流式細胞術應用及植物種質資源倍性研究進展

宋云連，張惠云，王躍全，高賢玉，左艷秀，羅心平

(云南省農業科學院 熱帶亞熱帶經濟作物研究所，云南 保山 678000)

前言

植物種質資源(Plant germplasm resourse)是指凡攜帶有不同種質(基因)的各種栽培植物及其近緣種和野生種。它大多數存在于特定品種之中，如古老的地方品種、新培育的推廣品種、重要的遺傳材料以及野生近緣植物等。這些資源是經過長時間的自然演變形成的，蘊藏著豐富的潛在可利用基因，但在過去，人們對植物種質資源無太多關注。因此，植物種質資源的保護開發利用與創新在遺傳育種中具有十分重要的作用，而其倍性的鑒定則是了解其遺傳背景和進一步應用的基礎，大量的研究表明，流式細胞術是目前可以高效快速準確的鑒定植物種質倍性的一種技術，是一種應用流式細胞儀進行分析、分選的方法[1,2]。目前，流式細胞儀應用已涉及醫學領域，如：常規免疫表型血細胞監測、白細胞計數和小概率細胞分析等；生物學領域，如：微生物活體或死體分析、發酵控制和細胞DNA含量計數等。由于種質資源染色體倍性數據是新品種選育必要的基礎數據和遺傳背景,且在植物種質資源鑒定和開發利用工作中的應用還很少。因此，本文對流式細胞儀的操作流程、特點、應用領域及其在植物種質資源上的應用進展作了綜述[3]。

1 流式細胞儀

1.1 簡介

流式細胞儀(Flow cytometry)是對細胞進行自動分析和分選的裝置。20世紀60年代后迅速發展起來，至80年代，流式細胞儀進入商品化時期，90年代則進入產品優化階段，各項功能逐漸強大，人們進行科學研究時也開始涉及流式細胞儀的應用。流式細胞儀利用光學檢測系統對高速流動的單細胞懸浮液進行多參數測量和信號處理得到的DNA 含量分布曲線，可以直接觀測植物倍性，且具有高效率、 高靈敏度、高分辨率和高精確度的特點，檢測一個樣品只需幾分鐘，破壞性小，只要幾微克的組織便可進行樣品分析，操作技術簡單，快速，而且能區分混倍體[4]。

1.2 特點

流式細胞儀與普通生物顯微鏡不同，在細胞分選以及倍性鑒定方面具有明顯的特征和優勢，如表1所示：

表1 流式細胞儀與普通顯微鏡倍性鑒定優勢比較

1.3 操作流程

流式細胞儀簡單易操作，待測樣品的制備只需幾分鐘，檢測結果也只需幾分鐘就可以清楚的看到。具體操作流程如圖1所示：

1.4 應用領域

1.4.1 醫學 王琪等應用流式細胞儀對患者的淋巴細胞亞群相對與絕對數量進行了檢測，發現CD4+T淋巴細胞平均數量較高,免疫功能損傷程度較低。這項檢測有助于今早發現HIV感染者，更好的把握治療最佳時機，提高生存的質量[5]。蘇密龍等應用流式細胞術對多發性骨髓瘤患者的中骨髓細胞表面免疫表型特征進行了檢測。研究表明，通過骨髓瘤細胞免疫表型可鑒別骨瘤細胞和正常細胞,這對今后快速，準確診斷骨瘤細胞提供了重要手段[6]。閆彬等應用流式細胞儀中流式微球法檢測血漿血管性血友病因子活性,及其對缺血性腦卒中(IS)預后評估。研究結果顯示，腦卒中患vWF:GPIbR與vWF:Ag、超敏CRP、Autar評分和住院天數呈正相關。與ELISA法相比,該方法簡單可靠，特異度高，準確性高，并且還可以預測腦卒中患者形成腦血栓的風險，評估預后[7]。Polat G等應用流式細胞儀，確定了鐮狀紅細胞(RBCs)患者在不同時間暴露在低氧環境下時紅細胞的形態變化。與普通顯微鏡相比，可以對大量的細胞進行快速的評估以及給出鐮狀紅細胞的動態變化過程，并針對這些統計相關信息，提出相應的治療手段，這樣就可以有效的提高鐮狀紅細胞患者的生活質量[8]。Liran B.Y等通過流式細胞術(IFC)來監測變化感染Mimivirus的棘阿米巴多噬菌體細胞，評估氧化應激和細胞骨架干擾物對病毒感染的影響。研究發現輕度氧化應激可以延緩產生病毒的多個階段，但發生感染的頻率大致相同。另外，還發現功能肌動蛋白細胞骨架需要融合病毒復制中心，才能產生病毒后代。為研究病毒感染周期和病毒-宿主相互作用提供了一種定量、高通量和高度可靠的方法[9]。Vijaya K應用流式細胞儀確定原發性免疫缺陷(PID)或先天免疫缺陷影響表型免疫系統的一個或多個組成部分。其表面、細胞內和核內的蛋白質都可以通過流式細胞術進行評估鑒定，在遺傳分析PIDs中，可以快速、準確的診斷。并且成本相對較低，在醫學研究中具有重要的應用價值[10]。

