雞蛋清水解物對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚的改善作用

王 玉，劉采云

（1.厚德食品股份有限公司上海第一分公司，上海 201100；2.上海理工大學食品科學與工程研究所，上海 200082）

疲勞是持久或過度勞累后造成的身體不適及工作效率減退的現象[1]。長期以來，眾多學者期望能尋找到一種安全、有效、無毒副作用的方法來有效延緩疲勞的發生和加速疲勞的消除[2]。

雞蛋清蛋白質氨基酸模式與人體最接近，生物利用率高，被認為是蛋白質的理想來源。蛋清蛋白經過一種或多種酶水解后形成具有生物活性的肽段，可在食品工業和醫藥行業方面發揮極大作用[3-4]。目前，發現的雞蛋中的生物活性肽包括降血壓肽、抗菌肽、抗氧化肽、免疫調節肽和促進腦部健康肽等[5-9]。

斑馬魚是一種新型模式脊椎動物，具有繁殖能力強、生殖周期短、胚胎透明、能在顯微鏡下進行實時觀察等特點。其基因與人類基因有著87%的相似性，它們的編碼蛋白結構相似而且在生物體內發揮類似的功能，被美國食品藥品監督管理局列為繼人和嚙齒類鼠之后的第三大模式生物，已廣泛應用于生命科學研究[10-11]。

利用行為分析儀測定斑馬魚的運動總距離，以統計學意義確定了HEpep 對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動的改善作用，旨在探索雞蛋清水解物的新的應用方向。

1 材料與方法

1.1 原料

斑馬魚（野生AB 系）；HEpep，厚德食品股份有限公司提供；亞硫酸鈉、NaOH 溶液、檸檬酸，阿拉丁試劑（上海） 有限公司提供；中華跌打丸，廣西梧州制藥（集團） 股份有限公司提供；乳酸測定試劑盒，南京建成生物工程研究所提供。

1.2 主要儀器設備

V3 行為分析儀，ViewPoint Life Sciences 產品；SPX-250B-Z 型生化培養箱，博迅實業有限公司產品；Waters 1525 型高效液相色譜儀、L-8900 型全自動氨基酸分析儀，日本日立公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 HEpep 的制備工藝

HEpep 制備工藝：蛋清蛋白→酶解→酶解液→膜分離→濃縮噴霧干燥→蛋清蛋白肽。

1.3.2 HEpep 分子量大小的測定

HEpep 分子量大小的測定采用Waters 1525 高效液相色譜儀（配2487 紫外檢測器和Empower 工作站GPC 軟件），色譜柱為TSKgel 2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流動相為乙腈/ 水/ 三氟乙酸= 45/55/0.1（V/V/V），檢測波長為220 nm，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃。

1.3.3 HEpep 氨基酸含量的測定

氨基酸含量選用日立L-8900 全自動氨基酸分析儀測定。

1.3.4 斑馬魚仔魚的準備

斑馬魚均飼養于28 ℃的養魚用水中（水質：每1 L 反滲透水中加入200 mg 速溶海鹽，電導率為480～510 μS/cm，pH 值為6.9～7.2，硬度為53.7～71.6 mg/L CaCO3），試驗動物使用許可證號為：SYXK（浙） 2012-0171。飼養管理符合國際AAALAC 認證的要求。

野生型AB 品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后4 d（4 dpf），共180 尾，每試驗組為30 尾，用于確定HEpep 抗疲勞作用的最大檢測濃度（MTC）。野生型AB 品系斑馬魚，以自然成對交配繁殖方式進行。年齡為受精后4 d（4 dpf），共180 尾，每試驗組為30 尾，用于HEpep 抗疲勞作用評價。

1.3.5 確定HEpep 的最大檢測濃度（MTC）

隨機選取180 尾受精后4 d（4 dpf） 野生型AB品系斑馬魚，每孔（試驗組） 均處理30 尾斑馬魚，分別水溶給予HEpep 質量濃度250，500，1 000，2 000，4 000 μg/mL，同時設置正常對照組（即養魚用水處理斑馬魚），每孔（試驗組） 容量為5 mL，置于28 ℃培養箱中培養1～5 d。試驗結束后，觀察記錄斑馬魚的死亡數量和毒性情況，確定HEpep 對斑馬魚的最大檢測濃度（MTC）。

