響應面法優化艾蒿水提物的提取工藝及其抗氧化活性分析

張 晶 邢媛媛 金 曉 徐元慶 紅 雷 史彬林

(內蒙古農業大學 動物科學學院，呼和浩特 010018)

艾蒿(Artemisiaargyi)是菊科蒿屬中一種多年生常綠草本，喜溫濕，多生于荒地林緣，通常情況下，我國除干旱及高寒地帶外，其他地區都適宜艾蒿生長。艾蒿不僅能作為傳統的中藥藥材，亦可用于醫療保健、制作食品和動物的綠色飼料添加劑。艾蒿水提物(Artemisiaargyiaqueous extract，AAE)是以艾蒿為原料，通過物理、化學或生物的方法處理后，以水為溶劑進行溶解，濃縮得到含有效成分且其結構完整的提取物。因飼喂AAE對動物體具有無污染、無毒副作用和無殘留的特性而被研究學者廣泛關注[1]。已證實從艾蒿中提取的揮發油、黃酮、多糖、生物堿和三萜類等活性成分具有抗炎、抗菌、抗衰老、調節免疫、抗氧化和促生長等作用[2-3]。

目前關于艾蒿的提取方法主要有水提法、醇提法、水蒸汽蒸餾法和微波輔助提取法等[2]。其中醇提法雖易于實現工業化生產但提取物中雜質較多[4]；水蒸汽蒸餾法具有便于分離的優點，但缺點也明顯：揮發油與水發生水和反應使之變味，不利于飼喂動物，此外，除水儀價格昂貴，且無法降低處理高生物需氧量廢水成本[5]；微波法雖然對特定植物成分具有較高提取率，但對植物的細胞結構影響較大易造成溶劑殘留，此外，微波設備價格昂貴，不易于實現工業化生產[6]。各提取方法具有鮮明的優缺點，而傳統中藥提取慣用的水提法，則具有適用范圍廣，安全系數高，操作簡便和經濟成本低等優勢，更加適用于實際生產需求。此外，各提取方法可據具體要求對其提取工藝的參數進行優化，以達到提高提取率的目的。常見的優化方法有響應面法和正交設計法，其中正交設計選取的代表點并不能完全反應整體情況，且設計結果所得優選值只是試驗選用水平的某一種組合，具有局限性，而響應面法將數據進行多項式擬合后，以圖形表達函數關系，使其結果更加簡單明了，易于發現影響因素之間以及影響因素與提取率的交互關系，所以響應面法廣泛應用于優化多因素影響的植物提取工藝[7-9]。綜合考慮成本及各方法的優缺點，本研究采用操作簡單且成本低廉的水浴恒溫加熱法對艾蒿進行提取，以單因素分析為基礎，用更加科學合理的響應面法優化工藝參數，并評價水提物的抗氧化活性，旨在為科學有效地開發具有抗氧化功效的艾蒿水提物飼料添加劑提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試艾蒿：在2018年8月于內蒙古和林格爾縣大紅城鄉境內采集。

試劑：抗壞血酸(Vitamin C，Vc)、過氧化氫(Sigma-Aidarch公司)；磷酸鹽緩沖液(Hyclone公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(Phygene公司)；無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、硫酸亞鐵和水楊酸等(國藥集團化學試劑有限公司)；除DPPH外其余試劑均為分析純。

儀器：DT-10KA電子天平(常熟市金羊砝碼儀器有限公司)； SHZ-88-1水浴恒溫震蕩器、RE-5298旋轉蒸發儀器(上海雅榮生化儀器設備有限公司)；SHB-3循環水式多用真空泵(鄭州長城科工貿有限公司)；ALPHA 1-2LDplus真空冷凍干燥機(德國Marin Christ公司)；TD4Z電動離心機(湖南凱達科學儀器公司)；V-1000可見光分光光度計(上海翱藝儀器有限公司)。

1.2 試驗方法

1.2.1艾蒿的前處理

將采集的艾蒿地上部分平鋪于室內完全陰干，剪成3～5 cm的小段，將葉子與桿混合均勻用作提取水提物的原料。AAE由各種生物活性成分構成，據前期初步測定，AAE中多糖、黃酮和多酚3種常見的活性成分含量分別為8%～10%、6%～12%和4.32%～6.75%[10]。

