結核感染T細胞斑點試驗診斷早期骨結核的臨床價值分析

繆標烈，毛興敏，劉增輝，陳仁春

(粵北第二人民醫院骨外科，廣東 韶關 512028)

骨結核感染及發病十分隱匿，給臨床診斷帶來極大的困難，目前能夠簡便、快速診斷結核病的方法卻十分有限，很多患者因為沒有得到早期治療而致殘、致畸[1]。回顧文獻顯示[2]，TuliⅠ期骨關節結核在治療后關節功能得到完全恢復或部分受損，TuliⅡ期骨關節結核接受治療關節功能可保留50%～70%，因此尋求一種能夠早期、快速運用于骨結核診斷的方法成為當務之急。目前國內大部分醫院主要是應用結核菌素純蛋白衍生物試驗(pure protein derivative，PPD試驗)、抗結核抗體(tuberculosis antibody，TB-ab)及病原學檢查等傳統檢測輔助診斷骨結核，臨床應用過程發現PPD皮試及TB-ab的靈敏度、特異度及陽性預測值均較低，病原學檢查雖然有高特異度，但等待結果時間太長，靈敏度也較低[3-4]。近年來有學者將核酸擴增檢測法(Xpert MTB/RIF)用于輔助診斷結核病，獲得較高的靈敏度和特異度。竺祖軍等[5]通過手術或穿刺獲得含菌的病灶組織或膿液，應用于Xpert MTB/RIF檢測診斷骨結核病，靈敏度達到82.0%，特異度為96.67%，與董偉杰等[6]研究結果基本一致，獲得較好的臨床效果。但劉佳慶等[7]卻發現，在結核菌涂陰的患者中Xpert MTB/RIF檢測的靈敏度僅為56.5%，認為Xpert MTB/RIF檢測要獲得滿意的臨床效果要求檢測標本含菌量達到其檢測限值。而早期骨結核大部分為結核菌涂陰患者，且大多無需手術，獲得充足含菌量的標本有較大難度，使用Xpert MTB/RIF檢測出現假陰性概率大，陽性率低。近年國外有學者將結核感染T細胞斑點試驗(T cell spot test of tuberculosis infection，TSPOT.TB)應用于肺結核的診斷，獲得較高的靈敏度和特異度。TSPOT.TB檢測標本為外周血，并且支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等多種標本同樣具有檢測價值，取材簡便且具有多樣化，無需帶菌標本，實驗過程相對簡單，大大提高了陽性率，臨床應用價值大，易推廣。目前國內也有文獻報道將TSPOT.TB應用于肺結核的診斷，獲得滿意的臨床效果，但將其應用于診斷早期骨結核的報道少見，把該檢測與傳統診斷骨結核的方法做比較的研究更少見，暫無明確數據表明其診斷早期骨結核的臨床應用價值。本研究將80例疑似早期骨結核病例作為研究對象，通過TSPOT.TB檢測并與傳統診斷方法進行對比分析，探討其輔助診斷早期骨結核的臨床應用價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集粵北第二人民醫院2017年7月至2018年12月收治的疑似TuliⅠ期及Ⅱ期骨結核病例80例行前瞻性研究，其中男43例，女37例；年齡10～75歲，平均年齡(45.25±7.62)歲。所有病例均行PPD皮試、TB-ab檢測、結核菌病原學檢查及TSPOT.TB檢測。通過病灶穿刺獲得組織，行病理檢查(金標準)確診后獲得52例骨結核病例歸類為A組，非骨結核病28例歸類為B組。本研究過程符合赫爾辛基宣言標準，所有研究對象均自愿簽署臨床研究知情同意書。

1.2 納入及排除標準 納入標準：(1)疑似Tuli分期Ⅰ期及Ⅱ期骨結核患者；(2)無免疫缺陷疾病；(3)同意參加本次研究并配合完善相關檢查。排除標準：(1)有明確的免疫缺陷疾病；(2)有嚴重的終末期疾病患者；(3)近期有大量使用激素的患者。

1.3 方法 所有病例行PPD皮試、TB-ab檢測、結核菌病原學檢查及TSPOT.TB檢測。將病理檢查作為骨結核診斷金標準，骨結核病例歸類為A組，非骨結核病歸類為B組，觀察兩組病例的PPD皮試、TB-ab檢測、病原學檢查及TSPOT.TB的靈敏度、特異度及陽性預測值。

