水稻灌漿期穗頸瘟發生對產量及莖節代謝產物的影響

潘爭艷，劉博，蔣洪波，姚繼攀，白元俊，徐正進

（1遼寧省水稻研究所，沈陽110101；2沈陽農業大學農學院，沈陽110161）

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa）是全球約50%人口的主糧[1]，由稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）引起的稻瘟病是世界各水稻產區普遍存在的一種病害[2]，對水稻造成大幅減產，嚴重時可減產 40%—50%[3]。稻瘟病在水稻的各個生育時期均可發生，穗頸瘟是其中危害最大的一種[4]。植物體內代謝產物的變化是生物系統對遺傳和環境變異的最終反映[5]，代謝組學（metabonomics）可以對植物體內代謝產物的整體組成進行動態分析[6]。應用代謝組學方法分析穗頸瘟對水稻莖稈代謝產物的影響，可為解析穗頸瘟感病機理提供理論依據。【前人研究進展】代謝組學是連接最上游基因功能和最下游表觀型變化的紐帶[5]，已廣泛應用于水稻各個領域。ISHIKAWA等[7]利用代謝組學方法研究發現，氧化脅迫促使水稻細胞的中樞代謝途徑耗竭和氨基酸積累；SANA等[8]利用代謝組學方法研究細菌性白葉枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae）與水稻的互作發現，細菌性白葉枯病菌可以顯著影響水稻的苯丙氨酸代謝；PENG等[9]研究水稻葉鞘和褐飛虱（Nilaparvata lugens）互作發現，褐飛虱對抗/感品種的誘導方式不同，褐飛虱可以誘導感病品種脂肪酸氧化、乙醛酸循環、糖異生和GABA作用的增強，還可以誘導抗病品種糖酵解和莽草酸途徑的增強。稻瘟病菌是研究植物病原菌重要的模式生物，在全基因組、轉錄組以及抗病基因定位與克隆[10]等方面都對其有大量的研究，代謝組學方法也成功應用到稻瘟病菌與水稻互作的研究中，JONES等[11]對稻瘟病菌侵染感病型與抗病型水稻葉片的代謝產物進行分析發現，感病型與抗病型水稻葉片差別最大的代謝產物為丙氨酸。水稻莖鞘中貯藏的可溶性糖等非結構碳水化合物（nonstructural carbohydrate，NSC）和氮素是水稻增產的重要物質[12-13]，抽穗前莖鞘中積累的NSC在后期被高效率轉運到籽粒中是水稻產量提高的重要因素[14]，魏鳳桐等[15]研究表明，施氮后 NSC積累不足和轉移效率降低限制了千粒重和結實率的提高。稻瘟病菌侵染莖節后，葉片和莖中的營養物質不能運輸到籽粒中[16]，影響水稻植株營養物質的積累、運轉和分配[17]，導致水稻減產且無法補救[18]?！颈狙芯壳腥朦c】選用兩個感病品種遼星1號和C418，其中遼星1號為高產優質常規稻品種，在遼寧省曾大面積種植，C418為通過“秈粳架橋”技術選育的粳型恢復系，因具有較高的配合力在全國范圍內培育出較多強優勢組合，隨著稻瘟病菌小種變化等原因，遼星1號和C418抗病性逐漸下降。代謝組學是研究水稻響應生物脅迫和非生物脅迫的重要手段[19]，在稻瘟病方面的研究多集中在葉瘟與寄主之間的互作，而自然條件下穗頸瘟發生對莖節代謝產物的變化及其對產量的影響鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以自然條件下遼星1號和C418感染穗頸瘟的莖節為研究對象，考察產量性狀并利用氣相色譜-質譜（GC-MS）非靶向代謝組學方法檢測莖節代謝產物，分析感病莖節與正常莖節之間的差異代謝產物種類，比較糖類物質、氨基酸類物質相對含量，從代謝物角度解析水稻品種感病和產量降低的原因，為感病機理研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試品種

