冬小麥免耕覆蓋與生物有機肥施用對土壤細菌群落的影響

王小玲,馬 琨,伏云珍,安嫄嫄,汪志琴,

1 寧夏大學西北土地退化與生態恢復國家重點實驗室培育基地,銀川 750021 2 寧夏大學農學院,銀川 750021 3 中國科學院生態環境研究中心,北京 100085

免耕是指不翻耕和擾動土壤,把作物直接播種到種床上,將前茬作物殘茬或草皮等覆蓋地表,僅播種一次田間作業的農作制度[1]。可以減少水土流失,穩定土壤結構[2-3],形成合理的土壤水、氣、熱三相比；在改善土壤微生態環境,促進土壤養分良性循環中起主要貢獻[4]。

土壤微生物是生態系統的重要組成部分,能夠參與土壤養分循環,分解等過程,對溫室氣體產生和環境污染物凈化起著重要作用[5]。近年來,大量研究證實,土壤微生物的數量、群落結構及多樣性是維持土壤健康和質量的重要因素[6]。因此,研究不同耕作措施下土壤微生物群落結構的演替規律,對選擇合理的種植措施和改善土壤生態功能具有重要意義。

目前關于不同農業管理措施下,土壤微生物群落結構及多樣性變化的研究結果仍存在差異[1,3]。如長期免耕或綠肥翻壓會增加土壤微生物數量,影響其多樣性[7]；保護性耕作施生物有機肥也能夠提高土壤細菌多樣性和生物量[8]。但,傳統耕作施化肥和有機肥卻對土壤細菌數量和群落結構的影響較小[9]。Yang等[10]研究結果顯示,免耕和秸稈還田能夠增加土壤有機碳含量,調控土壤微生物生長及群落結構多樣性,在提升土壤肥力和生產力方面有重要作用。

然而,以往研究更多關注的是耕作方式及施肥種類的差異對土壤生物生物量、酶活性和微生物呼吸作用等方面的影響,而同時采用免耕、覆蓋和生物有機肥施用等栽培管理措施對土壤細菌群落結構影響的研究鮮有報道。因此,本研究采用Illumina MiSeq高通量測序技術,對寧夏南部山區冬小麥連續3年免耕體系下土壤細菌群落群落結構組成和多樣性分布特征進行系統分析,探討不同處理措施下土壤細菌群落結構差異,明確耕作、覆蓋與施肥方式的交互作用是如何影響土壤細菌群落結構組成及其多樣性？為制定合理的農作制度提供理論支撐。

1 研究區域和方法

1.1 研究區概況

研究區位于寧夏固原市隆德縣沙塘鎮(35°21′ N,105°48′ E),如圖1所示：地處寧夏南部邊陲,六盤山脈以西,屬于黃土高原丘陵區。氣候類型為中溫帶季風區半濕潤向半干旱過渡性氣候,年均氣溫6 ℃,年均降水量410 mm,年均蒸發量1370 mm。海拔1720—2942 m,地勢東高西低,土壤質地主要以黑壚土為主。試驗前土壤基本理化性狀：有機質10.63 g/kg,全氮0.52 g/kg,堿解氮41.0 mg/kg,全磷0.65 g/kg,速效磷45.5 mg/kg,速效鉀170.5 mg/kg,pH 9.0。

