噬菌體在細(xì)菌耐藥性傳播中的作用及分子機(jī)制

顧佶麗，何濤，魏瑞成，王冉*

(1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所/省部共建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室—江蘇省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014)

抗生素在對(duì)抗細(xì)菌感染性疾病的過(guò)程中發(fā)揮了巨大作用，然而隨著抗生素的廣泛使用甚至濫用，細(xì)菌對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性。與細(xì)菌本身具有的天然耐藥性不同[1]，這種耐藥性是通過(guò)染色體的突變，或者整合外源的抗生素耐藥基因(ARGs)獲得的，也叫做獲得性耐藥[2]。ARGs的水平轉(zhuǎn)移可以通過(guò)三種機(jī)制實(shí)現(xiàn)：轉(zhuǎn)化(transformation)、接合轉(zhuǎn)移(conjugation)以及轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。其中接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)導(dǎo)都需要借助于可移動(dòng)遺傳元件(mobile genetic elements,MGEs)實(shí)現(xiàn)。根據(jù)其行為特征可以將介導(dǎo)耐藥性水平轉(zhuǎn)移的MGEs分為兩種主要類型：一類是可以在細(xì)菌宿主染色體外獨(dú)立進(jìn)行復(fù)制并傳播的,這一類最經(jīng)典的代表就是質(zhì)粒(plasmid)，也是目前最受關(guān)注的MGEs，它在細(xì)菌耐藥性的水平轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散中發(fā)揮了巨大作用,另外一類MGEs則需要整合到宿主基因組DNA上以維持其穩(wěn)定存在，包括整合子、插入序列、轉(zhuǎn)座子、基因島、整合性接合轉(zhuǎn)移元件(ICEs)以及噬菌體等。質(zhì)粒、整合子和基因島等MGEs在耐藥基因傳播過(guò)程中的重要性已經(jīng)得到了人們的廣泛認(rèn)識(shí)，而對(duì)于噬菌體在耐藥基因轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散中的貢獻(xiàn)關(guān)注較少。因此，本文主要對(duì)噬菌體在耐藥性傳播中的作用及其分子機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 噬菌體的定義及類型

噬菌體是一種感染細(xì)菌的病毒，英文名稱為“bacteriophage”，簡(jiǎn)稱“phage”，意思是“吃細(xì)菌的病毒”。它們的基因組DNA或RNA被包裹在蛋白成分的衣殼(capsid)內(nèi)部，因能引起宿主菌的裂解，故稱為噬菌體。它在自然界的數(shù)量龐大，存在于細(xì)菌的各個(gè)生存環(huán)境中[3-5]，如海洋、淡水、土壤、植物葉層和根圍、動(dòng)物養(yǎng)殖環(huán)境、受人類活動(dòng)影響的環(huán)境(如污水處理廠)以及人類腸道，甚至是極端環(huán)境中(表1)。從數(shù)量來(lái)說(shuō)，自然界中噬菌體的總數(shù)估計(jì)超過(guò)了1030甚至1032，尤其以海洋中最為豐富。噬菌體可以分為裂解性(lytic)和溫和性(temperate)兩種：裂解性噬菌體可以特異性地感染某些細(xì)菌，利用細(xì)菌宿主合成自身的DNA以及蛋白進(jìn)行包裝后形成子代噬菌體，最后細(xì)菌宿主被裂解而子代噬菌體釋放出來(lái)。溫和性噬菌體，也叫溶原性(lysogenic)噬菌體，大多情況下其DNA整合到宿主的染色體DNA上，這個(gè)過(guò)程也叫溶原轉(zhuǎn)換，隨著宿主DNA的復(fù)制一起進(jìn)行復(fù)制，而噬菌體中對(duì)細(xì)菌有害的基因不會(huì)表達(dá)，這種整合到宿主染色體上的噬菌體也叫做前噬菌體(prophage)，攜帶前噬菌體的細(xì)菌叫做溶原菌(lysogen)。有部分前噬菌體，如P1、N15，LE1，φ20和 φBB-1，并不整合到宿主染色體上而以環(huán)狀或線性的質(zhì)粒形式存在于宿主細(xì)胞內(nèi)。能夠發(fā)生溶原轉(zhuǎn)換的噬菌體一般可以編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子和整合酶等基因。在某些環(huán)境壓力(紫外線、抗生素壓力等)條件下發(fā)生溶原的前噬菌體可以從細(xì)菌宿主中釋放出來(lái)，這個(gè)過(guò)程叫做誘導(dǎo)(induction)，此時(shí)噬菌體進(jìn)入裂解期，宿主菌裂解死亡而子代噬菌體釋放出來(lái)。但是如果前噬菌體中涉及溶原-裂解轉(zhuǎn)換功能的基因或是某些表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白的基因丟失，從而造成前噬菌體不能從宿主菌中誘導(dǎo)出來(lái)，這種不可誘導(dǎo)前噬菌體的DNA序列會(huì)長(zhǎng)期存在于細(xì)菌基因組中。細(xì)菌基因組中的前噬菌體是否具有完整的功能活性，可以通過(guò)在線預(yù)測(cè)軟件Prophage Hunter(https://pro-hunter.bgi.com/)和PHAST(http://phast.wishartlab.com/)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