選用水稻感病品種遼星1號和C418為材料，種子來源于遼寧省水稻研究所。

1.2 樣品采集

試驗于2019年4—10月在遼寧省水稻研究所試驗基地進行。遼星1號和C418生育期田間正常管理，無藥劑防治。灌漿期間進行穗頸瘟調查，計算發病率。選擇僅有穗頸瘟發生的植株進行標記，無任何病害的正常植株為對照（分別為LX1-CK和C418-CK），因遼星1號和C418抽穗時期不一致，9月15日對遼星1號穗頸瘟發生的莖節（LX1-disease）和正常莖節進行取樣，9月 18日對 C418穗頸瘟發生的莖節（C418-disease）和正常莖節進行取樣，莖節取樣后經液氮冷凍研磨成粉末，-80℃冰箱保存備用。兩個樣品均取樣完成后進行代謝物檢測。每個處理4次重復，每個重復20穗；另一部分成熟期取樣進行產量及品質構成因素測定。

1.3 莖節代謝產物定量、定性分析

莖節代謝產物定量、定性測定委托具有資質的專業第三方檢測機構上海鹿明生物科技有限公司完成。

1.3.1 儀器設備 代謝產物測定所需儀器包括，超聲波清洗機（SB-5200DT），旋渦振蕩器（TYXH-I）、研磨儀（JXFSTPRP-24/32）、離心干燥器（LNG-T98）、高速冷凍離心機（TGL-16MS）、氣浴恒溫振蕩器（THZ-82A）、真空干燥箱（DZF-6021）、氣相色譜-質譜聯用儀（7890B-5977B）和色譜柱（HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm））。

1.3.2 樣品處理 精密稱取 60 mg 莖稈粉末樣本，放入 1.5 mL 的離心管中，加入 40 μL 內標（L-2-氯-苯丙氨酸，0.3 mg·mL-1，甲醇配置）和 360 μL 冷甲醇，在-20℃冰箱中放置2 min，冰水浴超聲提取30 min，加入 200 μL 的氯仿，漩渦機中渦旋 2 min，再加入 400 μL的水，漩渦機中渦旋2 min，冰水浴超聲提取30 min；-20℃靜置 30 min 后低溫離心 10 min，取 300 μL 的上清液裝入玻璃衍生瓶中，用離心濃縮干燥器揮干樣本，向玻璃衍生小瓶中加入 15 mg·mL-1的甲氧胺鹽酸鹽吡啶溶液80 μL，渦旋振蕩2 min后，于37℃振蕩培養箱中放置90 min進行肟化反應。將樣本取出后再加入80 μL BSTFA（含1%TMCS）衍生試劑、20 μL 正己烷和 11種內標（C8/C9/C10/C12/C14/C16，0.8 mg·mL-1；C18/C20/C22/C24/C26，0.4 mg·mL-1，均為氯仿配置）10 μL，渦旋振蕩2 min后，于70℃反應60 min。取出樣本后，在室溫放置30 min，進行GC-MS代謝組學分析。每6個樣品中插入1個質控（quality control，QC）樣本，最后4個樣品插入1個質控樣本，評價整個實驗過程中系統質譜平臺的穩定性。

1.3.3 色譜條件 HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent J&W Scientific，Folsom，CA，USA），載氣為高純氦氣（純度不小于 99.999%），流速1.0 mL·min-1，進樣口的溫度為260℃。進樣量為1 μL，不分流進樣，溶劑延遲5 min。柱溫箱的初始溫度為60℃，以8℃·min-1程序升溫至125℃，5℃·min-1升溫至 210℃，10℃·min-1升溫至 270℃，20℃·min-1升溫至305℃保持 5 min。

1.3.4 質譜條件 電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230℃，四級桿溫度150℃，電子能量70 eV。掃描方式為全掃描模式（SCAN），質量掃描范圍：m/z 50-500。

1.3.5 數據分析 將GC-MS原始數據經軟件轉換，導入MS-DIAL軟件進行峰識別，與公共數據庫Fiehn匹配相似度實現化合物定性，每個物質在質譜中的響應信息經過轉換得到豐度值即為相對定量值。