圖1 研究區地理位置Fig.1 Location of the research area

1.2 試驗設計

本試驗于2015年春季開始,采用雙因素隨機區組設計。A因素為耕作方式：分為免耕覆蓋(N)、傳統耕作不覆蓋(T)2個水平；B因素為施肥方式：分為施生物有機肥(F)和不施生物有機肥(C),共4個處理,即免耕覆蓋+施生物有機肥(NF)、免耕覆蓋+不施生物有機肥(NC)、傳統耕作不覆蓋+施生物有機肥(TF)和傳統耕作不覆蓋+不施生物有機肥(TC),每個處理4次重復,小區面積3 m×4 m,共16個小區。于2015年—2018年9月種植冬麥(Triticumaestivum)‘藍天32號’。前茬作物為蠶豆(ViciafabaL)‘臨蠶6號’。2015年冬小麥種植前將蠶豆秸稈粉碎與3000 kg/hm2脫粒的小麥穎殼均勻覆蓋于免耕處理土壤表面,后續試驗不再覆蓋任何材料。冬小麥播種量為375 kg/hm2,每小區播種12行。施肥處理的小區僅施生物有機肥(黃腐酸≥12%,有機質≥40%,巨大芽孢桿菌+膠凍樣類芽孢桿菌≥0.5億/g,凈含量40 kg/袋),施用量折合純氮(N%)90 kg/hm2,純磷(P2O5%)為19.67 kg/hm2、純鉀(K2O%)為18.58 kg/hm2。NF處理的小區,生物有機肥隨冬小麥種子條施于播種溝內,TF處理隨播前耕翻施入土壤。在返青期,將前者的田間雜草齊地表割掉,覆蓋在冬小麥行間；后者雜草連根拔除,扔出田外。

1.3 樣品采集

2018年7月在試驗區采樣,按照“S”形隨機多點混合取樣,采集耕層0—20 cm土壤樣品,每個小區隨機采集5個樣點混勻為1份,共獲得16份樣品。樣品采集后去除新鮮土樣中可見植物殘體及土壤動物,按四分法取1 kg土樣放入采樣袋中,冰盒帶回實驗室。一部分自然風干后用于測定土壤養分；另一部分保存在-80冰箱,用于土壤細菌多樣性測定。

1.4 試驗方法

1.4.1土壤理化性質測定

土壤含水量采用烘干法,土壤pH值采用PHSJ-4F pH計(上海儀電科學儀器股份有限公司)測定(土水比1:5)；土壤全碳(TC)和總氮(TN)采用碳氮分析儀(Elementar Vario MAX)測定；土壤微生物生物量碳(SMBC)采用氯仿熏蒸—0.5 mol/L K2SO4提取；土壤全磷(TP)和速效磷(AP)采用鉬銻抗比色法；堿解氮(AN)采用堿解擴散法；速效鉀(AK)采用NH4OAc浸提-火焰光度法[11]。

1.4.2DNA提取和高通量測序

采用Fast DNA SPIN kits試劑盒(MP Biomedicals,USA),按照說明書進行土壤微生物總DNA提取,提取后使用Nanodrop 2000進行DNA濃度和純度的測定,并用0.8% 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質量。最后利用細菌16S rDNA基因的V3+V4區域進行擴增,引物序列為515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和907R(5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′)。采用50 μl擴增體系,反應程序為：98 ℃ 預變性2 min,98 ℃變性15 s,55 ℃退火30 s,72 ℃ 延長30 s,72 ℃終延伸5 min,10 ℃持續25—30個循環。PCR結束后,引入Illumina MiSeq 橋式PCR兼容引物進行第二輪擴增,使用PicoGreen dsDNA Kit 分析試劑盒(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)對回收的DNA精確定量[12],最后將PCR產物委托上海派森諾生物科技股份有限公司進行Illumina MiSeq 測序。

1.4.3統計分析

高通量測序數據利用QIIME(Quantitative Insights Into Microbial Ecology, v1.8.)和R(v3.2.0)軟件,調用USEARCH序列比對工具,對優質序列按97%相似度水平的OTUs(Operational Taxonomic Units)進行分類學分析。采用Mothur軟件對全部有效序列進行OTU聚類統計,繪制韋恩圖(Venn圖)。根據物種分類信息繪制物種豐度熱圖。利用Mothur軟件[13-14]計算多樣性指數(Simpson、Shannon、Chao1和ACE)。通過UniFrac軟件進行NMDS分析,繪制樣本聚類樹[15]。采用DPS(7.05)軟件對土壤理化性質、作物產量等數據進行方差分析(Duncan′s法多重比較法,顯著水平設為0.05)。土壤微生物主成分分析(PCA)在多元統計分析軟件Canoco 5.0中進行。Origin 8.0繪制降雨量點線圖。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質分析