表1 環(huán)境中噬菌體的豐度

2 前噬菌體及其分布

目前除了一些在實(shí)驗(yàn)室偶然發(fā)現(xiàn)的經(jīng)典前噬菌體外(λ，P1,P2,P4,P22,N15)，系統(tǒng)性研究表明前噬菌體在細(xì)菌中廣泛存在，這些前噬菌體有些具有功能活性，可以被誘導(dǎo)出來(lái)。如75%的化膿性鏈球菌中攜帶至少一個(gè)前噬菌體；Osawa等[6]從51株致病性大腸桿菌中發(fā)現(xiàn)了27個(gè)不同的攜帶志賀氏菌毒素的前噬菌體；Schicklmaier等[7-8]發(fā)現(xiàn)107株大腸桿菌中有83株可以誘導(dǎo)出至少一個(gè)前噬菌體，173株沙門(mén)氏菌中有136株可以釋放出前噬菌體，而實(shí)驗(yàn)室常用的沙門(mén)氏菌LT2攜帶了4個(gè)完整的、具有功能的前噬菌體；有研究表明使用米諾環(huán)素C可以從170個(gè)耶爾森菌屬中誘導(dǎo)出7個(gè)具有功能的前噬菌體，以及從68個(gè)革蘭氏陽(yáng)性奶牛源鏈球菌中誘導(dǎo)出38個(gè)前噬菌體或噬菌體樣顆粒。另有研究表明利用探針雜交的方法可以在同一種屬的多株細(xì)菌中檢測(cè)到同一特定的前噬菌體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，某些細(xì)菌中前噬菌體基因組(包括完整和不完整)的含量可以高達(dá)10%～20%，不同細(xì)菌種屬含有的前噬菌體數(shù)量也不相同，如金黃色葡萄球菌基因組中大概有1～4個(gè)前噬菌體，某些大腸桿菌中前噬菌體的數(shù)量達(dá)到了20個(gè)。細(xì)菌基因組中前噬菌體普遍存在，這些前噬菌體極大地豐富了細(xì)菌的基因組內(nèi)容，對(duì)細(xì)菌基因組的多樣性和細(xì)菌的進(jìn)化發(fā)揮了重要作用，其中就包括細(xì)菌耐藥基因的獲得和傳播，從而使其適應(yīng)外界復(fù)雜的生存環(huán)境。