1.2.2單因素試驗

(1)料液比對AAE提取率的影響：準確稱取 40 g 艾蒿，在水浴溫度70 ℃的條件下，分別研究不同料液比1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30(艾蒿質量與水的體積比，下同)對提取率的影響，按比例加入自來水，用保鮮膜封口后，水浴4 h。每組設定3個重復(n=3)。

(2)時間對AAE提取率的影響：準確稱取 40 g 艾蒿，在水浴溫度70 ℃條件下，以料液比 1∶20 的比例加入自來水，用保鮮膜封口后，分別水浴2、4、6、8、10、12和24 h。每組設定3個重復(n=3)。

(3)溫度對AAE提取率的影響：準確稱取40 g艾蒿，以料液比1∶20的比例加入自來水，用保鮮膜封口后，控制溫度分別為25 ℃、40 ℃、55 ℃、70 ℃、85 ℃和100 ℃，水浴8 h。每組設定3個重復(n=3)。

1.2.3響應面試驗設計

利用Design-Expert V8.0.6進行Box-Behnken設計響應面試驗，以單因素試驗結果為基礎，自變量選擇料液比(A)、提取時間(B)和提取溫度(C)，響應值選擇AAE提取率(Y)，進行3*3正交試驗，每個試驗重復3次，3個水平分別采-1、0和1作為編碼，如表1。

表1 響應面試驗分析因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.4AAE抗氧化活性的測定

(1)鐵離子還原力的測定：將不同質量濃度(0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36和0.40 mg/mL)的樣品溶液和維生素C(Vc)溶液各取2 mL于試管中，依次加入2.5 mL的0.2 mol/L pH=6.6磷酸鹽緩沖液和2.5 mL的1%鐵氰化鉀溶液，充分混勻，50 ℃恒溫水浴20 min，流水冷卻后加入2.0 mL 10%的三氯乙酸溶液使反應終止，以3 000 r/min離心15 min，吸取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵，振蕩搖勻，室溫靜置10 min，蒸餾水調零，于700 nm處測定吸光度值，每個濃度3個重復取平均[11]。

(2)清除DPPH自由基的能力：吸取1.0 mL已稀釋到不同濃度的艾蒿水提液，分別加入2.0 mL的 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液，記為Ax；以等量無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，記為Ax0；以等量蒸餾水替換AAE溶液，記為A0；并用Vc做陽性對照，每個濃度3個重復取平均，混勻后避光于室溫下反應30 min，離心，用無水乙醇調零，于517 nm波長處取上清測定吸光值[12]。按下式計算AAE對DPPH自由基的清除率：

DPPH清除率=[1-(Ax-Ax0)/A0]×100%

(1)

式中：Ax為反應體系吸光度；Ax0為樣品本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

(3)清除羥自由基(·OH)的能力：吸取 2.0 mL 已稀釋到不同濃度的艾蒿水提液，依次加入2.0 mL 9 mmol/L FeSO4溶液和1.0 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，搖勻，靜置10 min后加入2.0 mL 9 mmol/L水楊酸溶液，充分振蕩混勻，37 ℃ 恒溫反應30 min，記為Ax；以等量蒸餾水代替H2O2溶液，記為Ax0；以等量蒸餾水替換AAE溶液，記為A0；并用Vc做陽性對照，每個濃度3個重復取平均，用無水乙醇調零，于波長510 nm處測定所得吸光值[12]。按下式計算AAE對羥自由基(·OH)的清除率：

羥自由基(·OH)清除率=
[1-(Ax-Ax0)/A0]×100%

(2)

式中：Ax為反應體系吸光度；Ax0為樣品本底吸光度；A0為空白對照吸光度。

1.3 數據處理

使用 Microsoft office excel 2010進行數據的初步整理和圖表的制作，Design-Expert V8.0.6 Box-Behnken設計原理進行響應面表格的制作，GraphPad Prism 6繪制各影響因素間的互作圖，最后利用SPSS 16.0進行概率單位分析得出IC50值并且對全部數據進行單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 單因素分析