不同處理土壤理化性質如表1所示。土壤含水量、速效鉀、堿解氮、總碳和總氮含量整體表現為免耕覆蓋處理明顯高于傳統耕作處理,而土壤pH、C/N比則表現為傳統耕作處理顯著高于免耕處理。方差統計分析顯示,與不施用生物有機肥處理相比,施用生物有機肥影響了不同處理間的土壤理化性質,但差異不顯著；而耕作措施卻顯著改變了不同處理間土壤pH、C/N比、全氮含量(F=6.565,P=0.031*；F= 49.391,P=0.0001**；F=19.871,P=0.002**)。同時,不施用生物有機肥時,土壤pH、AP、C/N 比和SMBC 表現為TC>NC,其余土壤理化性狀在各處理間均呈現NC>TC,其中SMBC和TN含量分別增加了94.04%和15.38%。施用生物有機肥時,SMBC、AP、AN、TC和TN含量均呈現NF>TF；尤以SMBC和AP含量增加幅度最大,分別為114.74%和21.87%；而C/N比和AK的含量與之相反,分別降低了5.60%和7.04%。

表1 不同處理土壤理化及生物學性狀分析Table 1 Analysis of physical and chemical and biological characteristics of soil under different treatments

2.2 細菌群落結構多樣性及測序數據分析

通過對土壤DNA基因組序列分析發現(表2),4種處理總共獲得785688條有效序列,其中TC、TF、NC和NF處理分別獲得細菌16S rRNA的平均序列數48607、48101、52687、47028條。對測序獲得的序列采取隨機抽樣方法,并基于每個深度下抽取到的序列數及對應的OTU數繪制Specaccum物種累積曲線(圖2),結果表明,土壤樣品的Specaccum物種累積曲線在樣本數大于10時漸漸趨于平緩,說明不同處理土壤所測的序列庫容能夠較好反映土壤細菌群落的物種數量,故測序數據基本合理。

圖2 物種累積曲線圖Fig.2 Species accumulation curve of different soil samples

表2 土壤細菌測序數據及多樣性指數分析Table 2 Sequencing data and diversity index analysis of soil bacteria

2.3 細菌OTU統計及多樣性分析

Venn圖能夠直觀反映不同處理間土壤細菌群落OTUs 組成的差異性及重疊關系[16]。由圖3可知,OTU水平上,TC、TF、NC和NF 4個處理中的OTU數分別為6252、5827、5867個和5936個,其中共有OTU數為3166個,特異性OTU數分別為802、568、573個和621個,表現為TC>TF>NC>和TF,且共有OTU數(3166) 是4種處理中特異性細菌OTU數的4—6倍。此外,各處理特異性OTU數以TC最大,NF次之；相比NC處理,NF中的OTU數呈現增加趨勢；相比TC,TF中OTU數呈降低趨勢,這說明傳統耕作不覆蓋施用生物有機肥處理(TF)對土壤細菌群落OTU可能會產生抑制作用,而免耕覆蓋施生物有機肥處理(NF)在一定程度上則起到促進作用。

圖3 OTUs分布的維恩圖 Fig.3 OTUs Venn distribution diagram of soil bacterial communities TF: 傳統耕作不覆蓋施生物有機肥Conventional tillage without mulching, and bioorganic fertilizer; TC：傳統耕作不覆蓋不施生物有機肥Conventional tillage without mulching, and no bioorganic fertilizer; NF: 免耕覆蓋施生物有機肥No-tillage, mulching and bioorganic fertilizer; NC: 免耕覆蓋不施生物有機肥No-tillage, mulching no bioorganic fertilizer

