用2×層析柱體積的Washing Buffer洗滌層析柱3次，用2×層析柱體積的Elution Buffer洗滌層析柱3次，收集Elution Buffer的洗脫液，轉移至透析袋中，分別置于含有6、4、2及1 mol/L尿素的透析液和0.1 mol/L PBS 中4 ℃復性6～8 h，最終PEG8 000濃縮，收集蛋白。

1.11 重組蛋白的免疫學鑒定

參照1.9的方法，分別以雞抗柔嫩艾美耳球蟲康復血清、雞抗毒害艾美耳球蟲康復血清(由揚州大學獸醫學院寄生蟲學教研室制備保存)為一抗，以HRP標記的綿羊抗雞IgG為二抗，對重組蛋白進行Western blot抗原性和種間交叉反應性檢測。

2 結果

2.1 目的基因的擴增

PCR擴增得到的目的片段大小分別為1 425 bp、673 bp左右，與預期大小相符(圖1)。

2.2 核苷酸序列分析

將酶切鑒定為陽性的克隆(圖2)進行測序，將分段克隆的測序結果進行拼接，兩段序列重疊237 bp左右，拼接后所得序列全長為1 425 bp。將所測序列與發表在GenBank中的Eagam56(XM_013395657.1、XM_013395658.1)、Emgam56(AY129951.2、XM_013478110.1、XM_013478111.1)和Engam56(XM_013585547.1)進行序列比對，同源性分別為67.3%、51.0%、68.9%、51.0%、69.1%、87.9%。

M.DL2000 DNA Marker；1.Etgam56擴增產物(F1，F2)；2.Etgam56擴增產物(F3，F2)圖1 Etgam 56的PCR擴增

M.DNA分子質量標準；1，2.重組質粒HindⅢ和BamHⅠ雙酶切產物圖2 重組質粒的酶切鑒定

2.3 氨基酸序列分析

氨基酸序列分析顯示，Etgam56基因共編碼474個氨基酸，分子質量為53.74 ku，等電點(PI)為4.92，pH值為7.0時電離點為-10.641，含有33個強堿性氨基酸(K、R)，44個強酸性氨基酸(D、E)，98個疏水性氨基酸(A、I、L、F、W、V)，170個極性氨基酸(N、C、Q、S、T、Y)。該蛋白富含脯氨酸(13.47%)、蘇氨酸(10.11%)、酪氨酸(9.68%)、絲氨酸(8.84%)、甲硫氨酸(7.58%)，且含有1個酪氨酸和絲氨酸富集區(第245-321位)和1個脯氨酸和甲硫氨酸富集區(第339-454位)。抗原決定簇在線分析顯示，此蛋白共含有9個抗原決定簇，顯示其具有較好的抗原性。

2.4 重組蛋白的誘導表達及不同條件對表達水平的影響

將重組質粒pET-28(+)-Etgam56轉化BL21(DE3)大腸桿菌，誘導表達后進行SDS-PAGE分析，結果顯示，重組蛋白(rEtGAM56)大小為56 ku左右。IPTG濃度為0.10 mmol/L，37 ℃誘導3 h的蛋白表達量最高。

2.5 重組蛋白的純化與復性

在最適表達條件下，大量誘導表達重組蛋白，經HIS標簽Ni-NTA親和層析柱純化，收集純化過程中不同時期流出液進行12% SDS-PAGE，結果顯示，裂解液中的蛋白能與Ni-NTA較好結合，經3次Washing Buffer洗滌，可有效去除未與Ni-NTA結合的雜蛋白，Elution Buffer可以有效洗脫目的蛋白，純化效果較好，且復性過程中未發生蛋白降解(圖3)。

M.標準蛋白質分子量標記；1.包涵體尿素裂解后上清；2.裂解液與 Ni-NTA 結合后的流出液；3.Washing Buffer 第3次洗脫液；4.Elution Buffer第1次洗脫液；5.Elution Buffer第3次洗脫液；6.純化復性后蛋白圖3 重組蛋白的純化與復性