3 噬菌體在耐藥性傳播中的作用

早在19世紀(jì)50年代，就發(fā)現(xiàn)噬菌體可以轉(zhuǎn)移細(xì)菌(主要是大腸桿菌和沙門(mén)菌)染色體或質(zhì)粒上的ARGs，這個(gè)過(guò)程稱為轉(zhuǎn)導(dǎo)(transduction)。相對(duì)于介導(dǎo)ARGs轉(zhuǎn)移的其它方式(質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子等)，轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生的頻率相對(duì)較低，且不同細(xì)菌種屬差異較大，如在金黃色葡萄球菌和鏈球菌中轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率達(dá)到10-5～10-6，而在大腸桿菌、沙門(mén)菌等革蘭陰性菌中轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率則為10-5～10-10，而質(zhì)粒等移動(dòng)元件的轉(zhuǎn)移頻率可以達(dá)到10-1～10-3，因此由噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)方式介導(dǎo)的ARGs水平轉(zhuǎn)移受到的關(guān)注較少。盡管如此，由于噬菌體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易在環(huán)境中長(zhǎng)期存活并可以對(duì)抗各種(DNA酶、溫度和輻射)環(huán)境壓力[9]，因此，它可以作為自然環(huán)境中耐藥基因轉(zhuǎn)移的最合適載體；并且環(huán)境中噬菌體數(shù)量巨大，不需要借助細(xì)菌與細(xì)菌之間的接觸就可以傳遞遺傳物質(zhì)，因此轉(zhuǎn)導(dǎo)在自然界中可能隨時(shí)隨地發(fā)生，其在耐藥性傳播中的作用遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出我們的想象。噬菌體不僅可以和ARGs共存于同一生態(tài)環(huán)境和同一細(xì)菌中，并且通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證明了某些ARGs可以通過(guò)噬菌體在同一種屬細(xì)菌甚至不同種屬細(xì)菌之間傳遞。

3.1 噬菌體與耐藥基因的共存現(xiàn)象

目前在多種細(xì)菌的前噬菌體中發(fā)現(xiàn)了抗生素耐藥基因(表2)：如在大腸桿菌和沙門(mén)菌中發(fā)現(xiàn)了P1-like噬菌體并分別攜帶了blaSHV-2和blaCTX-M-27β-內(nèi)酰胺酶基因[2,10]；在豬源大腸桿菌和人醫(yī)臨床肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)P7-like噬菌體并攜帶了多黏菌素耐藥基因mcr-1[11-12]；在西班牙某醫(yī)院分離到的多個(gè)腸桿菌科細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶基因blaCTX-M-10與噬菌體遺傳元件存在偶聯(lián)關(guān)系[13]；化膿性鏈球菌中的大環(huán)內(nèi)酯類耐藥基因mefA位于58.8 kb的轉(zhuǎn)座子上，該轉(zhuǎn)座子插入到了該菌的前噬菌體中[14]；攜帶四環(huán)素耐藥基因tet(M)的Tn916-like轉(zhuǎn)座子元件在肺炎鏈球菌的前噬菌體中被發(fā)現(xiàn)[15]；炭疽桿菌前噬菌體中攜帶了對(duì)磷霉素耐藥的基因[16]。隨著宏基因組測(cè)序和實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)技術(shù)的發(fā)展，ARG被發(fā)現(xiàn)存在于多種環(huán)境來(lái)源的噬菌體DNA上，包括活性污泥、城市污水和河流、醫(yī)院廢水、污水處理廠廢水以及土壤中，如有學(xué)者使用了qPCR的方法檢測(cè)了城市污水和河水樣本中噬菌體DNA中的耐藥基因，結(jié)果檢測(cè)到了兩種β-內(nèi)酰胺酶耐藥基因(blaTEM和blaCTX-M)以及青霉素結(jié)合蛋白基因mecA[17]；另有研究表明醫(yī)院和城市廢水中的噬菌體DNA中含有高水平的β-內(nèi)酰胺酶基因(blaTEM,blaCTX-M和blaSHV)和喹諾酮類耐藥基因(qnrA,qnrB和qnrS)[18]；最近的一個(gè)研究證明了被糞便污染的水體中分離的噬菌體DNA含有喹諾酮耐藥基因qnrA和qnrS，并且對(duì)水體進(jìn)行螯合劑(EDTA或枸櫞酸鈉)的處理可明顯增加噬菌體DNA中耐藥基因的數(shù)量[19]；Muniesa等[20]在城市污水中發(fā)現(xiàn)了攜帶blaOXA-2,blaPSE-1、blaPSE-4以及blaPSE-type基因的病毒顆粒；除了生活環(huán)境，在人類的腸道、肺部的病毒組中也檢測(cè)出了多個(gè)抗生素耐藥基因。本實(shí)驗(yàn)室收集了NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上發(fā)表的8 263個(gè)完整的噬菌體基因組序列，通過(guò)深入分析發(fā)現(xiàn)有20個(gè)(0.24%)噬菌體攜帶了β-內(nèi)酰胺類耐藥基因，間接說(shuō)明了噬菌體可能在耐藥基因的傳播過(guò)程中發(fā)揮作用。