通過分析土壤樣品,計算得到土壤細菌Alpha多樣性指數(表2)。結果顯示,不同處理下ACE指數為4092.07—4579.71,Chao1指數為3627.36—4209.83,香濃指數為10.42—10.55,辛普森指數為0.997—0.998。當耕作覆蓋和施用生物有機肥兩因素交互作用時,土壤細菌豐富度指數(ACE和Chao指數)表現為TC>NF>NC>TF；而多樣性指數(Simpson和Shannon指數)卻呈相反趨勢,表現為：NF>NC>TC>TF。與TF處理相比,NF處理中,shannon指數和Chao指數分別增加了12.5%和7.95%。而Simpson 指數降低了2.73%。整體上,傳統耕作在一定程度上增加了土壤細菌群落的多樣性指數,降低了豐富度指數。

2.4 細菌門水平相對豐度

通過對高通量測序結果進行分析,從4個處理中獲得土壤細菌菌群分屬于27門、86綱、125目、213科和315屬。在門水平上,共獲得34個類群(包括未鑒定類群和其他)。將相對豐度< 1%的類群歸為其他,得到20個類群(圖4)。其中放線菌門(Actinobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和酸桿菌門(Acidobacteri)為優勢菌門(相對豐度≥1%),其相對豐度分別為26.90%、26.20%、15.80%和13.50%。而芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospira)、浮霉菌門(Planctomycetes)和擬桿菌門(Bacteroidetes)等是非優勢菌門(相對豐度≤1%)。由圖4可知,耕作和施肥兩因素均對土壤細菌門水平相對豐度產生了影響,其中綠彎菌門和酸桿菌門的相對豐度在不施用生物有機肥處理中均表現為NC>TC；而施用生物有機肥時,綠彎菌門的相對豐度呈現NF

圖4 門水平上土壤細菌群落結構組成Fig.4 The composition of soil bacterial community at phylum level

通過熱圖的顏色變化梯度和相似性能夠驗證物種群落組成的差異性和相似性。從土壤細菌的前50個屬的熱圖分析發現(圖5)。4種處理中的細菌群落結構均發生了顯著變化。其中TF處理中,綠彎菌門的玫瑰彎菌屬(Roseiflexus)的相對豐度較高；NF處理下放線菌門中的類諾卡氏菌屬(Nocardioides)和土壤紅桿菌屬(Solirubrobacter)為優勢菌屬；TC處理的變形菌門中(Proteobacteria)的鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Nordella屬、慢生根瘤菌屬(Bradyrhizobium),酸桿菌門中的芽孢桿菌屬(Blastocatella)具有較其他處理更高的豐度分布特征；NC處理中Haliangium屬和擬孢囊菌屬(Kibdelosporangium)占據較高豐度。此外,TF和NF、TC和NC聚為一類,說明在免耕和施用生物有機肥的交互作用下,主要以是否施用生物有機肥為主導因素。

圖5 各處理土壤優勢細菌在屬水平的群落熱圖分析Fig.5 Heat map analysis of the main bacteria at the genus level in each treatment soilAcidobacteria: 酸桿菌門;Actinobacteria： 放線菌門; Gemmatimonadetes: 芽單胞菌門; Chloroflexi: 綠彎菌門; Proteobacteria: 變形菌門; Nordella屬; 鞘氨醇單胞菌: Sphingomonas; 慢生根瘤菌: Bradyrhizobium; 芽孢桿菌屬: Blastocatella; 硝化螺菌屬: Nitrospira; H16; Bryobacter; Acidibacter屬; 芽單胞菌屬: Gemmatimonas; RB41; Aeromicroiumshu屬; Stenotrophobacter; Variibacter; CL500-29_marine; OM27_clade; 紅游動菌屬: Rhodoplanes; Ilumatobacter屬; Gaiella屬; Actinophytocola屬; 未鑒定的放線菌屬: Actinobacteria_unidentified; 紅色桿菌屬: Rubrobacter; 玫瑰彎菌屬: Roseiflexus; 假節桿菌屬: Pseudarthrobacter; 土微菌屬: Pedomicrobium; Kibdelosporangium; Haliangium; 韓國生工菌屬: Kribbella; 未鑒定的酸桿菌屬: Acidobacteria_unidentified; 指孢囊菌屬: Dactylosporangium; 倫茨氏菌屬: Lentzea; 游動放線菌屬: Actinoplanes; Virgisporangium; 壤霉菌屬: Agromyces; 芽球菌屬: Blastococcus; 地嗜皮菌屬: Geodermatophilus; Skermanella; Candidatus_Alysiosphaera屬; 假諾卡氏菌屬: Pseudonocar Haliangiumdia; 鏈霉菌屬: Streptomyces; 小單孢菌屬: Micromonospora; 分枝桿菌屬: Mycobacterium; Iamia 屬; Parviterribacter; 土壤紅桿菌屬: Solirubrobacter; 類諾卡氏菌屬: Nocardioides; Devosia; Microvirga屬; 纖維菌屬: Cellulomonas

