盤基網柄菌DJ-1基因的克隆及生物信息學分析

陳蘇維,崔鈺瑩,侯碧巍,張唯玉,魯佳佳

(安康學院 現代農業與生物科技學院,陜西 安康 725000)

前言

盤基網柄菌是美國國立衛生研究院公布的10種模式生物之一，正常情況下以單細胞形式生存繁殖，食物缺乏即分泌環腺苷酸(cAMP)吸引周圍單細胞匯集成多細胞 "蛞蝓(slug)"[1～2]。此單細胞和多細胞共存的生活史使其展現出多種表現型，如生長、分裂、趨光性和趨熱性等，而這些特征使得研究高等生物基因型與表現型間的復雜相關性變得簡單且可操作性強[3～5]。

DJ-1最初被認為是一種原癌基因，與人類腫瘤和癌癥發生相關，在精子的成熟和受精方面也起重要作用[6]。自從Bonifati等在帕金森病人家族內發現DJ-1基因突變型，證實DJ-1也與帕金森病發生相關，且具有遺傳規律性[7]。關于DJ-1的功能和與其它基因之間的互相作用，一些學者進行了探索[8-11]，但研究結果尚未完全闡明其作用機制，而且研究結果之間存在一定差異。本研究通過對盤基網柄菌DJ-1基因進行克隆和生物信息學分析，旨在為后期利用盤基網柄菌模型研究DJ-1基因的功能和作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗所用菌株為大腸桿菌E.coliDH5α和盤基網柄菌D.discoideumAX2，其信息見表1。pUC18質粒，限制性內切酶EcoRI和NdeI，Taq DNA聚合酶，PureLinkTM Quick Gel Extraction Kit購自上海生物工程有限公司。

表1 實驗菌株及其基因型

1.2 方法

1.2.1 盤基網柄菌總基因組提取 從生長克雷伯氏菌(Klebsiellaaerogenes)的標準培養基上收集大約107個盤基網柄菌細胞，2 500 r·min-1室溫離心30 s，將收集的細胞用鹽溶液沖洗4次去除殘留的克雷伯氏菌，然后用1 ml DNAzol 4 ℃放置30 min對細胞進行裂解。裂解液室溫12 200 r·min-1離心10 min，然后取上清液用0.5 mL 100 %酒精進行沉淀，8 600 r·min-1離心5 min。沉淀所得DNA用1 mL 70 %酒精洗滌3次后，懸浮于100 μL 8 mM 氫氧化鈉溶液4 C 短期貯存或 -20℃長期貯存。

1.2.2 PCR引物的設計與合成 參照dictyBase公布的基因序列，利用Primer5.0設計DJ-1序列的特異性引物(表2)，并由Geneworks公司進行合成。

表2 盤基網柄菌DJ-1基因的上、下游引物序列

1.2.3 盤基網柄菌DJ-1基因PCR擴增 以盤基網柄菌總基因組DNA為模板，利用1.3合成的引物擴增DJ-1基因全長序列。反應體系如下：盤基網柄菌總基因組DNA模板 2 μL，上、下游引物(10 μM)各1 μL，Taq DNA 聚合酶 1 μL，dNTP 混合物(10 mM)2 μL，MgCl2(50 mM)5 μL，PCR 緩沖液(10 x)10 μL，ddH2O 78 μL，共100 μL。PCR擴增的反應條件和參數如下：①總基因組DNA模板變性：95 C·5 min-1；②變性：95 C·1 min-1，退火：50 C ·1 min-1，延伸：72 C·2 min-1，共35個擴增循環；③最后延伸：72 C·10 min-1。1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增PCR產物。

1.2.4 擴增DJ-1的限制性酶切、連接、陽性克隆子篩選及酶切鑒定與測序 將PCR擴增的DJ-1與pUC18利用EcoRI進行限制性內切并連接，形成連接產物pUC18-DJ-1。通過電穿孔法將pUC18-DJ-1轉化至E. coli DH5α，利用藍-白斑法進行轉化株篩選，獲得DJ-1陽性克隆子。利用堿裂解法從E. coli DH5α菌株中抽提pUC18-DJ-1，經雙酶切進行鑒定后由Geneworks公司進行測序。

1.2.5 盤基網柄菌DJ-1基因的生物信息學分析 用MEGA7.0軟件構建盤基網柄菌DJ-1的系統進化樹，分析采用自舉分析Bootstrap，設500次重復；利用Protparam軟件分析盤基網柄菌DJ-1的理化性質；利用TMHMM和SignalP 4.1 Server軟件分別預測DJ-1蛋白的跨膜結構和信號肽；利用Predotar軟件預測DJ-1蛋白的亞細胞位置；利用SMART軟件預測DJ-1蛋白質的結構域；利用SOPMA和SWISS-MODEL軟件分別預測DJ-1蛋白質的二級和三級結構。

2 結果

2.1 盤基網柄菌DJ-1基因的克隆

利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DJ-1的PCR擴增結果發現，盤基網柄菌DJ-1基因大小為600 bp左右，目的條帶清晰，與預期結果一致(圖1A)。利用EcoRI和NdeI雙酶切驗證結果與預期相符(圖1B)。