表2 噬菌體中存在的耐藥基因

3.2 噬菌體介導(dǎo)的耐藥基因轉(zhuǎn)移證據(jù)

與質(zhì)粒、整合子、轉(zhuǎn)座子、基因島和ICEs不同，噬菌體不需要細(xì)菌之間接觸就可以傳遞遺傳物質(zhì)。目前已有多篇噬菌體轉(zhuǎn)移耐藥基因的文獻(xiàn)報(bào)道，噬菌體在轉(zhuǎn)移耐藥基因進(jìn)入受體菌的同時(shí)，賦予受體菌相應(yīng)的耐藥表型(表3)。噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)耐藥性可以在同種屬細(xì)菌的不同菌株之間進(jìn)行，如P22及P22-like噬菌體可以介導(dǎo)耐藥基因簇在鼠傷寒沙門(mén)菌DT104菌株之間轉(zhuǎn)移[8,21]。四環(huán)素耐藥基因和氯霉素-大環(huán)內(nèi)酯類-林可霉素-克林霉素耐藥基因可以通過(guò)溶原性噬菌體在臨床化膿性鏈球菌菌株間水平轉(zhuǎn)移[22]。亞胺培南、頭孢他啶和氨曲南耐藥基因可以通過(guò)溶原性噬菌體轉(zhuǎn)移至銅綠假單胞菌臨床株[23-24]。ΦC2 可介導(dǎo)編碼紅霉素耐藥基因erm(B)的轉(zhuǎn)座子Tn6215在艱難梭菌之間傳播[25]。溫和性噬菌體Aa phi ST1可介導(dǎo)四環(huán)素耐藥轉(zhuǎn)座子Tn916在放線桿菌之間傳遞[26]。耐藥性轉(zhuǎn)導(dǎo)在葡萄球菌尤其是金黃色葡萄球菌中比較普遍，如金葡菌前噬菌體φ11，φ80 和 φ80α可對(duì)攜帶mecA基因的I型SCCmec遺傳元件進(jìn)行包裝，從而能夠在不同金葡菌之間轉(zhuǎn)移mecA基因[27]；噬菌體φ80α等不僅可介導(dǎo)青霉素和四環(huán)素耐藥基因向金黃色葡萄球菌流行株USA300傳播，還可以介導(dǎo)耐藥基因向噬菌體不敏感的金葡菌轉(zhuǎn)移[28-29]。噬菌體介導(dǎo)耐藥基因轉(zhuǎn)移不僅可以在同種屬細(xì)菌之間發(fā)生，還可以在不同屬細(xì)菌之間進(jìn)行，如P1及P1-like噬菌體可以介導(dǎo)耐藥基因或耐藥質(zhì)粒在大腸桿菌之間或大腸桿菌與豬霍亂沙門(mén)氏菌之間進(jìn)行轉(zhuǎn)移[21,30-31]；四環(huán)素耐藥性可以通過(guò)溶原性噬菌體從豬源雞腸球菌轉(zhuǎn)移至糞腸球菌，慶大霉素耐藥性也可以通過(guò)溶原性噬菌體從豬源糞腸球菌轉(zhuǎn)移至屎腸球菌、希氏/堅(jiān)韌腸球菌和酪黃腸球菌中[32]。噬菌體φOT8可介導(dǎo)耐藥質(zhì)粒在沙雷菌之間或沙雷氏菌和成團(tuán)泛菌之間進(jìn)行傳播[33]；噬菌體Φm46.1可以介導(dǎo)耐藥基因mef(A)和tet(O)從化膿性鏈球菌向無(wú)乳鏈球菌和戈登鏈球菌轉(zhuǎn)移[34];噬菌體φ879可介導(dǎo)四環(huán)素和氨基糖苷類耐藥質(zhì)粒在松鼠葡萄球菌之間以及從松鼠葡萄球菌向金黃色葡萄球菌轉(zhuǎn)移[35]；金葡菌前噬菌體可以介導(dǎo)鏈霉素耐藥基因以高頻率在金黃色葡萄球菌之間或從金葡菌向單增李斯特菌傳播[27]。