2.1.1單因素料液比對AAE提取率的影響

由圖1(a)可知，隨料液比的增加，AAE提取率呈先升高后降低的趨勢，此結果與前人報道的料液比對蒿屬植物魁蒿和艾蒿總黃酮提取量的影響趨勢相似[13-14]。當料液比為1∶20和1∶25，提取率到達所測極值且兩者間差異不顯著(P>0.05)。當料液比較小時，可能由于水溶液已經飽和而無法析出更多的有效成分，造成AAE提取率降低[14]。但隨著料液比的增加，艾蒿充分溶于水中，從而AAE提取率也逐步上升。然而料液比過大時，質子推動力會影響AAE中有效成分的溶出，導致提取率有所下降[13]。料液比過高則加大了后期旋轉蒸發的工作量，造成了溶劑浪費，故最佳料液比選擇 1∶20[4]。

2.1.2單因素時間對AAE提取率的影響

由圖1(b)可知，隨水浴時間的延長，AAE提取率總體趨于上升，此結果與李杰等[4]研究報道的時間對艾蒿生物堿提取量的影響趨勢一致。在8 h到達第一個小高峰，極顯著高于2～6 h的提取率(P<0.01)。水浴時間較短時，艾蒿吸收的熱能不足，細胞破裂程度較低，溶出的有效成分較少，隨著水浴時間延長，艾蒿細胞逐漸破裂，AAE提取率上升。但在10 h時略有降低，隨后繼續上升。降低的原因可能是由于長時間的水浴影響了AAE中多糖的分子鏈，對多糖結構造成了破壞，萃取到的有效成分降低，AAE提取率微降，之后被破壞的各種成分也被析出，提取率又上升[16]。因此，水浴時間8 h為宜。

2.1.3單因素溫度對AAE提取率的影響

由圖1(c)可知，在25～85 ℃范圍內，隨水浴溫度的升高，55 ℃的提取率極顯著高于25 ℃和40 ℃(P<0.01)，而55 ℃、70 ℃和85 ℃組間差異不顯著(P>0.05)。隨著水浴溫度的逐漸升高，溶液體系中AAE有效成分多糖的析出導致提取液黏度降低，擴散系數增加，加速分子的運動，提取率快速上升[14]，當提取溫度達到55 ℃后，提取率基本不發生太大變化，可能是由于溶劑的揮發，導致有效成分損失，在70 ℃時提取率較高為18.26%。在用超聲波法提取蒿屬植物的研究結果與本試驗類似，75～80 ℃ 時提取率會有下降的趨勢[13-14]。當水浴溫度100 ℃時達到峰值且極顯著高于其余各組(P<0.01)，但溶劑損耗較大，多數熱敏成分不耐高溫而失活，故選取70 ℃為較佳的水浴溫度。

同一圖中不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同。Different small letters indicate significant difference between treatments in the same figure (P<0.05). The same as below.圖1 料液比(a)、水浴時間(b)和水浴溫度(c)對艾蒿水提物提取率的影響Fig.1 Effect of soild-liquid ratio (a), time (b) and temperature (c) on the yield of AAE with water as solvent

2.2 響應面優化設計

2.2.1試驗設計與分析

據單因素試驗結果，選定液料比(A)、水浴時間(B)和水浴溫度(C)為自變量，AAE提取率(Y)為響應值，利用Box-Behnken設計原理進行3因素3水平試驗設計，結果見表2。

將表2試驗結果進行二次回歸擬合，得到AAE的多元回歸方程為：Y=18.91+1.97A-0.097B+1.02C-0.34AB-0.19AC-0.019BC-0.18A2-0.78B2-1.74C2。對表2所得數據運用Design-Expert 8.0.6軟件進行方差分析，結果見表3。

表2 響應面分析優化Table 2 Optimization of response surface analysis

由表3可知，模型P<0.001極顯著，得知模型所得方程與實際數據非常擬合，可用該模型設計試驗優化AAE的提取工藝。失擬項P=0.116 8>0.05，差異不顯著，說明該試驗誤差小，模型殘差由隨機誤差產生。決定系數R2=0.942，表明試驗值與預測值之間密切相關，即所選變量可影響AAE提取量中94.20%的變化量。一次項料液比和水浴溫度對AAE提取率的影響極顯著(P<0.01)，但水浴時間差異不顯著(P>0.05)；各因素間的互作作用差異也均不顯著(P>0.05)；二次項C2水浴溫度對AAE提取率的影響極顯著(P<0.01)。再根據F分布和P值可知影響AAE提取率的順序為：液料比(A)>水浴溫度(C)>水浴時間(B)。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