1.4 產量及品質性狀測定

水稻成熟后取樣，測定單穗產量性狀、外觀品質和碾磨品質，包括結實率、千粒重、粒長、粒寬、糙米率、精米率、整精米率和堊白率等。

1.5 統計分析

運用Excel軟件進行產量性狀的方差分析。代謝產物數據通過在線軟件（http://www.metaboanalyst.ca/）進行主成分分析（principal components analyses，PCA）、偏最小二乘法判別分析（partial least-squares discriminant analysis，PLS-DA）和差異代謝產物等分析。

2 結果

2.1 遼星1號和C418穗頸瘟發生調查

灌漿期對遼星1號和C418穗頸瘟發病率進行調查，結果表明，C418的發病率和發病部位長度均大于遼星1號。遼星1號穗頸瘟發病率為57.23%，穗頸瘟發病部位長度介于1.10—2.35 cm。C418穗頸瘟發病率為82.94%，發病部位長度介于1.52—3.64 cm。

2.2 穗頸瘟發生對遼星1號和C418產量構成因素的影響

對遼星1號和C418產量構成因素進行測定，結果表明穗頸瘟發生降低了遼星1號和C418的結實率和千粒重。遼星1號穗頸瘟發生極顯著（顯著）降低了一次枝梗結實率、二次枝梗結實率和千粒重，分別降低了2.91%、5.78%和 5.41%；一次枝梗的千粒重降低了2.95%，但差異不顯著。C418穗頸瘟發生極顯著（顯著）降低了一次枝梗千粒重、二次枝梗千粒重和結實率，分別降低了 5.93%、8.22%和 7.44%，一次枝梗結實率降低了3.17%，但差異不顯著（表1）。遼星1號和C418穗頸瘟發生的不同穗之間結實率和千粒重變化幅度較大，可能是由于穗頸瘟發生在不同時期造成的。

表1 穗頸瘟發生對遼星1號和C418產量構成因素的影響Table 1 Effect of panicle neck blast on Liaoxing 1 and C418 yield components

2.3 穗頸瘟發生對遼星1號和C418外觀品質和碾磨品質的影響

對遼星1號和C418碾磨品質和外觀品質進行測定，結果表明遼星1號穗頸瘟發生顯著降低了一次枝梗和二次枝梗稻粒長度，分別降低了1.51%和1.54%，稻粒寬度略有增加，差異不顯著。C418穗頸瘟發生顯著降低了一次枝梗和二次枝梗稻粒寬度，分別降低3.53%和3.27%，稻粒長度差異不顯著。穗頸瘟發生顯著（極顯著）降低了遼星1號和C418的二次枝梗稻粒的長寬比，分別降低了 8.68%和 4.83%。同時，穗頸瘟發生顯著增加了遼星1號的一次枝梗堊白率，堊白率增加了54.08%（表2）。

穗頸瘟發生降低了遼星1號和C418的糙米率、精米率和整精米率。糙米率和精米率與正常差異不顯著，整精米率顯著（極顯著）降低，一次枝梗整精米率分別降低了 7.93%和 8.79%，二次枝梗整精米率分別降低了5.15%和9.74%（表3）。

2.4 穗頸瘟發生對遼星1號和C418莖節代謝產物的影響

采用GC-MS對遼星1號和C418感病莖節和正常莖節代謝產物進行檢測，均定性到358種代謝產物，遼星1號莖節感病后上調的代謝產物有263種，占檢測到的代謝產物總數的73.46%；C418莖節感病后上調的代謝產物有243種，占檢測到的代謝產物總數的67.88%。兩組分析均上調的代謝產物有220種，占檢測到的代謝產物總數的61.45%。

表2 穗頸瘟發生對遼星1號和C418外觀品質的影響Table 2 Effect of panicle neck blast on appearance quality of Liaoxing 1 and C418