2.2 盤基網柄菌DJ-1的生物信息學分析

2.2.1DJ-1核苷酸同源序列比對 測序結果表明：盤基網柄菌DJ-1基因全長618 bp，不含內含子，共編碼205 個氨基酸。將測序所得盤基網柄菌DJ-1基因序列與GenBank公布的13株不同來源DJ-1核苷酸序列進行對比。結果顯示本研究所用盤基網柄菌AX2菌株的DJ-1核苷酸序列與盤基網柄菌AX4菌株完全相同，與其同屬不同種D.purpureum相似度為69 %，而與梭菌屬10個不同菌株的相似程度介于67%～73 %之間(圖2)。

2.2.2DJ-1 蛋白系統進化分析 對本研究盤基網柄菌AX2的DJ-1序列和2.2.2檢索的13個同源序列采用鄰接法(Neighbor-Joining, NJ)進行系統發育進化分析。結果表明：盤基網柄菌屬(Dictyostelium)與梭菌屬(Clostridium)形成兩個分支，盤基網柄菌本屬內D.discoideum與D.purpureum兩個種親緣關系較近，而D.discoideum種內兩個菌株AX2和AX4屬于同源(圖3)。

2.2.3DJ-1蛋白的理化性質分析DJ-1蛋白理化性質研究結果表明：DJ-1分子量約為22.87 kD，分子式為C1020H1616N268O311S8，其理論等電點為5.31。DJ-1含86個非極性氨基酸(A、F、V、L、I、P、W和M)和119個極性氨基酸，其中極性氨基酸包括28個酸性氨基酸(D和E)、26個堿性氨基酸(H、K和R)和65個中性氨基酸(N、C、Q、G、S、T和Y)。DJ-1帶負電荷的殘基總數為28個，帶正電荷的殘基總數為24個，其脂溶指數(Aliphatic index)為92.20，總疏水性平均值(Grand Average of Hydropathicity, GRAVY)為-0.124，說明盤基網柄菌DJ-1蛋白能溶于非極性溶劑，屬于疏水性蛋白質。盤基網柄菌DJ-1蛋白的不穩定指數(instability index)為27.24(<40)，表明其蛋白質結構相對穩定。

2.2.4DJ-1蛋白的跨膜區、信號肽分析及結構域預測 蛋白跨膜區及信號肽研究分析結果表明：盤基網柄菌DJ-1蛋白位于膜外，無跨膜結構和信號肽識別序列，也沒有明顯的結構域。

2.2.5DJ-1蛋白的二級和三級結構預測 二級結構預測發現：盤基網柄菌DJ-1蛋白含α-螺旋80個，占39.02 %；β-轉角15個，占7.32 %；無規卷曲68個，占33.17 %；延伸鏈42個，占20.49%(圖4)。SWISS-MODEL預測了盤基網柄菌DJ-1蛋白的立體空間結構模型(圖5)。

2.2.6DJ-1 蛋白的亞細胞定位 盤基網柄菌DJ-1蛋白亞細胞定位結果表明：DJ-1蛋白可能位于細胞內質網上(表3)。

表3 利用Predotar預測盤基網柄菌DJ-1蛋白質的亞細胞位置

3 討論

最早在意大利和荷蘭分別發現了DJ-114 000個堿基對缺失和L166P點突變引起帕金森病相關癥狀，而且其流行性具有孟德爾遺傳規律，從而證實帕金森病不是由環境變化隨機引起的生理缺陷，而是隨年齡增長而發生的神經退行性疾病[7,12]。隨后的研究進一步揭示DJ-1的突變可能會造成蛋白質異常累積或磷酸化、氧化應激和線粒體功能紊亂[13]，而其機制可能與DJ-1蛋白的亞細胞位移有關[14]，也有學者認為DJ-1通過分子伴侶、轉錄因子或蛋白水解酶等執行其對細胞的保護作用[15～17]，或者與其它疾病相關基因互相作用執行其功能[18～19]，但其具體功能和作用機制尚不明確。

盤基網柄菌是一種簡單的真核模式生物，其線粒體基因組和單倍體核基因組序列已被破譯[20]，且其遺傳轉化、反意義鏈或小RNA干涉基因表達、蛋白質GFP標記、表現型分析等基因操作技術已被廣泛使用，這些優點使得在高等生物上無法完成的基因操作成為可能且可信度高[21～22]。

筆者研究克隆了盤基網柄菌的DJ-1基因，并對其進行了測序，發現該基因克隆成功，無序列缺失或堿基突變，具有完整的開放閱讀框。同時利用核苷酸序列進行跨膜區域和信號識別序列分析發現，DJ-1沒有明顯的跨膜序列與信號肽，說明其亞細胞位置可能與線粒體無關。亞細胞位置預測認為其可能位于內質網上，屬于較穩定型胞內蛋白。DJ-1蛋白質的三級結構預測也發現了其活躍而保守的催化位點C117，這個位點與人類DJ-1蛋白質C106相對應。這些為今后建立盤基網柄菌DJ-1基因的原核及真核表達載體、在盤基網柄菌野生株內進行DJ-1蛋白的抑制和過表達并判斷其表達量改變與盤基網柄菌表現型之間的相關性、DJ-1亞細胞位置與細胞應激之間的關系、C117活性位點的功能等奠定基礎。另外，盤基網柄菌DJ-1基因的成功克隆也為后期利用GFP標記研究正常和氧化應激條件下DJ-1蛋白與線粒體定位的關系、建立DJ-1基因功能和作用機制的盤基網柄菌模型提供理論基礎。