2.2.2因素間的交互作用

3個因素中固定其中1個因素，對另外2個因素進行分析得到響應曲面，曲面越陡峭，說明影響越顯著[17]。各因素對響應值的影響結果如圖所示，由圖可知,響應曲面開口均向下，圖3中料液比和水浴溫度所得3D曲面較圖2與圖4相比較陡，但差異仍不顯著。當對應等高線為圓形時，表明交互作用為不顯著[16]。因此，液料比、水浴時間和水浴溫度兩者間交互作用均不顯著(P>0.05)，此結果與表2所得結果一致。

圖2 料液比與時間交互作用的等高線圖(a)和響應面圖(b)Fig.2 Contour plot (a) and response surface plot (b) showing the effects of solid-liquid ratio and time

圖3 料液比與溫度交互作用的等高線圖(a)和響應面圖(b)Fig.3 Contour plot (a) and response surface plot (b) showing the effects of solid-liquid ratio and temperature

2.2.3驗證試驗

該試驗設計優化后的最佳提取工藝條件為：液料比1∶25、水浴時間9.99 h、水浴溫度83.61 ℃。結合試驗條件的可行性，將實際操作改良為液料比1∶25、水浴時間10 h、水浴溫度84 ℃，在此條件下重復3次試驗，AAE平均提取率為18.05%(n=3)，與理論預測值18.01%的相對偏差為0.24%且差異不顯著(P>0.05)，闡明通過響應面優化后所得參數真實可靠，水浴處理可提高AAE提取含量。

2.3 AAE的抗氧化活性測定

2.3.1AAE的鐵離子還原力

鐵離子還原力主要是檢測三價鐵離子被還原為二價鐵離子的能力，廣泛應用于植物提取物的還原力測定，當測得吸光值越高時，則證實還原力越高，抗氧化活性越高[18]。不同濃度AAE與陽性對照Vc對鐵離子還原力的測定見圖5(a)，在0.04～0.4 mg/mL 測定范圍之內，Vc吸光值在0.12 mg/mL之前先快速上升隨后趨于平緩增加狀態，樣品吸光值隨AAE濃度的增大而增大，當樣品濃度為 0.4 mg/mL 時，Vc吸光值高達250.25%，而AAE達到最大值122.70%，說明AAE有明顯的還原能力，是一種有效的還原劑，但活性弱于同濃度下的Vc。

2.3.2AAE的DPPH自由基清除能力

DPPH的自由基相對穩定，試驗操作簡單，雖部分溶于水的有效成分會被乙醇析出，造成溶液渾濁吸光值較大，但溶于水的成分比例較低，待反應結束后離心即可減少誤差，結果較為準確，是多數學者選擇測定體外抗氧化的常用指標[19]。不同濃度AAE與陽性對照Vc對DPPH自由基的清除能力見圖5(b)，在0.04～0.4 mg/mL測定范圍之內，Vc清除率由0.04 mg/mL的83.04%上升到 0.08 mg/mL 的95.83%時即為最大值，而后基本保持不變。樣品清除率為0.04～0.16 mg/mL時呈正相關，隨后趨于平穩，當樣品濃度為0.28 mg/mL時，Vc清除率高達95.72%，而AAE的清除率達到最大值81.99%，據95%的置信區間可求出AAE和Vc的IC50分別為0.102和0.006 mg/mL，IC50數值越低，則清除率越高，由此得出，AAE對DPPH自由基清除的能力雖不及Vc，但仍然具有較強的清除能力，是一種可供選擇的自由基清除劑。

2.3.3AAE的羥自由基(·OH)清除能力

AAE通過抑制·OH的氧化作用，使鄰二氮菲-Fe2+無法氧化成鄰二氮菲-Fe3+，待測液清澈，使510 nm處的吸光值升高，可間接反應出提取物抗氧化活性的強弱[17]。不同濃度AAE與陽性對照Vc對羥自由基的清除能力見圖5(c)，在0.04～0.4 mg/mL測定范圍之內，Vc清除率隨AAE濃度的增加而增大，呈線性關系，樣品清除率在0.32 mg/mL前也呈線性增加趨勢，之后緩慢增加至樣品濃度為 0.4 mg/mL 時達最大值42.41%，同等濃條件下Vc清除率達到69.11%。據95%的置信區間可計算出AAE和Vc的IC50分別為0.311和0.175 mg/mL。這說明與陽性對照Vc相比，AAE的羥自由基清除率低于Vc，但仍然具有清除自由基的能力，也具備一定的抗氧化活性。