表3 穗頸瘟發生對遼星1號和C418碾磨品質影響Table 3 Effect of panicle neck blast on milling quality of Liaoxing 1 and C418 (%)

采用 PCA分析來評估所有樣本的整體分布和整個分析過程的穩定性。如圖1-A所示，PCA分析的兩個主成分解釋了總方差信息的 75.0%。所有的質控樣品（QC）聚在一起，表明所有檢測具有良好的分析穩定性和實驗重現性。在PCA模型中，遼星1號和C418的感病莖節和正常莖節在第一個成分中被很好地分離，表明處理之間的代謝差異顯著。

對檢測到的代謝產物進行PSL-DA分析，遼星1號和 C418的感病莖節和正常莖節的代謝產物均沿著第一主成分清楚的分開，分別解釋了總變異的 78.9%（圖1-B）和82.0%（圖1-C）。遼星1號的模型累積解釋率R2=0.9947，Q2=0.9879；C418模型累積解釋率R2=0.99726，Q2=0.99063，數值均＞0.5，表明模型的擬合準確性較好。結果表明，遼星1號和C418的感病莖節和正常莖節之間具有明顯不同的代謝產物表型，穗頸瘟發生嚴重影響了莖節的代謝物組成。

2.5 感病莖節與正常莖節之間差異代謝產物分析

利用PLS-DA分析的變量權重值（VIP＞1.0）進行感病莖節與正常莖節之間差異代謝產物分析，明確促使分離的代謝產物。與正常莖節相比，遼星1號感病莖節誘導61種代謝產物顯著變化，其中49種代謝產物的相對含量顯著上調；C418感病莖節誘導47種代謝產物顯著變化，其中24種代謝產物的相對含量顯著上調。兩組處理共有的差異代謝產物30種，β-谷甾醇、二甲基尿酸、α-生育酚、正壬醇、香草酸和磷酸己酸在兩組分析的VIP值均＞2.0，表明這6種代謝產物在感病莖節和正常莖節的代謝產物分離中起到重要作用。

圖 1 穗頸瘟發生莖節與正常莖節之間代謝產物 PCA和PLS-DA分析Fig. 1 PCA and PLS-DA analysis of the metabolites between diseased stem nodes and normal stem nodes

根據代謝產物相對含量的變化可以將 30種代謝產物分為4組（圖2）。第1組19種代謝物，包括高絲氨酸、別嘌呤醇、D-紅鞘氨醇、阿拉伯糖醇、山梨醇、β-谷甾醇、半乳糖-6-磷酸、乙酰氨基葡萄糖、菊粉糖、羥基氨基甲酸酯、葡萄糖-6-磷酸、D-果糖-1,6-二磷酸、磷酸己糖酸、二甲基尿酸、2-單油酸、葡萄糖酸、尿囊酸、N-乙酰半乳糖胺和5-甲基尿苷。與正常莖節相比，遼星1號和C418穗頸瘟發生導致這19種代謝產物相對含量上調，分別上調了3.83—2 763.97和10.01—18 989.02倍。第2組9種代謝物，包括甲基α-呋喃硫醚、2,3-二羥基-2-丁烯二酸、亞甲基二磷酸鹽、脫氫抗壞血酸、香草酸、N-乙酰-d-甘露糖胺、三十烷醇、α-生育酚和大豆苷元。這一組代謝產物具有兩個特點，一個是與正常莖節相比，遼星 1號和C418穗頸瘟發生導致這組代謝產物相對含量下調，分別下調了73.87%—96.29%和73.02%—99.68%；二是正常莖節中這組代謝產物遼星 1號的相對含量大于C418的相對含量。第3組和第4組分別有一種代謝物，分別是 1,5-脫水葡萄糖醇和正壬醇，與對照相比，遼星1號和C418感病莖節中1,5-脫水葡萄糖醇分別上調了6.91倍和下調了86.23%，正壬醇分別下調了80.03%和85.22%。由于正常莖節中C418的正壬醇相對含量大于遼星1號的正壬醇相對含量，所以將正壬醇與第2組分開，單獨獨立為一組。