2.4.1細菌門水平相對豐度差異性分析

不同處理中土壤細菌群落在門水平上的相對豐度差異性分析結果表明(圖6)。土壤細菌中的酸桿菌門(Acidobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)和螺旋體菌門(Saccharibacteria)的相對豐度在TF與NC處理間有顯著差異(P=0.046、P=0.018、P=0.013和P=0.016)；放線菌門(Actinobacteria)、裝甲菌門(Armatimonadetes)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度在NF與NC處理間也有顯著差異(P=0.042、P=0.023、P=0.032和P=0.040)。當耕作和施用生物有機肥兩因子交互時,硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)的相對豐度在TF和NF中均達到顯著水平(P=0.0212)；而變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度在TF與TC處理間有顯著差異(P=0.026)。此外,芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)在NF與NC之間也達到極顯著水平(P=0.005)。由此說明,施用生物有機肥會顯著影響土壤細菌群落結構在門水平上差異。

圖6 不同處理土壤細菌群落組成在門水平的差異分析Fig.6 The differential analysis of soil bacterial community of soil samples of the different treatments based on the phylum level

2.4.2不同處理下土壤細菌群落結構與環境因子的關系

基于R軟件,采用非度量多維尺度分析(NMDS,Nonmetric multidimensional scale analysis)來反映土壤細菌群落的β多樣性(Stress=0.106)。如圖7顯示,不同處理對土壤細菌群落β多樣性產生了明顯影響,且形成了不同的群落空間分布結構。在不施用生物有機肥處理時,TC和NC處理的細菌群落在空間分布上相對較集中；但當施入生物有機肥后,TC和TF、NC和NF處理卻出現明顯分離,差異較大。

圖7 不同處理土壤細菌非度量多維尺度分析(NMDS)分布 Fig.7 The distribution of soil bacteria in different treatments was analyzed on a nonmetric multidimensional scaleTF: 傳統耕作不覆蓋施生物有機肥Conventional tillage without mulching, and bioorganic fertilizer; TC：傳統耕作不覆蓋不施生物有機肥Conventional tillage without mulching, and no bioorganic fertilizer; NF: 免耕覆蓋施生物有機肥No-tillage, mulching and bioorganic fertilizer; NC: 免耕覆蓋不施生物有機肥No-tillage, mulching no bioorganic fertilizer

利用主成分分析發現(圖8a),土壤細菌的豐富度指數(ACE和Chao1指數)和多樣性指數(Simpson和Shannon指數)與土壤pH、速效磷和C/N比成正相關,與土壤全氮、堿解氮、含水量、有機碳和微生物生物量碳成負相關。對細菌群落分布的共同解釋為88.57%。其中在門水平分類學組成中,放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對豐度均與土壤含水量、堿解氮、有機碳、微生物生物量碳成正相關,與土壤pH、速效鉀呈負相關(圖8b)；擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)的相對豐度與土壤速效鉀和全磷成正相關,與微生物生物量碳、C/N比和有機碳含量均呈負相關。芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和酸桿菌門(Acidobacteria)與土壤速效鉀、C/N比呈正相關；其中非優勢門浮霉菌門(Planctomycetes)與土壤C/N、pH和堿解氮成正相關,與土壤速效鉀、含水量成負相關。主成分1和主成分2分別占85.68%和9.37%,兩個排序軸累計變量能在95.05%上解釋細菌群落結構組成的差異性。另外,細菌門水平分類學組成與第一、二排序軸之間的相關性較高,其中pH和土壤微生物生物量碳(SMBC)分別是酸桿菌門和放線菌門的主要驅動因子。