1.3.1 TB-ab檢測 本研究采用酶聯免疫吸附試驗(ELSIA法)取血清按試劑盒(上海奧普公司)說明進行TB-ab檢測。結果判斷：樣本的吸光值/臨界對照品的吸光度值的比值>6為陽性，比值<6為陰性。

1.3.2 PPD皮試 將PPD 0.1 mL原液在前臂掌側前1/3行皮內注射并標記皮丘位置。72 h后觀察皮丘，無硬結或硬結<5 mm為(-)，不發紅且硬結直徑≥5 mm提示(+)。

1.3.3 TSPOT.TB檢測 TSPOT.TB檢測是采用γ-干擾素釋放原理，結合酶聯免疫斑點技術，對機體結核桿菌感染進行檢測的方法。其設有陰性參照孔、早期抗原靶6(early stage antigen targe-6，ESAT-6)和培養濾液蛋白10(ulture filtrate protein-10，CFP-10)作為刺激源的兩個實驗孔及以植物血凝素(phytohemagglutinin，PHA)作為刺激源的陽性參照孔(見圖1)。實驗方法：用含肝素鋰的試管采集外周靜脈血4～5 mL，進行單個核細胞分離、洗滌及計數并配制細胞懸液，對標本進行體外抗原刺激與孵育，洗板顯色后進行斑點閱讀和計數。達到以下標準判定為陽性：(1)當陰性參照孔斑點數<5個，任意一個實驗孔斑點數減去陰性參照孔斑點數需≥6個。(2)當陰性參照孔斑點數≥6個，任意一個實驗孔斑點數必須是陰性參照孔斑點數的2倍以上。

圖1 TSPOT.TB檢測示意圖

1.3.4 結核菌病原學檢查[8]局麻下對病灶進行穿刺，獲得病變組織，按檢驗要求行改良羅氏結核桿菌培養及標本直接涂片；結核菌培養有結核菌生長并經顯微鏡下鏡檢證實視為陽性(見圖2～3)；涂片結果按萋-尼氏抗酸染色法進行判讀，鏡下找到結核菌視為陽性(見圖4)。本研究將結核菌涂片及結核菌培養兩種檢查統一歸類為結核菌病原學檢查。病理檢查作為診斷新標準(見圖5)。

圖2 結核菌培養陽性

圖4 結核菌抗酸染色涂片陽性(萋-尼氏染色法，×100油鏡)

1.4 觀察指標 記錄兩組患者TSPOT.TB檢測、PPD皮試、TB-ab檢測、結核菌病原學檢查的陽性及陰性病例數，計算以上檢測在早期骨結核診斷中的靈敏度、特異性及陽性預測值，進行對比分析。

1.5 統計方法 應用SPSS 22.0軟件進行統計學分析，計數資料以%表示，比較采用χ2檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。使用ROC曲線分析PPD皮試、TB-ab、結核菌病原學檢查及TSPOT.TB在早期骨結核診斷中的應用價值。

2 結 果

PPD皮試、TB-ab、TSPOT.TB及病原學檢查在骨結核診斷中的結果(見表1～2，見圖6)，提示TSPOT.TB在早期骨結核診斷中有較高靈敏度、特異性和陽性預測值，TSPOT.TB診斷早期骨結核的靈敏度顯著高于PPD皮試、TB-ab和結核菌病原學檢查(χ2值分別為7.385，29.352，35.455，P<0.05)，差異有統計學意義。TSPOT.TB診斷骨結核的特異度顯著高于PPD皮試、TB-ab(χ2值分別為14.275和9.524，P=0.015)，差異有統計學意義。TSPOT.TB診斷骨結核的陽性預測值顯著高于PPD皮試、TB-ab(χ2值分別為11.778和19.665，P=0.035)，差異有統計學意義。TSPOT.TB診斷骨結核特異度及陽性預測值稍低于結核菌病原學檢查(χ2值分別為2.074和0.660，P值分別為0.150和0.417)，差異無統計學意義。

表2 PPD皮試、TB-ab、TSPOT.TB及病原學檢查預測值(%)

圖6 四種檢測之間靈敏度、特異度、陽性預測值對比圖

繪制PPD皮試、TB-ab、TSPOT.TB及病原學檢查在骨結核診斷中的ROC曲線圖(見圖7)。其中TSPOT.TB檢測ROC曲線下面積為0.902，PPD皮試的ROC曲線下面積為0.796，TB-ab檢測ROC曲線下面積為0.725，病原學檢查ROC曲線下面積為0.587，TSPOT.TB診斷骨結核的ROC曲線下面積最大，診斷價值最高。