圖2 差異代謝產物層次聚類分析生成的熱圖Fig. 2 Hierarchical cluster analysis of differential metabolites resulting in thermal energy maps

2.6 穗頸瘟發生對遼星1號和C418莖節糖類物質的影響

GC-MS共檢測到糖類物質30種，從熱圖中可見（圖3-A），與正常莖節相比，遼星1號穗頸瘟發生上調的糖類物質有21種，占糖類物質總數的70%；C418穗頸瘟發生上調的糖類物質有22種，占糖類物質總數的 73.33%。兩個品種中共有的上調糖類物質19種，占糖類物質總數的63.33%。分別為阿拉伯糖、葡萄糖、異麥芽糖、纖維二糖、D-核糖、蜜二糖、三糖、菊粉糖、酮己糖、D-木糖、β-龍膽糖、槐糖、松三糖、D-果糖、D-甘露糖、D-巖藻糖、哌啶-α-d-果糖、葡庚糖和赤鮮糖。與對照相比，這19種糖類物質在遼星1號和C418感病莖節中分別上調了1.02—6.22和1.07—17.92倍。除赤蘚糖和葡庚糖，其余17種代謝產物在C418感病莖節中上調的幅度更大。與對照相比，兩個品種感病莖節中共有下調的代謝產物6種，包括左旋葡聚糖、棉子糖、D-塔格糖、D7-葡萄糖、海藻糖和6-脫氧葡萄糖，這6種糖類物質在遼星1號和C418感病莖節中分別下調了2.16%—21.80%和7.15%—99.77%。

2.7 穗頸瘟發生對遼星1號和C418莖節氨基酸類物質的影響

GC-MS共檢測到氨基酸類物質38種，從熱圖中可見（圖 3-B），與對照相比，遼星 1號感病莖節中上調的氨基酸類物質有31種，占氨基酸類物質總數的 81.58%；C418感病莖節中上調的氨基酸類物質有 29種，占氨基酸類物質總數的 76.32%。兩個品種共有上調的氨基酸類物質26種，占氨基酸類物質總數的68.42%。上調的氨基酸有L-半胱氨酸甘氨酸、草氨酸、L-天冬氨酸、丙氨酸、β-丙氨酸、L-異亮氨酸、絲氨酸、L-苯丙氨酸、氰基丙氨酸、N-甲基丙氨酸、氧化谷氨酸、高絲氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、L-天冬酰胺、L-蛋氨酸、鳥氨酸、賴氨酸、鄰琥珀酰高絲氨酸、L-谷氨酸、谷氨酸、L-酪氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、亮氨酸和蘇氨酸。這些代謝物在遼星 1號感病莖節中上調了 1.05—7.98倍，在C418感病莖節中上調了1.10—13.12倍。兩個品種感病莖節中共有的下調代謝產物4種，包括 N-甘氨酰脯氨酸、D3-色氨酸、N-甲基谷氨酸和N-乙酰鳥氨酸，這4種氨基酸在遼星1號感病莖節中下調了8.96%—28.19%，在C418感病莖節中下調了2.78%—32.33%。

圖3 糖類物質和氨基酸類物質層次聚類分析生成的熱圖Fig. 3 Thermal energy maps of hierarchical cluster analysis of carbohydrate metabolites and amino acid metabolites