1.3.6 HEpep 對斑馬魚運動的影響

隨機選取180 尾受精后4 d（4 dpf） 野生型AB 品系斑馬魚，每孔（試驗組） 均處理30 尾斑馬魚，分別水溶給予HEpep 質量濃度111，333，1 000 μg/mL，陽性對照藥中華跌打丸1 mg/mL，同時設置正常對照組（即養魚用水處理斑馬魚） 和模型對照組，每孔（試驗組） 容量為5 mL。28 ℃培養箱中培養1～5 d后，除正常對照組外，其余試驗組均用8 mg/mL 亞硫酸鈉處理5 d 斑馬魚20 min，以誘發斑馬魚疲勞模型。

HEpep 和亞硫酸鈉共同處理斑馬魚20 min 后，每個試驗組隨機選取10 尾斑馬魚，利用行為分析儀，測定斑馬魚的運動總距離（S），以統計學意義評價HEpep 對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動的改善作用。

HEpep 對斑馬魚運動能力改善作用計算公式如下：

式中：S——供試品組；

SM——模型對照組；

SC——正常對照組

1.3.7 運動后斑馬魚乳酸含量測定[12]

乳酸測試盒按步驟加樣后，采可見光分光光度計測其吸光值（波長530 nm），制作乳酸含量的標準曲線。在低溫環境中，將運動后的模型斑馬魚、陽性對照組（用中華跌打丸處理） 和HEpep 3 個質量濃度（111，333，1 000 μg/mL） 處理后的斑馬魚用10倍生理鹽水制成勻漿液，離心后取上清液稀釋5 倍后測其吸光值（波長530 nm），通過標準曲線計算得出的勻漿稀釋液乳酸濃度（mmol/L），換算后即得斑馬魚體內乳酸濃度。

1.3.8 數據處理

用方差分析和Dunnett's T- 檢驗進行統計學分析，p＜0.05 表明具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 HEpep 的分子量

HEpep 的凝膠滲透色譜圖見圖1，HEpep 的凝膠滲透色譜分析結果見表1。

圖1 HEpep 的凝膠滲透色譜圖

表1 HEpep 的凝膠滲透色譜分析結果

從表1 可知，分子量為668，303 的肽段含量最大，分別占25.22%，48.05%。

2.2 HEpep 的氨基酸含量檢測結果

HEpep 的氨基酸含量檢測結果見表2。

對雞蛋清水解物HEpep 的氨基酸含量進行分析可以看出，HEpep 中必需氨基酸占氨基酸總量的36%，而且必需氨基酸是非必需氨基酸的0.56 倍。根據FAO/WHO，理想蛋白模式中，必需氨基酸含量應該占氨基酸總量的40%左右，且必需氨基酸含量應是非必需氨基酸含量的0.60 倍。由此可以得出HEpep的氨基酸模式非常接近FAO/WHO 對理想蛋白質的規定，而且HEpep 中氨基酸含量高達127.68 mg/g，說明HEpep 可以作為一種理想的蛋白質來源。另外，HEpep 中支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸）的含量高達15.93 mg/g。

表2 HEpep 的氨基酸含量檢測結果

2.3 HEpep 質量濃度對斑馬魚死亡率的影響

HEpep 處理后斑馬魚“質量濃度-死亡率”試驗結果（n=30） 見表3。

表3 HEpep 處理后斑馬魚“質量濃度-死亡率”試驗結果（n=30）

表3 表明了HEpep 處理后斑馬魚“質量濃度-死亡率”的試驗結果。由表3 可知，HEpep 在250～1 000 μg/mL 下，未引起斑馬魚死亡，也未見其他明顯的毒性表型；然而在2 000 和4 000 μg/mL 下，分別誘發11/30 和30/30 尾斑馬魚死亡，死亡率分別為36.7%和100%，故確定HEpep 對斑馬魚抗疲勞作用的最大檢測質量濃度為1 000 μg/mL，因此抗疲勞作用正式試驗質量濃度設置為111，333，1 000 μg/mL。