表3 噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)的耐藥基因

3.3 噬菌體轉(zhuǎn)移耐藥基因的分子機(jī)制

噬菌體轉(zhuǎn)移耐藥基因是通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)方式進(jìn)行的，目前有三種轉(zhuǎn)導(dǎo)方式：特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)(specialized transduction)、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)(generalized transduction)和側(cè)向轉(zhuǎn)導(dǎo)(lateral transduction)。

特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)又稱為局限性轉(zhuǎn)導(dǎo)，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)方式只能轉(zhuǎn)移特定的基因片段到受體菌中，目前發(fā)現(xiàn)只能由溫和性噬菌體介導(dǎo)。發(fā)生特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)的噬菌體一般整合到宿主菌的特定位點(diǎn)，在裂解宿主菌的過(guò)程中，噬菌體將整合位點(diǎn)附近的宿主DNA包裝進(jìn)自己的衣殼顆粒中，這種包裝錯(cuò)誤的噬菌體感染受體菌并將外源DNA整合到受體菌染色體上，此時(shí)特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生。一般來(lái)說(shuō)，那些能夠通過(guò)“cos”機(jī)制切割和包裝DNA，產(chǎn)生單位長(zhǎng)度衣殼化DNA分子的噬菌體(如λ，T7)負(fù)責(zé)特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)，在該轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，宿主的基因組DNA和噬菌體DNA是共價(jià)地結(jié)合在一起的，與噬菌體DNA一起進(jìn)行復(fù)制、包裝和導(dǎo)入到受體細(xì)菌中。由于細(xì)菌基因組上與“cos”位點(diǎn)同源的序列很少，因此，特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)只能轉(zhuǎn)移特定的細(xì)菌基因組片段到受體菌中，所以該轉(zhuǎn)導(dǎo)方式發(fā)生的頻率較低。

普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)能轉(zhuǎn)移細(xì)菌基因組的任何DNA片段到受體細(xì)菌中，即轉(zhuǎn)移的宿主基因具有隨機(jī)性，一般通過(guò)溫和性噬菌體介導(dǎo)，但也有報(bào)道表明經(jīng)過(guò)突變的裂解性噬菌體T4也可發(fā)生普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)。噬菌體感染宿主菌后，可以產(chǎn)生兩種類型的子代病毒顆粒，一種為只包含噬菌體DNA的顆粒，一種為錯(cuò)誤包裝宿主DNA片段的顆粒，也叫做轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒(transducing particles)。這些轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒除了衣殼蛋白是來(lái)源于噬菌體的，其包裝的DNA全部來(lái)自細(xì)菌基因組，因此，其攜帶外源DNA的容量較大。轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒如果成功感染某些細(xì)菌，可以將其中包裝的DNA片段帶入受體菌中，受體菌通過(guò)重組機(jī)制將外源基因整合到自身的染色體上，此時(shí)普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)完成。另有一種情況是被包裝的DNA片段是質(zhì)粒，該質(zhì)粒通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入受體菌中會(huì)發(fā)生環(huán)狀化，形成環(huán)狀的質(zhì)粒，因此普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)除了可以轉(zhuǎn)移基因片段外，還可以水平轉(zhuǎn)移耐藥質(zhì)粒。發(fā)生普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)的噬菌體通過(guò)滿頭(headful)包裝機(jī)制包裝基因組，一般這些噬菌體(如P1、P22、T4)在特異性位點(diǎn)(pac位點(diǎn))切割自己的基因組并最大能力地包裹它們的DNA到噬菌體衣殼中。一般細(xì)菌基因組中具有多個(gè)與pac同源的位點(diǎn),一旦這些pac同源位點(diǎn)被噬菌體“錯(cuò)誤”識(shí)別并切割，就有可能將細(xì)菌DNA包裝在噬菌體衣殼中，形成可轉(zhuǎn)導(dǎo)噬菌體顆粒。外源基因能否在受體菌中穩(wěn)定存在取決于該DNA序列整合到細(xì)菌基因組中的能力，即發(fā)生重組(同源重組、異常重組和位點(diǎn)特異性重組)的幾率，而這些是由前噬菌體中攜帶的重組酶、整合酶或者外源基因上存在的轉(zhuǎn)座酶或拓補(bǔ)異構(gòu)酶等因素共同決定的。普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)還有一種情況，它不僅可以使攜帶前噬菌體的溶原菌獲得競(jìng)爭(zhēng)者的基因片段，同時(shí)可以殺死競(jìng)爭(zhēng)者，從而有利于自身克隆的增殖，這種機(jī)制叫做自我轉(zhuǎn)導(dǎo)(auto-transduction)，有研究表明該機(jī)制可以增加金葡菌獲得耐藥基因的幾率[33]。