3 討論

次生代謝產物在植物應對生物脅迫中起著重要防御作用[20]。本研究發現，穗頸瘟發生誘導遼星1號和C418香草酸、N-乙酰-d-甘露糖胺、脫氫抗壞血酸、三十烷醇、α-生育酚和大豆苷元的相對含量顯著下調，這6種物質均屬于次生代謝產物范疇。生育酚和脫氫抗壞血酸作為抗氧化物質可以保護植物新陳代謝免受應激損傷[21]。三十烷醇廣泛存在水稻等植物的蠟質中[22-23]，能夠促進碳氮代謝，加速莖中貯藏的有機物向籽粒運輸[24]。大豆苷元未見水稻方面的報道，但是豆科植物中常見的次級代謝產物[25]，可以提高豆科植物對病原菌的抗性。香草酸作為化感類物質在植物生長發育過程和抗逆中起到一定作用[26-27]。本研究還發現，遼星1號正常莖節中這6種次生代謝產物的相對含量分別是C418的2.64、2.39、2.39、2.27、3.09和2.56倍，穗頸瘟發病率調查結果與這一結果相反，遼星1號發病率和發病程度均小于C418。推測這6種次生代謝產物的相對含量與水稻莖節感染穗頸瘟有一定關系，稻瘟病菌可能誘導水稻莖節下調這些次生代謝產物相對含量降低莖節對稻瘟病菌的防御反應。

禾谷類作物倒1節間主要發揮物質運輸通道的功能[28]，抽穗后水稻莖鞘中70%左右的非結構性碳水化合物（NSC）通過倒1節轉運到籽粒中，對最終產量的表觀貢獻率可達 24%—27%[29-30]。本研究發現，穗頸瘟發生上調了遼星 1號和 C418莖節中 70%和73.33%的糖類物質，其中阿拉伯糖上調了 6.22%和7.45%，菊粉糖上調了5.68%和17.92%，葡萄糖上調了3.0和4.80倍，甘露糖上調了1.39和3.43倍，果糖上調了1.92和2.97倍。這些可溶性糖的上調表明水稻“源”向“庫”輸入的強度和“庫”將糖轉化為淀粉的能力降低，同時果糖的上調也預示著莖中蔗糖轉化酶異?；钴S[31]。本研究還發現，C418穗頸瘟發生有17種糖類物質上調幅度大于遼星 1號，并且，C418穗頸瘟發生二次枝梗結實率和千粒重下降幅度也大于遼星1號，分析原因，可能是感病莖節碳水化合積累，降低了莖節光合作用，莖稈運輸到籽粒上的碳水化合物量減少，導致產量下降，尤其C418產量下降更多。

水稻籽粒的形成除了需要累積大量的碳水化合物外還需要大量的有機氮類代謝產物，莖鞘中的氮素對籽粒氮的貢獻率達到30%以上[32]。植物體內游離氨基酸直接或是間接對生物脅迫和水稻生長發育作出響應[33-34]。本研究表明，穗頸瘟發生上調了遼星1號和C418莖稈中81.58%和76.32%的氨基酸類物質，破壞了氮素在營養器官和生殖器官的分配比例，降低了氮素向穗部的再運轉量，導致產量的降低。有研究也表明，大量丙氨酸產生可能導致植物細胞死亡，促進稻瘟病菌侵染[10]，本研究結果與這一結論一致，稻瘟病菌侵染誘導了遼星1號和C418莖節中丙氨酸上調了3.34和3.74倍。

穗頸瘟發生后，遼星1號和C418二次枝梗的結實率和千粒重較一次枝梗下降顯著，分析原因可能是強勢粒在不同環境下存在遺傳穩定性，而弱勢粒灌漿受環境因素影響大[35]。穗頸瘟對精米率和糙米率沒有顯著影響，但對整精米率影響較大，可能是一方面碳水化合物合成受阻易造成籽粒充實不良[36]，另一方面，穗頸瘟發生造成“源”輸出不足，籽粒灌漿速率極慢，充實度差容重極輕，造成整精米率大幅度降低[37]。

4 結論

穗頸瘟發生顯著（極顯著）影響了遼星 1號和C418的二次枝梗結實率和千粒重，改變了莖節代謝產物組成，穗頸瘟可能通過下調脫氫抗壞血酸、α-生育酚、N-乙酰-d-甘露糖胺等次生代謝產物相對含量降低了水稻莖節對稻瘟病的防御反應。感病莖節通過積累大量的糖類物質和氨基酸類物質，導致碳氮代謝受阻，降低了其向籽粒轉運，從而抑制了水稻產量。