2.4 HEpep 的抗疲勞作用評價

亞硫酸鈉可以與水中的溶解氧發生反應，造成環境中缺氧，斑馬魚在缺氧環境中造成疲勞，因此常用于疲勞造模[13]。運動耐力試驗是反映機體疲勞最直接、最客觀的指標，是機體運動過程中物質代謝和能量代謝的綜合體現[14]。

HEpep 對疲勞斑馬魚運動能力的影響（n=10）見表4，HEpep 對疲勞斑馬魚體內乳酸含量的影響(p＜0.05)（n=10） 圖2。

表4 HEpep 對疲勞斑馬魚運動能力的影響（n=10）

圖2 HEpep 對疲勞斑馬魚體內乳酸含量的影響(p＜0.05)（n=10）

陽性對照藥中華跌打丸由金不換、半邊蓮等數十種中草藥組成，具有消腫止痛、舒筋活絡、止血生肌、活血驅風的功效[15]。從表4 可知，模型對照組斑馬魚總運動距離（2 622 mm） 與正常對照組（6 505 mm） 比較，說明疲勞斑馬魚模型構建成功；陽性對照藥中華跌打丸組（1 mg/mL） 斑馬魚總運動距離為7 097 mm，與模型對照組比較其運動改善作用為115.2%。根據圖2 所示，中華跌打丸組斑馬魚運動后體內乳酸含量最低（0.003 mmol/g），與模型對照組比較（乳酸含量0.092 mmol/g），乳酸含量降低97%，說明中華跌打丸可顯著改善亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力，降低體內乳酸含量。此結果與高華等人[15]的研究結果一致，中華跌打丸能明顯延長小鼠負重游泳時間，降低運動后血清尿素氮的含量，加快運動后血清乳酸的消除速率，對緩解機體運動中的疲勞感有積極的作用[16]。

HEpep 質量濃度111，333，1 000 μg/mL 組斑馬魚總運動距離分別為5 439，3 280，2 697 mm，與模型對照組（2 622 mm） 比較，其運動改善作用分別為72.5%，16.9%，1.9%，HEpep 處理后斑馬魚運動后體內乳酸含量分別為0.034，0.075，0.087 mmol/g（見圖2），與模型對照組比較，乳酸含量分別降低63.2%，18.8%，5.1%。說明在試驗質量濃度條件下，HEpep 對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用，而且當HEpep 質量濃度為111 μg/mL時，該作用最明顯，乳酸含量降低率也最大。當HEpep質量濃度大于111 μg/mL 時（333 和1 000 μg/mL），對疲勞斑馬魚運動改善作用呈現減弱趨勢，運動后斑馬魚體內乳酸累積量也呈現上升趨勢。該結果提示HEpep 作為疲勞改善劑使用時，適宜質量濃度范圍為0～111 μg/mL，并非劑量越大越好。根據HEpep的GPC 分子量分析結果顯示，分子量668，303 的肽段占比最大，分別占25%，48%。研究發現，小分子肽在人體不需消化可直接吸收，能直接參與蛋白質的合成[17]。蛋清蛋白通過酶解作用也可產生具備抗氧化活性的氨基酸，包括半胱氨酸、蛋氨酸、色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸和組氨酸等[18]，可清除體內超氧陰離子和羥基自由基（·OH），維持機體氧化還原平衡[19]，降低疲勞感。根據表2 結果可知，HEpep 中具有抗疲勞功效的支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+纈氨酸） 含量高達15.93 mg/g，可能是HEpep 對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用的原因。

3 結論

雞蛋清水解物HEpep 中支鏈氨基酸（亮氨酸+異亮氨酸+ 纈氨酸） 含量豐富，高達15.93 mg/g。對于亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚，在111，333，1 000 μg/mL 的質量濃度條件下，其運動改善作用分別為72.5%，16.9%，1.9%，乳酸含量分別降低63.2%，18.8%，5.1%。HEpep 對亞硫酸鈉誘發的疲勞斑馬魚運動能力有明顯的改善作用，HEpep 作為疲勞改善劑使用時，適宜質量濃度范圍為0～111 μg/mL。