圖8 細菌多樣性指數及門水平類群分布與土壤理化性狀間的多元分析(PCA)Fig.8 Multivariate analysis of bacterial diversity index, the distributionof soil bacterial communities based on the phylum level between soil physical and chemical characteristicsActino: Actinobacteria 放線菌門；Proteo: Proteobacteria 變形菌門；Chloro: Chloroflexi 綠彎菌門；Acido: Acidobacteria 酸桿菌門；Gemm: Gemmatimonadetes 芽單胞菌門；Nitro: Nitrospirae 硝化螺旋菌門；Plancto: Planctomycetes 浮霉菌門；Bactero: Bacteroidetes 擬桿菌門；pH、TN、TP、AP、AN、AK和TOC、SWC、C/N ration、SMBC分別指土壤pH、全氮、全磷、速效磷、堿解氮、速效鉀和有機碳、土壤含水量、碳氮比、土壤微生物生物量碳；Chao1、ACE、Shannon、Simpson分別指Chao1指數、ACE指數、香濃指數和辛普森指數;圖中各形狀代表不同處理;NC(1—4)表示免耕、覆蓋和不施生物有機肥的4個重復; NF(1—4)表示免耕、覆蓋和施生物有機肥的4個重復;TC(1—4)表示傳統耕作、不覆蓋和不施肥的四個重復;TF(1—4)表示傳統耕作不覆蓋和施生物有機肥的四個重復

2.5 不同處理對冬小麥產量的影響

由表3可知,冬小麥的產量在4種處理中均有明顯差異。2016年表現為NF>TF>TC>NC。在傳統耕作不覆蓋和免耕覆蓋兩種處理中,以施用生物有機肥處理最明顯。其中NF處理冬小麥產量最高達到3031.25 kg/hm2。而2017和2018年,傳統耕作措施下,相比不施用生物有機肥處理,施用生物有機肥處理顯著增加了冬小麥產量(P<0.05),以2018年冬小麥產量增加最顯著,達到22.25%。在綜合因素影響下,尤以傳統耕作施用生物有機肥處理效果最佳。隨種植時間延長,無論是否施用生物有機肥,免耕覆蓋處理下冬小麥產量均呈降低趨勢,而傳統耕作處理卻呈增加趨勢。分析認為這可能與當年氣候條件、耕作措施和施肥因子等綜合因素有關。

表3 不同處理對冬小麥產量的影響Table 3 The Effects of different treatments on yield of winter wheat

為進一步分析冬小麥產量與土壤細菌優勢菌群的關系,將細菌前8門優勢菌群與冬小麥產量作相關分析,結果表明(表4)：冬小麥產量與土壤細菌群落相對豐度均無相關性；而土壤硝化螺旋菌門(Nitrospirae)和芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)與酸桿菌門(Acidobacteria)顯著正相關(P<0.05)；放線菌門(Actinobacteria)與土壤酸桿菌門(Acidobacteria)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和硝化螺旋菌門(Nitrospirae)均呈極顯著負相關；變形菌門(Proteobacteria)與綠彎菌門(Chloroflexi)也呈極顯著負相關(P<0.01),說明土壤微生物功能群落之間存在更多的競爭關系。

表4 作物產量與土壤細菌豐度Pearson相關性Table 4 Pearson correlation between crop yield and soil bacterial abundance