圖7 四種檢查方法診斷骨結核ROC曲線圖

3 討 論

目前對于早期骨結核診斷方面臨床仍無良好的診斷方法，特別是在貧困地區基層醫院，診斷方法單一、診斷方法復雜，無簡單、快速、可靠的輔助診斷和篩查方法，導致大部分骨結核患者在早期沒有得到及時治療而致殘、致畸，給患者身體上帶來巨大痛苦。

PPD皮試、TB-ab及病原學檢查等傳統輔助診斷結核的方法應用于臨床已有幾十年的歷史，但在臨床結核診斷上的總體表現欠佳，并未達到預期的診斷效果[9]。TSPOT.TB是檢測結核桿菌抗原刺激下外周血或全血的單核細胞釋放γ干擾素的水平，對診斷結核感染有重要臨床價值[10-11]。國外已經將TSPOT.TB應用于肺結核診斷當中，并取得了良好應用效果，但國內應用TSPOT.TB進行早期骨結核診斷的研究報道很少，其應用價值尚有待于進一步研究證實[12]。本研究通過將TSPOT.TB檢測與多種傳統診斷早期骨結核的方法進行對比，研究結果顯示TSPOT.TB在診斷TuliⅠ期及Ⅱ期骨結核感染有較高的敏感度、特異度和陽性預測值，ROC曲線下面積達到0.902，診斷價值明顯優于傳統診斷方法，差異有統計學意義，提示以TSPOT.TB診斷骨結核有助于提升診出率。Broderick等[13]國外學者曾以31例肺外結核患者為例，對TSPOT.TB診斷肺外結核的價值展開前瞻性研究，研究結果顯示TSPOT.TB診斷肺外結核的靈敏度達到100%。李曉等[14-15]研究結果顯示TSPOT.TB診斷骨結核的敏感性為96%，且靈敏度不受人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)感染影響。梁大華等[16-18]國內學者在研究中報道TSPOT.TB 在結核診斷中的敏感性達到94.21% 、特異性達到94.50%、陽性預測值達到74.20%[19-20]。上述研究結果均與本次研究結果相近，充分證實本次研究結果可靠。

Zhou Zibo等[21]對TSPOT.TB和Xpert MTB/RIF在骨結核中的診斷價值進行了比較分析；TSPOT.TB的靈敏度(89.7%)顯著高于Xpert MTB/RIF檢測(74.4%，P<0.05)；Xpert MTB/RIF分析的特異性(97.1%)高于T-SPOT.TB(82.4%，P<0.05)。雖然兩種檢測靈敏度和特異度各有優勢，但Xpert MTB/RIF和TSPOT.TB的ROC曲線下面積分別為0.857和0.860，差異無統計學意義，表明TSPOT.TB和Xpert MTB/RIF在骨結核診斷中具有同等價值。Xpert MTB/RIF檢測獲得較高的特異度要求標本含菌并達到其檢測限值，早期骨結核要獲得含菌量高的標本較難；而TSPOT.TB檢測標本范圍廣泛，不僅局限于血液標本，對支氣管肺泡灌洗液、痰液、胸腹水、腦脊液等多種標本同樣具有檢測價值，能夠應用多種標本對結核病做出診斷[22]。TSPOT.TB檢測標本多樣提升了骨結核診斷準確性，也決定了TSPOT.TB檢測具有簡便、快捷等優勢。本次研究中未涉及非血液標本檢測。

盡管TSPOT.TB試驗診斷骨結核具有優勢，但也存在不足，TSPOT.TB檢測所需試劑盒價格昂貴，對檢測操作技術的要求也很高，必須配備相關實驗設備，導致此技術全面推廣難度大，無法在基層醫院推廣應用。優化TSPOT.TB檢測技術，推行醫聯體合作以減少醫療成本和檢測費用，是促進TSPOT.TB檢測技術推廣應用的有效策略。

綜上所述，TSPOT.TB檢測診斷早期骨結核具有較高敏感度、特異度，且具有檢測安全、快速、可靠等優勢，值得臨床推廣應用，但檢測成本高使其應用受到限制。相信隨著相關技術的不斷發展、新醫改的推行，TSPOT.TB檢測成本將不斷降低，有望實現TSPOT.TB檢測的推廣應用。