Chen等[37]最新研究發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌溫和噬菌體參與了一種特殊的轉(zhuǎn)導(dǎo)形式：側(cè)向轉(zhuǎn)導(dǎo)，在該過(guò)程中葡萄球菌前噬菌體不遵循經(jīng)典的切除-復(fù)制-包裝途徑，而是噬菌體的切除過(guò)程往后延遲，在復(fù)制和包裝過(guò)程后進(jìn)行。細(xì)菌基因組上的前噬菌體通過(guò)原位的DNA復(fù)制，可以產(chǎn)生多個(gè)前噬菌體基因組拷貝，隨后噬菌體在包裝DNA的過(guò)程中，可以同時(shí)形成成熟的噬菌體以及具有轉(zhuǎn)導(dǎo)能力的噬菌體顆粒，因此極大地提高了轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，該方式可以將金黃色葡萄球菌基因組中上百kb大小的片段以非常高的頻率包裝在噬菌體的頭部，因此被認(rèn)為是一種最有效的轉(zhuǎn)移耐藥基因的方式，該種轉(zhuǎn)導(dǎo)方式目前僅在金黃色葡萄球菌中報(bào)道。

在以上三種轉(zhuǎn)導(dǎo)方式中，普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)是最主要的方式，它發(fā)生的頻率在10-5～10-10之間，有時(shí)高達(dá)10-1(表3)。這種轉(zhuǎn)導(dǎo)方式可以在同一種屬細(xì)菌的不同菌株中發(fā)生，也可以在不同細(xì)菌種屬中發(fā)生，因此普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)在耐藥基因的跨種屬傳播中發(fā)揮了重要作用。特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移耐藥基因的機(jī)率很小，主要原因是噬菌體的整合位點(diǎn)主要位于細(xì)菌的核心基因組(core genome)上，而耐藥基因一般位于細(xì)菌基因組的可變區(qū)域(accessory genome)，同時(shí)特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)生的頻率較低(<10-9)，因此該種轉(zhuǎn)導(dǎo)方式對(duì)耐藥基因轉(zhuǎn)移的影響可以忽略。值得注意的是，在金黃色葡萄球菌中，特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)方式在其染色體基因島(PICIs)的轉(zhuǎn)移過(guò)程中作用較大，而PICIs可同時(shí)攜帶毒力基因和多種耐藥基因(如β-內(nèi)酰胺酶、氨基糖苷類、磷霉素、夫西地酸等耐藥基因)，因此普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)和特異性轉(zhuǎn)導(dǎo)方式均對(duì)金葡菌耐藥性的獲得和傳播發(fā)揮重要作用。側(cè)向轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)移基因片段的大小和效率最高，因此被認(rèn)為是最有效的轉(zhuǎn)移耐藥基因的方式，但是由于其僅在金黃色葡萄球菌中發(fā)現(xiàn)和報(bào)道，該種方式在其它種屬細(xì)菌中轉(zhuǎn)移耐藥基因的潛力還有待進(jìn)一步研究才能明確。對(duì)于轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)說(shuō)，噬菌體宿主譜是一個(gè)影響耐藥基因在細(xì)菌之間傳播的主要限制因素，這是由噬菌體尾絲蛋白識(shí)別細(xì)菌宿主的特異性決定的。由于革蘭陽(yáng)性菌噬菌體的宿主譜相對(duì)廣泛，因此推測(cè)噬菌體對(duì)耐藥基因在革蘭陽(yáng)性菌中的傳播作用要大于革蘭氏陰性細(xì)菌。