1.4.2 生物學 Shashanka S等對應用流式細胞術提高產油微生物在生物處理中的作用，以及流式細胞術在產油微生物方面取得的進展進行了綜述。通過大量前人的研究結果說明，在各種高通量篩選細胞的方法中，流式細胞術可操作性最好，還可以實現同時測量單個細胞水平上的生理特征和特定化合物的積累，且有希望從群體中分離出具有特定表型的細胞[11]。陳哲等通過流式細胞儀和 SCoT 分子標記分別鑒定了 14 種荔枝品種的基因組大小及親緣關系，流式細胞儀測定結果顯示‘晚浦’、‘懷枝’和‘白糖罌’和‘井崗紅糯’基因組大小相近，荔枝品種間親緣關系與嫁接親和性具有一定的相關性。該研究將為荔枝砧木的篩選及嫁接親和力早期鑒定提供理論依據[12]。李雯雯等應用流式細胞儀對野杏的細胞倍性和DNA含量進行了鑒定，結果發現供試野杏均為二倍體；該研究還篩選出了最適合杏的解離液——MgSO4-LB01混合液。為杏屬植物基因組學和遺傳進化研究提供基礎數據[13]。王婷婷等通過比較離心和不離心，碘化丙啶(Propidium iodide，PI)和4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)對流式細胞儀檢測結果的影響。結果表明，離心的懸浮液中目的細胞比不離心的懸浮液中目的細胞少；染料DAPI與PI的染色效果無明顯差異。根據上述結果，初步建立起一套利用流式細胞術鑒定馬鈴薯倍性的方法，該方法樣品需求量小，步驟簡單，快速準確，是鑒定馬鈴薯染色體倍性的理想方法[14]。羅智等應用流式細胞儀分析了‘冬棗’的5個自然變異材料，結果顯示，5個自然變異材料均為二倍體，同時評價了其果實形態、果實營養、物候期以及 DNA 指紋，發現變異1號屬于優良大果變異，變異3、4、5號為晚熟變異。這項研究為今后‘冬棗’遺傳育種工作提供了理論基礎[15]。陳敏敏等采用流式細胞儀鑒定了百合的倍性，同時發現采用Kiwifruit buffer 解離液解離、400 目濾膜過濾,并進行 1 次離心后流式細胞儀鑒定百合倍性的結果更加精準，且應用優化后的流式細胞術快速的鑒定出了百合的四倍體，這項研究為百合倍性研究提供了理論基礎[16]。吉乃喆等利用流式細胞術結合染色體壓片對后代進行倍性檢測，得到三倍體。結果顯示，‘春水綠波’、‘羽士妝’不僅可以作為親本或者中間材料將其中的一些優質基因傳遞到現代基因庫中，而且還為后續三倍性育種研究提供理論基礎[17]。