3 討論

3.1 不同處理對土壤理化性質及冬小麥產量的影響

有研究證實,土地利用方式不同,會造成土壤理化性質出現差異[17]。本研究中,持續冬小麥免耕、覆蓋和施用生物有機肥均能顯著增加土壤養分含量,降低土壤pH,提升土壤全氮、總碳含量,這與Duineveld等[18]研究結果一致。與TC和NC處理相比,TF和NF處理均顯著增加了土壤總碳和全氮含量,分析認為生物有機肥是一種腐熟的肥料,施入后能為土壤微生物提供大量的碳源[19]。且在不覆蓋、不施生物有機肥處理的土壤中,作物根茬是有機質的主要來源,同時,施入生物有機肥后,因外源有機物的輸入,也會導致土壤有機質積累[20]。另一方面,當免耕、覆蓋與施用生物有機肥交互作用時,不但有小麥穎殼、田間生草覆蓋分解后的有機物質,還有生物有機肥中的營養元素進入土壤,為作物提供養分需求。因此,在一定程度上,土壤微生物對根茬的降解速度發生改變,提高了作物根茬的殘留量[21],減少了土壤有機質的氧化和礦化速度,最終提高了土壤中總碳的含量[22]。

免耕覆蓋作為保護性耕作技術的關鍵技術措施之一,對培肥土壤、提高土壤水分利用率,保證旱區作物高產和穩產具有重要意義。有學者[23]指出,免耕和秸稈還田等保護性措施在一定程度上會影響小麥、水稻幼苗生長,降低作物產量。本研究中,第一年,冬小麥經濟產量以NF處理最高,且隨種植年限的增加,相比傳統耕作,免耕處理產量出現大幅減產現象,尤其是2017年,差異最顯著。根據當地氣象資料顯示(圖9),2015年—2017年,研究區8—12月的總降雨量分別為191.6、128.7、252.5 mm,可判定作物播種后,2016年低降雨量導致苗期持續干旱,可能是影響2017年冬小麥產量降低的根本原因。另外,本研究中,相比傳統耕作,免耕處理土壤容重上、中、下層均增加,其中以10—15 cm耕層土壤容重增加最顯著,可能是引起土壤板結,造成水肥氣熱條件不協調,最終影響作物產量的另一因素。這與王峻等[24]的研究結果一致。此外,研究中,相比不施生物有機肥處理,兩種施肥處理(NF和TF)中,2016—2018年冬小麥的產量均高于不施生物有機肥處理,這說明,施用生物有機肥,具有增產作用,其機制主要是生物有機肥中含有的芽孢桿菌,適于生活在各種環境中,耐受性和穩定性極強,能夠促進土壤無效硅磷鉀的轉化,增加土壤硅磷鉀的供給,提高作物產量的能力導致[25],其深層原因還有待進一步探究。

圖9 2015—2018年研究區降雨量分布情況 Fig.9 Preipitationl distribution in the study area from 2015 to 2018

3.2 不同處理對土壤細菌Alpha多樣性的影響

土壤微生物作為評價土壤的重要生物學指標,因不同的農業管理措施,其群落結構發生變化,也會影響農業生態系統的物質循環和能量轉換[22]。如李雨澤等[26]研究發現,地膜覆蓋土壤細菌豐富度降低,秸稈還田細菌多樣性增加,而施用生物有機肥土壤細菌的多樣性也隨之增加[27]。本研究中,4種處理方式對土壤細菌群落多樣性指數(Simpson指數)和豐富度指數(Chao1指數)均產生了不同程度的影響。TF處理土壤細菌豐富度指數(ACE指數)提高,多樣性降低,而NF處理卻相反。分析認為這與傳統耕作措施,土壤頻繁擾動促進土壤碳源和氮源的轉化有關[28]。

土壤微生物多樣性往往受植被類型、作物種類、土壤質地、pH、水分和通氣等因素的影響[29]。相關研究發現,土壤pH和有機碳是影響不同混交林中土壤細菌多樣性的主要環境因子；全氮和含水量是影響沙地土壤細菌結構和多樣性的主導因子[30]。大量研究指出,土壤微生物在某種程度上,對干旱的響應較大,一定強度的干旱會提高土壤細菌群落結構多樣性,適宜的土壤水分條件則能為細菌生長繁殖創造良好條件,維持細菌群落結構多樣性[31-32]。這與本研究中土壤含水量與細菌多樣性指數和豐富度指數成負相關性的結果相似。此外,土壤pH 的變化也是引起不同管理制度中土壤細菌群落結構變化的另一主要貢獻因子[32]。