2.6 重組蛋白的鑒定

Western blot分析顯示，重組蛋白能被抗6×HIS標簽單克隆抗體特異性識別(圖4)，在56 ku左右出現目的條帶，而pET-28a(+)質粒轉化菌蛋白對照組未見條帶，證實Etgam56基因成功體外表達。

M.蛋白分子質量標準；1.pET-28a(+)/BL21 IPTG誘導；2.pET-28a(+)-Etgam56/BL21 IPTG誘導圖4 重組蛋白的特異性鑒定

2.7 重組蛋白抗原性分析

Western blot分析顯示，柔嫩艾美耳球蟲病雞康復血清(圖5)和毒害艾美耳球蟲的雞康復血清(圖6)特異性識別，而pET-28a(+)質粒轉化菌蛋白未與抗體發生反應，顯示重組蛋白具有較好的抗原性和交叉抗原性。

M.蛋白分子質量標準；1.pET-28a(+)/BL21 IPTG誘導；2.pET-28a(+)-Etgam56/BL21 IPTG誘導圖5 抗雞柔嫩艾美耳球蟲康復血清的Western blot檢測

M.標準蛋白分子質量；1.pET-28a(+)-Etgam56/BL21 IPTG 誘導；2.pET-28a(+)/BL21 IPTG 誘導圖6 抗雞毒害艾美耳球蟲康復血清的Western blot檢測

3 討論

經序列分析顯示Etgam56基因無內含子序列，故本研究提取了柔嫩艾美耳球蟲配子體的基因組DNA，采用PCR方法擴增目的基因，鑒于片段大小以及高GC含量，同時考慮到測序結果的準確性，特設計了中間引物F3擴增序列后段的高GC區域，所得序列經Lasergene7.0分析，拼接后的序列大小為1 425 bp，為一個完整閱讀框，編碼474個氨基酸，含有1個酪氨酸和絲氨酸富集區(第245-321位)、1個脯氨酸和甲硫氨酸富集區(第339-454位)，在線軟件(http://imed.med.ucm.es/Tools/antigenic.pl)預測抗原決定簇，結果顯示，該蛋白共含有9個抗原決定簇，其中最長的抗原決定簇富含酪氨酸和絲氨酸，且位于酪氨酸和絲氨酸富集區內，符合雞球蟲配子體蛋白基因在氨基酸序列上的結構域特征[6-7]。核酸序列分析顯示與其他配子體蛋白編碼基因具有較高的同源性，故證實研究獲得的基因確為柔嫩艾美耳球蟲Etgam56基因。

球蟲的生活史復雜，不同發育階段不同抗原的免疫原性也有較大的差別，配子體蛋白是卵囊壁的前體蛋白，推測其在囊壁形成過程中發揮重要作用。目前已經報道的配子體蛋白編碼基因主要有：巨型艾美耳球蟲的Emgam56、Emgam82[8]和Emgam230[9]，柔嫩艾美耳球蟲的Etgam56 (Etgam56 tmp1)、Etgam59 (Etgam56 tmp2)和Etgam22[10]，毒害艾美耳球蟲的Engam59和Engam22[11]，堆型艾美耳球蟲的Eagam56[12]。有研究證明，分離于巨型艾美耳球蟲突然配子體內的EmGAM56、EmGAM82和EmGAM230蛋白，以及體外重組表達的rEmGAM82和rEmGAM56，均能誘導宿主產生免疫反應，在一定程度上抑制巨型艾美耳球蟲的發育，降低卵囊產量，具有一定的免疫保護效果[13]。本研究中獲得的重組蛋白rEtGAM56能被柔嫩艾美耳球蟲的雞康復血清所識別，同時也可被毒害艾美耳球蟲的雞康復血清所識別，顯示該重組蛋白具有良好的抗原性和一定的種間交叉反應性，但其對雞體的免疫保護效果還有待進一步研究。