生物合成脂肽的研究進展及展望

馬天祥

（中國石油大慶煉化公司研究院，黑龍江大慶163411）

大慶油田的3次采油技術在國內處于領先地位，繼聚合物驅油和化學三元復合驅油后，無堿二元復合驅油和微生物驅油技術等已經提上日程，其中生物表面活性劑驅油有重要的應用前景。

1 脂肽類表面活性劑研究現狀

在石油開采領域，最受關注的生物表面活性劑是以表面活性素為代表的脂肽家族。1968年Arima等［1］首次發現枯草芽胞桿菌株（Bacillussubtilis）產生的是脂肽類表面活性劑。

脂肽分子由親水的肽鍵和親油的脂肪烴鏈兩部分組成，由于特殊的化學組成和兩親型分子結構，使其成為具有高表面活性和穩定性的生物表面活性劑。其提高原油采收率機理在于能夠降低表界面張力，降低毛細管力，有利于原油流動，從而提高石油開采量［2］。典型的表面活性素分子的氨基酸序列結構見圖1，分子結構見圖2。

圖1表面活性素分子氨基酸序列

圖2表面活性素分子結構式

包括疏水端的脂肪酸鏈和親水端的環狀寡肽，即由12～16個碳鏈長度的脂肪酸與7個氨基酸形成的肽環構成，其末端氨基酸的羧基與脂肪酸鏈的β-羥基縮合形成內脂結構［3，4］，其主要生產菌株是枯草芽孢桿菌和假單胞菌。

在成本方面，由于脂肽結構和合成機制復雜，天然合成效率不高。野生菌脂肽產量約1 g/L，當脂肽產量為20 g/L時，其生產成本就可以與目前廣泛應用的石油磺酸鹽相當。

如果表面活性素的用量僅為石油磺酸鹽的20%～10%時，則表面活性素的使用成本將降得更低，可以從根本上解決成本問題。

2 表面活性素合成菌株的小試和中試培養

2.1 清華大學技術研發

清華大學化工系10多年前開始脂肽生產菌株改造及其發酵生產工藝研究。通過對合成表面活性素的枯草芽孢桿菌細胞工廠的跨膜通道、強啟動合成、氨基酸前體途徑、脂肪酸前體途徑以及芽孢合成途徑進行基因調控改造，目前獲得的重組枯草芽孢桿菌的表面活性素產量已經可達20 g/L以上，是公開報道的最好水平。

基于與清華大學化工系合作進行的生物表面活性素產業化技術開發，首先利用清華大學前期已經對產表面活性素野生菌株B.subtilis THY-7以及高產基因工程菌B.subtilis TS1726Y的發酵培養基（碳源、氮源、碳氮比、微量元素）及培養條件進行了優化基礎上，通過搖瓶發酵優化確認了基因工程菌B.subtilis TS1726Y的優化培養條件及其在優化條件下的搖瓶產量，對產物進行了高壓液相色譜分析和鑒定。

進一步在30 L發酵罐的小規模中試發酵水平上對基因工程菌B.subtilis TS1726Y的發酵培養進行了考察，確定了合適的發酵模式和攪拌轉速。

2.2 表面活性素合成菌株的搖瓶實驗

首先在搖瓶中進行了對誘導劑、氨基酸、豆油前體等培養基配方的優化驗證，確認了高產表面活性素的基因工程菌B.subtilis TS1726Y的優選培養基配方和培養條件，配方見文獻［5］。

采用優化方案后進行菌株發酵培養時，發酵時間由60 h縮短至48 h且產物最高產量達26 g/L，與優化前的13.6 g/L相比，表面活性素產量提高了近1倍。針對配方中用量最大、對表面活性素產量影響較大的紅糖,選擇市場上4個品牌進行試驗,篩選出使用北京某品牌產量最高。表面活性素含量測定方面,在利用清華大學提供的液相色譜法的同時，嘗試了用酸沉法測定，結果表明2者差別不大,均可用于含量測定。

采用高壓液相色譜對產出的表面活性素進行了鑒定，4種主要產物的脂肪酸鏈長度分別為C13、C14、C14以及C15，見圖3。

基因工程菌B.subtilis TS1726Y合成的表面活性素產品由4種主要產物構成，清華大學合作者通過串聯質譜分析，進一步證明這4種產物中的脂肪酸鏈長度分別為C13、C14、C14以及C15，其7種氨基酸組成分別為Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu或Glu-Val-Leu-Leu-Asp-Leu-Val。