3.3 不同處理對土壤細菌群落結構組成的影響

Illumina MiSeq高通量測序技術的發展為微生物的研究提供了一個強大高效的平臺,能夠快速有效地分析土壤微生物的群落結構組成[33]。有學者[34]認為,土壤微生物群落結構的整體組成在不同生境中的差異可能較大,但優勢菌群基本相似。在本研究中,4種處理下土壤細菌優勢菌門均為放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門,相對豐度之和超過80%,但各處理中的相對豐度各有差異,這與以往的一些研究相似[35-36]。與傳統耕作處理相比,免耕覆蓋處理下,土壤酸桿菌門、放線菌門和變形菌門的相對豐度提高了30.17%—35.11%,這主要是是由于殘茬及生草覆蓋后,為微生物提生命活動提供了有機碳源,刺激了土壤微生物的活性,加快了自身的物質合成,使其豐度明顯增加[37]。其中,酸桿菌門在NF處理中相對豐度最高,這可能是免耕、殘茬及生草覆蓋后,植物根系分泌物導致土壤pH值下降[38](表1),促進了酸桿菌門的活動。也可能是施用的生物有機肥中含有的“巨大芽孢桿菌+膠凍樣類芽孢桿菌”,屬于芽孢桿菌屬,是一類硅酸鹽陽性細菌,能為土壤補入大量的有益微生物,在作物根部形成有益菌群,抑制土壤有害及致病微生物的繁殖等,在一定程度上,可能為土壤中優勢菌群的繁殖創造了有利條件[39]。

此外,本研究還發現具有降解土壤污染物功能的芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)和將土壤中的亞硝酸氧化為硝酸鹽的硝化螺旋菌門(Nitrospirae)的相對豐度在施入生物有機肥后分別降低了5.5%—8.6%和1.1%—2.6%,說明生物有機肥可能會抑制土壤污染物降解和氮肥力的提高[40]。另外,與其他3種處理相比,變形菌門中(Proteobacteria)能夠利用苯甲酸、水楊酸等物質作為唯一碳源,降解土壤有毒物質,具有抵抗植物病原菌作用,適合生長在高度貧營養環境中的[41]鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)在傳統耕作不施生物有機肥(TC)處理中相對豐度最高。

有學者研究證實,驅動土壤細菌群落結構組成發生改變的主要因子是土壤全氮含量[42]。如酸桿菌門能夠降解植物殘體、參與單碳因子代謝；放線菌門參與土壤碳氮循環。而在本研究中,我們發現土壤放線菌門與土壤堿解氮、全氮及土壤含水量呈正相關,且土壤含水量是影響放線菌門的主導因子。這可能與土壤細菌自身屬性相關。普遍認為,變形菌門喜養分含量高的土壤；酸桿菌門喜貧瘠的土壤；而放線菌門主要存在于極度干旱的環境中[43]。綜上所述,不同環境因素對微生物類群的影響不同。因此,關于免耕覆蓋、施用生物有機肥等交互效應改善土壤細菌群落結構組成的內在機制尚需進一步研究。

4 結論

免耕覆蓋、生物有機肥施用對土壤理化性質均產生了一定影響,顯著增加了土壤總有機碳、總氮的含量，降低了土壤pH、C/N比和冬小麥的經濟產量。與傳統耕作相比,免耕覆蓋施用生物有機肥提高了土壤細菌Simpson多樣性指數,降低了Chao1豐富度指數,且耕作和施用生物有機肥兩種因素均對土壤細菌群落分布產生了影響,其中放線菌門、變形菌門、綠彎菌門和酸桿菌門為優勢菌群。速效鉀和C/N比則是影響細菌群落組成中變形菌門和酸桿菌門相對豐度的主要驅動因子。