3.4 噬菌體對(duì)腸道菌群的影響

噬菌體作為細(xì)菌的“自然天敵”，具有來(lái)源廣泛、殺菌特異性強(qiáng)、殺菌效果好的優(yōu)點(diǎn)，因此在細(xì)菌感染尤其是耐藥菌的感染治療中具有巨大應(yīng)用潛力。前面所述噬菌體介導(dǎo)的耐藥性轉(zhuǎn)移和傳播作用主要是由溫和性噬菌體介導(dǎo)的，因此裂解性噬菌體在耐藥菌的生物防控中仍具有應(yīng)用價(jià)值。盡管如此，仍需要系統(tǒng)考察噬菌體在應(yīng)用過(guò)程中，尤其是在腸道疾病治療過(guò)程中可能對(duì)腸道菌群產(chǎn)生的影響。已有研究表明裂解性噬菌體通過(guò)作用于靶細(xì)菌，可波及到菌群中的其它非靶細(xì)菌成員及其代謝產(chǎn)物，從而對(duì)菌群造成廣泛影響[38]。同時(shí)，腸道細(xì)菌中具有和人類健康相關(guān)的噬菌體組(gut phageome)，這些噬菌體組對(duì)于腸道菌群穩(wěn)態(tài)的維持及耐藥基因腸道內(nèi)傳播的貢獻(xiàn)如何，也是下一步需要研究的方向。

4 結(jié)論

噬菌體是自然界中數(shù)量極為豐富的生物體，它存在于細(xì)菌生存的各個(gè)生態(tài)環(huán)境，對(duì)細(xì)菌基因組的多樣性和進(jìn)化發(fā)揮了重要作用。噬菌體結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，容易在環(huán)境中長(zhǎng)期存活并可以對(duì)抗各種環(huán)境壓力，因此它是耐藥基因轉(zhuǎn)移的最合適載體，對(duì)于耐藥基因的傳播和持留具有重要作用。同時(shí)，噬菌體不僅可以介導(dǎo)耐藥基因在同一種屬細(xì)菌之間傳播，還可以介導(dǎo)耐藥基因的跨細(xì)菌種屬傳播。因此，噬菌體在細(xì)菌耐藥性的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。在上述研究基礎(chǔ)上，今后對(duì)于噬菌體/耐藥性關(guān)系可加強(qiáng)以下幾個(gè)方面的研究工作：從體內(nèi)外探究噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)耐藥基因的驅(qū)動(dòng)因素及其作用機(jī)制，如抗生素壓力、炎癥等因素；比較不同類型(溫和性和裂解性)噬菌體在耐藥性轉(zhuǎn)移中的貢獻(xiàn)，從而充分評(píng)估裂解性噬菌體在治療中的安全性；深入研究噬菌體介導(dǎo)環(huán)境源耐藥基因轉(zhuǎn)移進(jìn)入動(dòng)物/人類共生菌以及致病菌過(guò)程中發(fā)揮的作用；建立科學(xué)的耐藥基因傳播擴(kuò)散評(píng)估模型，充分考察噬菌體、質(zhì)粒等可轉(zhuǎn)移元件在耐藥基因轉(zhuǎn)移中的貢獻(xiàn)。