2 流式細胞儀在植物種質鑒定上的應用

植物種質資源是極其珍貴的農業遺產與自然資源。如今，自然資源減少，生態環境破壞以及新品種及雜交種不斷推廣，古老品種逐漸被替代，導致某些重要遺傳資源瀕臨消失。一旦環境氣候發生變化，或者出現新病害和蟲害，大面積推廣新品種地區將會面臨毀滅性的損失。人們已經意識到植物種質資源逐漸流失后帶來的嚴重影響，特別是在植物育種工作中，如果沒有相應的種質資源，就無法實現突破性成就。隨著流式細胞儀功能的不斷完善，其用途也越來越廣泛。目前，應用流式細胞術快速鑒定植物種質資源的倍性，為植物種質資源的保護及后期育種打下了基礎。

閆東玲等應用流式細胞術檢測了東北地區 6 種主要越桔屬(Vaccinium)植物的染色體倍性，結果發現有3種為四倍體，分別是篤斯越桔、紅豆越桔和朝鮮越桔；2種為二倍體，高山篤斯越桔和小果蔓越桔；1種為六倍體，大果蔓越桔。該研究將為中國越桔屬植物資源的遺傳學評價以及種質資源開發利用等提供重要的科學依據[18]。許蕾等采用流式細胞術，鑒定了鴨茅染色體倍性，鴨茅遺傳背景研究及多倍體材料的創制提供技術支撐，加快育種進度，鴨茅遺傳背景研究和種質資源利用建立依據，同時為遠緣雜交及多倍體育種提供便利。[19,20]田路明等采用流式細胞儀鑒定了21種梨種質資源的倍性，結果新發現了9份三倍體種質，分別為‘細皮梨’‘黑酸梨’‘冀蜜梨’‘世紀梨’‘敦煌香水梨’‘Beure Bosk’ ‘William Laspave’‘Yakumo’‘Butirra Rosata’；為梨種質資源的創新和開發利用提供參考[21]。閆蕊等采用流式細胞儀鑒定了97份油茶種質資源的染色體倍性，結果表明，其中倍性為二倍體的有29 份，倍性為四倍體的有58 份，倍性為六倍體的有9 份；并結合了SSR-PAGE 和 SSRseq方法，校正了8個二倍體為四倍體。該研究發現將三種技術結合能快速準確的鑒定出多倍體植物的倍性，為油茶種質資源的充分利用提供了理論基礎[22]。李偉強等采用流式細胞儀對8 份三倍體候選種質材料進行倍性鑒定，發現編號為 1346 的種質材料為三倍體，其余 7 份種質材料疑似為非整倍體。這為今后大量篩選多倍體種質資源提供了重要依據[23]。閆佼利用流式細胞術完成了183份栽培香蕉和野生香蕉以及雜交后代的倍性分析，有69個二倍體,91個三倍體,23個四倍體，為品種選育工作提供分子鑒定依據。也通過實驗發現,利用IRAP可以進一步研究香蕉種質資源的遺傳多樣性[24]。