圖3搖瓶表面活性素液相色譜

3 發酵罐中試實驗

3.1 不同發酵模式對比

由于脂肽類表面活性劑的特殊性質，在搖瓶水平時較易生產，但放大至發酵罐水平時由于通氣和攪拌的存在極易產生大量泡沫，導致發酵過程無法順利進行。現階段脂肽發酵模式主要有外源添加消泡劑、直接排泡、泡沫回流等方式。對各方式發酵周期及OD600進行對比，結果見圖4。

圖4不同發酵模式OD600變化對比

發酵過程添加消泡劑是常規發酵中抑制泡沫的有效方法，常規發酵中所用到的消泡劑主要有硅類、天然油脂、聚醚類、高碳醇和聚醚改性硅類等，但有機硅及聚醚類消泡劑在添加量過多后均會對菌體生長造成一定抑制作用，大豆油作為碳源促進菌體生長代謝并提高脂肽類物質產量，因此嘗試選擇大豆油作為脂肽發酵過程中所用消泡劑。實驗過程發現，豆油作為消泡劑一定程度上可以消除前期培養基內蛋白質類物質所產生的泡沫，但對產物引起的泡沫抑制能力有限，需持續添加，至發酵中后期豆油對脂肽所產生的泡沫完全無抑制作用，發酵周期僅維持約28 h。由于脂肽是1種較好的乳化劑，在發酵液中添加豆油后由于攪拌及通氣作用，很容易使發酵液與豆油之間發生乳化反應形成穩定的水包油狀態，該狀態在發酵結束后很難消除，對后期檢測及提取造成困難。且由于乳化現象的存在使發酵液OD600持續增加直至結束時達到50，對觀察發酵周期內菌體生長情況造成阻礙。

脂肽發酵過程中泡沫產生比較劇烈，若直接將泡沫排出收集，同時會帶走大量培養基，導致罐內發酵液損失嚴重，發酵16 h后發酵液損失約一半，在28 h時，10 L體積的培養基剩余量僅為1 L，致使發酵無法繼續進行，同時發酵液的損失導致培養基內營養物質不能被充分利用，營養物質的減少也限制了產物的合成。且由于產物均聚集在排出的泡沫內，發酵中途取樣所得發酵液內只能檢測到少量產物，對發酵過程的監控也造成影響。

對比后發現，增加泡沫收集裝置并通過蠕動泵將收集的泡沫及發酵液重新泵回發酵罐，能極大程度降低發酵過程中由于泡沫不斷排出引起的發酵液損失現象，使發酵液內營養成分得到充分利用的同時增加發酵周期，使產物合成時間增加從而達到增加產量的目的，因此對30 L發酵罐泡進行了增加泡沫回流改造，流程見圖5。

圖5帶泡沫回流的發酵系統流程

3.2 攪拌轉速對發酵的影響

在固定通入空氣量前提下,通過對比不同攪拌轉速對發酵條件進行優化，以判斷發酵過程最佳溶氧控制條件以及在該條件下的脂肽最高產量。

圖6不同攪拌轉速對脂肽產量的影響

由圖6可看出，當攪拌轉速大于300 rpm時隨攪拌轉速增加發酵液產物含量總體呈下降趨勢，而當攪拌轉速低于300 rpm時產量同樣呈下降趨勢。此種現象可能歸因于過高的攪拌速度會使發酵罐內產生劇烈而穩定持久的泡沫，泡沫排出過快導致發酵液和菌體細胞的回流循環作用降低，從而導致發酵產量減少。而當攪拌速度過低時則無法保證發酵所需溶氧條件，使菌體生長及代謝緩慢，同樣使發酵產量降低。攪拌轉速300 rpm條件下的脂肽產量達到了34 g/L。

4 結論

（1）搖瓶和30 L發酵罐實驗驗證了B.subtilis TS1726Y基因工程菌的優化培養基配方和培養條件，表面活性素產量搖瓶達到26 g/L，而在30 L發酵罐達到了34 g/L，是已知文獻報道的最高表面活性素產量，成本已不再是制約工業化生產的障礙。

（2）目前化學合成表面活性劑被廣泛使用，在3次采油的油田產出液中含有大量化學表面活性劑，由于化學表面活性劑難降解，使后續污水處理難度大，外排污水達標難；而生物表面活性劑是微生物產生的次生代謝產物，能夠很快被生物降解，環境友好，生物相容性好。

由于生物表面活性劑具有既親水又親油的兩性分子結構，使其與化學表面活性劑具有類似的性能。生物表面活性劑通常比合成化學表面活性劑擁有更為復雜和龐大的分子結構，單個分子占據更大的空間，因而顯示較低的臨界膠團濃度，它們能顯著地降低表面張力、改善界面性質。此外，生物表面活性劑還具有選擇性好、用量少、無毒、無污染、生產工藝和設備簡單、耗能少等特點。