圖5 艾蒿水提物鐵還原力(a)、清除DPPH自由基(b)和羥自由基(c)能力的測定結果Fig.5 The iron reduction capacity (a), on DPPH (b) and hydroxyl (c) free radical scavenging ability of AAE

3 討 論

不同提取方法對艾蒿進行提取所得成分和提取率均不同。研究表明，利用醇提法提取艾草生物堿的提取率為0.382 7 mg/g[4]。利用水蒸汽蒸餾法對艾葉揮發油和多糖進行聯合提取，提取率分別為0.43%和2.72%[5]。利用微波輔助提取艾草黃酮，其得率較高為4.37%[6]。本研究選用水提法，在單因素試驗的基礎上，以料液比、水浴時間和溫度為自變量，艾蒿水提物的提取率為響應值，進行響應面優化。響應面法是一種可實現提取工藝參數優化的方法，能夠考慮影響因素之間的交互作用，將自變量與因變量之間的函數關系以圖形展示，不僅使數據更加直觀明確，還能提高提取率。本試驗結果表明，從最佳提取工藝條件的結果來看，AAE的平均提取率為18.05%。據報道，傳統水提法在未優化前的提取率僅為0.50%[20]，在本課題組前期研究中測得最高提取率也只是8.04%[10]，所以本試驗所得的AAE提取率18.05%為目前文獻報道艾蒿水提工藝方面較高水平，為實現工業化生產AAE飼料添加劑提供參考依據。

本實驗室前期研究表明，在肉仔雞飼料中添加適宜劑量的AAE，可顯著提高機體的抗氧化功能[1]。但AAE在體外是否仍然具有很高的抗氧化活性,目前尚未有研究報道。本試驗通過檢測AAE體外抗氧化活性發現，首先AAE在試驗濃度條件下，與鐵離子的還原能力呈正相關。本試驗中濃度為 0.4 mg/mL 時的AAE與趙文竹等[21]研究中 6 mg/mL 生姜水提取物相比，鐵離子還原力相當，表明艾蒿水提物對鐵離子還原力的作用效果優于生姜水提物。其次艾蒿水提物對DPPH自由基具有較強的清除能力。研究表明，AAE的DPPH清除能力(IC50=0.102 mg/mL)僅次于五花茶復配水提物(IC50=0.098 mg/mL)和槐花水提物(IC50=0.099 mg/mL)，但略高于菊花水提物(IC50=0.141 mg/mL)和金銀花水提物(IC50=0.146 mg/mL)，還是代代花和白扁豆花水提物的7倍[22]。此外，本研究結果與陳勝軍等[23]研究結果相比較，DPPH清除能力更是達到舌狀蜈蚣藻水提物的124倍之高。最后，本試驗結果表明，隨樣品濃度的增加艾蒿水提物對 ·OH 自由基的清除能力逐步提高，通過與文獻中舌狀蜈蚣藻水提物(IC50=2.05 mg/mL)和方竹筍廢筍渣水提取物(IC50=1.93 mg/mL)相比較，發現AAE(IC50=0.311 mg/mL)對羥自由基的清除能力均明顯優于上述水提物[23-24]。綜上所述，經過響應面優化，提取率有所提升，且艾蒿水提物是一種有效的體外抗氧化劑。但本研究仍然存在不足之處，提取率與影響因素之間的具體作用關系仍不清楚，因此在后續研究中，將對不同條件下的提取物，測定抗氧化活性，檢測各活性成分含量及結構等，為艾蒿資源的高效利用提供理論依據。

4 結 論

本研究以艾蒿為原料，水為溶劑，結合單因素和響應面分析方法，優化艾蒿的水提工藝，確定最佳水提條件為：料液比1∶25，84 ℃水浴10 h。按此條件驗證得出AAE提取率為18.05%。隨后體外抗氧化試驗表明AAE有較強的鐵還原力，DPPH和·OH自由基的清除作用，但抗氧化活性弱于Vc，這說明AAE可以作為一種良好的天然抗氧化劑來源，有助于開發艾蒿的潛在價值。