朱敏等研究利用流式細胞儀分別測定鳶尾、射干和巴西鳶尾新鮮葉片的基因組大小。研究表明：3種鳶尾科藥用植物的基因組較為復雜，射干屬和鳶尾屬基因組相差較大，同屬植物鳶尾和巴西鳶尾的基因組大小差異較小。通過該項研究，為傳統藥用植物射干屬和鳶尾屬種質資源、品種鑒定和基因組研究提供參考[25]。謝卓宓等通過對比研究，通過流式細胞儀鑒定了9種金線蓮種質均為4倍體，且相互的親緣關系也較近。這為為進一步大范圍開展金線蓮不同遺傳資源親緣關系研究提供了技術依據，同時，也為金線蓮的優良資源篩選和品種鑒定奠定基礎[26]。呂順利用 FCM 技術分析 169 份香蕉種質資源及雜交后代的倍性，為香蕉的遺傳進化、系統分類研究以及香蕉的雜交育種提供基礎[27]。張燕梅等利用流式細胞術與常規檢測方法相結合，檢測了25份劍麻種質資源的倍性及農藝性狀，研究結果顯示，二倍體14份，三倍體2份，四倍體5份，五倍體2份，粵西 75、六倍體1份，混倍體1份。且不同種質資源的農藝性狀存在顯著差異。該研究為劍麻種質資源的鑒定、保存和推廣應用提供參考，為劍麻雜交育種提供理論依據[2]。郭計華等利用流式細胞術對11份香蕉種質資源進行分析，從細胞學層面上揭示了不同基因組類型香蕉種質的真實倍性。這種方法不僅能更好地反映香蕉種質資源之間的遺傳特征，而且還可以為今后香蕉種質的基因組學、物種分類以及種群進化等相關研究提供支撐[28]。劉昔輝等利用流式細胞儀鑒定了甘蔗及其近緣屬的倍性。結果表明，倍性最低的為芒屬的芒，其倍性為 1.4；倍性最高的是印度種的盤沙鞋，為 16.8，說明甘蔗是一種遺傳背景復雜的非整倍體植物。該研究結果可用于指導甘蔗雜交組合的配置，能夠有效的開發利用其種質資源[29]。王磊利用流式細胞儀測定了中國各地63份生姜種質資源的倍性，在此基礎上，建立了生姜細胞懸浮系等生物育種技術體系，為創新生姜種質材料和新品種的選育提供有力的保證[30]。張靖國等采用流式細胞術較為系統全面地對國家果樹種質武昌砂梨圃中收集保存的466份砂梨種質進行倍性鑒定, 明晰了中國砂梨基于染色體水平的多樣性,為砂梨多倍體育種和起源進化等研究提供依據[31]。

Burson B.L等采用流式細胞術測定了568份黃樟草種質資源，研究表明，308份是四倍體，139份是五倍體，20份是六倍體，2份是七倍體，99份為非整倍體。該研究不僅明確了568份黃樟草種質資源的倍性，而且還為今后黃樟草種質的創新及開發利用提供了理論基礎[32]。Tian L利用流式細胞儀對毛里求斯的相關種質資源進行了倍性檢測，并建立了一套可靠的SSR標記物。結果顯示，毛里求斯種質資源的遺傳關系與地理起源基本一致，也為為毛里求斯茅屬植物的品種鑒定和遺傳多樣性、多倍體化和馴化提供新的理論依據[33]。Postman J等利用流式細胞術是對1284份基因庫的梨種質幼葉組織進行倍性鑒定，研究發現其中有一個歐洲品種是四倍體，有三個亞洲品種是三倍體。這項研究明確了梨種質的倍性，不僅可以有效的幫助種植者避免使用三倍體不育花粉，有效的提高了育種的效率，而且還有助于該種質資源遺傳圖譜的建立以及今后的開發利用[34]。Metin T溴草種質資源的DNA含量和倍性測定通過流式細胞術,用普通二倍體做對照，測定發現不同倍性水平的溴草種質資源[35]。Brummer等流式細胞術測定紫花苜蓿種質資源的倍性，研究結果發現，20分之三紫花苜蓿屬二倍體。并且通過流式細胞儀確定了之前采用根尖染色體計數評估倍性存在一些不準確性，說明了流式細胞儀比根尖染色體計數法更快捷、更準確，為植物種質資源倍性研究人員提供了有力、可靠的技術支撐[36]。

3 結語

近年來，隨著流式細胞儀組件的不斷更新，染色劑的不斷改進，流式細胞術已逐步應用于多個科學研究領域，可檢測指標逐漸增多，在植物倍性鑒定等方法上則具有其他技術不可替代的優勢。由于流式細胞儀檢測的指標對應的試驗方法各不相同，需要注意的事項也存在差異，因此，筆者所提供的試驗流程僅適用于檢測植物的倍性、DNA含量等生物信息。為此，今后在進行植物科學試驗時，針對待測樣品需要，設計相應的試驗方法，還需要不斷地實踐總結，積累經驗。總之，隨著相關研究的不斷深入，流式細胞術涉及到的試驗方法也會越來越成熟，應用范圍也會越來越廣泛，檢測結果也會更加準確。