益母草堿對心肌重構大鼠ACE2、AngⅡ及Ang1-7的影響研究

盧麗娜 陳浩 彭學勤 袁露 林昌洋 楊輝 魏國微 楊冬花△

(1.貴州省人民醫院干醫科；2.貴陽中醫學院2017級研究生；3.貴州省人民醫院病理科，貴州 貴陽 550002)

心力衰竭時腎素-血管緊張素系統(rennin angiotensin system ,RAS)激活，在心肌重構及心力衰竭的發生發展過程中起重要作用。近年發現的RSA新成員ACE2，可直接將AngⅡ轉化生成Ang(1-7)，而Ang(1-7)具有抑制心肌重構的生物學功能[1]，因此，調節ACE2、AngⅡ、Ang(1-7)合成，已成為抑制心肌重構的作用靶點。在心衰的治療中，中醫藥與西藥具有協同作用，益氣溫陽、活血化瘀、利水為主要治療方法[2]。課題組前期研究發現益氣溫陽活血方從多途徑、多靶點抑制心肌重構[3]，益母草堿是益氣溫陽活血方的主要有效成分，前期研究進一步發現高劑量益母草堿(30 mg/kg/d)可減少慢性心力衰竭大鼠血清心房利鈉肽(atrial natriuretic peptide，ANP)、AngⅡ含量，抑制心肌重構[4]，但益母草堿是否可以通過影響ACE2、AngII、Ang1-7的濃度抑制心肌重構目前尚不明確。本研究通過觀察益母草堿治療后心肌重構大鼠血清及左心室肌組織ACE2、AngⅡ、Ang1-7濃度的變化，進一步探討益母草堿抑制心肌重構的可能作用機制。報告如下。

1 材料與方法

1.1材料 實驗動物為SD雄性大鼠70只，由重慶騰鑫比爾實驗動物銷售有限公司提供，合格證號：SCXK(軍)2012-0011；試劑與儀器為異丙腎上腺素(上海禾豐制藥有限公司)，益母草堿(上海騰準生物科技有限公司)，DIZE(Sigma公司)，ACE2、Ang1-7ELISA試劑盒(上海澤葉生物科技有限公司)，AngⅡ ELISA試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司)，CTGF、FN免疫組化試劑盒(北京博奧森公司)，心臟超聲儀(PHILIPS-IE33)，酶標儀(北京新風機電公司)，倒置顯微鏡(Olympus公司)，石蠟包埋機(LEICA-EG1150H)。

1.2方法 (1)動物分組及治療：70只健康SD雄性大鼠，體質量200±30g，在動物房同批飼養7 d后隨機分為正常組8只和實驗組62只。動物模型制備、分組及益母草堿給藥劑量參考前期研究[5]：以異丙腎上腺素(5 mg/kg/d)連續2w腹腔注射誘導大鼠心肌重構模型，2周后實驗組存活大鼠55只，以心臟超聲評價心衰模型是否成功。將存活且造模成功大鼠50只隨機分五組：模型組、DIZE組、益母草堿低劑量組(低劑量組)、益母草堿中劑量組(中劑量組)、益母草堿高劑量組(高劑量組)，每組10只。各組干預治療方法：DIZE組予DIZE 15mg/kg/d腹腔注射，益母草堿低、中、高劑量組分別予益母草堿7.5 mg/kg/d、15 mg/kg/d及30 mg/kg/d腹腔注射，正常對照組和模型組給予相同體積生理鹽水腹腔注射，每日1次，共干預治療2周。(2)試驗結束后以超聲心動圖檢查：以5%水合氯醛進行腹腔注射麻醉，將大鼠仰臥固定，剃凈胸毛，以PHILIPS-IE33超聲儀，頻率12.0MHz超聲探頭檢測各組大鼠LVEDd、LVEDs、FS%、EF%，取3個連續心動周期測量平均值。(3)血清及心肌組織ACE2、AngⅡ、Ang 1-7含量檢測：采集頸動脈血，取血清于-70℃冰箱保存；處死大鼠，取心肌組織液氮凍存，將凍存的心肌組織按10 %(重量體積)加入預冷生理鹽水，快速剪碎，勻漿器碾磨，以4℃3 000r/min離心20min，取上清液于-70℃冰箱保存，同批與血清以ELISA法檢測各組ACE2及AngⅡ、Ang 1-7水平，操作按試劑盒說明進行。(4)HE染色：取左心室肌組織，以10%甲醛固定，石蠟包埋，切片后脫蠟，行HE染色，脫水封片，在顯微鏡下觀察心肌組織形態。(5)Masson染色：取左心室肌組織，以10%甲醛固定，石蠟包埋，切片后脫蠟，進行Masson染色，染色后心肌膠原纖維呈藍色，在顯微鏡下取5個視野平均值，用圖像分析軟件ImagePro Plus 6.0計算CVF值，CVF(%)=心肌膠原面積/照片面積×100%。(6)免疫組織化學法觀察左心室肌組織CTGF、FN的表達：取0.5×0.5 cm2大小左心室肌組織，以10%甲醛固定，石蠟包埋、切片、脫蠟、復水、煮沸法修復，按照SP法免疫組化試劑盒說明操作，CTGF、FN一抗按1:300稀釋，PBS代替一抗作為空白對照。在顯微鏡下取5個視野平均值，用圖像分析軟件ImagePro Plus 6.0測量平均光密度，平均光密度(%)=積分光密度/照片面積×100%。

2 結 果

2.1心臟超聲檢測 結果與正常組比較，其他各組大鼠LVEDd、LVEDs值升高，而FS%、EF%值下降，差異有統計學意義(P<0.05)；與模型組比較，DIZE組、益母草堿高劑量組LVEDd、LVEDs值明顯下降，而FS%、EF%值明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，LVEDd、LVEDs、FS%、EF%在DIZE組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1。

表1 各組大鼠心臟超聲檢測值

圖1 各組大鼠心臟超聲結構變化

2.2心肌組織HE染色 正常組心肌細胞大小正常，排列規整，結構清晰，細胞核大小形態正常，細胞間質無水腫，無明顯纖維增生；模型組心肌細胞肥大，形態結構模糊，肌纖維溶解，細胞排列紊亂，見明顯纖維增生及炎性細胞浸潤；DIZE組及高劑量益母草堿組心肌細胞形態較清晰，排列較規整，纖維增生及炎性細胞浸潤明顯減少；而益母草堿低、中劑量組與模型組比較變化不明顯。見圖2。

圖2 各組大鼠心肌組織HE染色(×200)

2.3心肌組織Masson染色 經Masson染色顯示心肌細胞呈紅色，膠原纖維呈藍綠色，正常組細胞間無明顯膠原纖維沉積，心肌細胞排列整齊，結構清晰；模型組見大量膠原纖維增生，呈網狀交織、堆積成團成片，心肌細胞腫脹，結構模糊，排列紊亂；DIZE組及高劑量益母草堿組膠原纖維增生明顯減少，心肌細胞形態結構較清晰。與正常組比較，其他各組大鼠CVF明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較，DIZE組、益母草堿高劑量組CVF明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；CVF在DIZE組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠心肌組織Masson染色(×200)

2.4心肌組織CTGF、FN蛋白質表達水平的檢測 與正常組比較，其他各組大鼠心肌組織CTGF、FN蛋白質表達水平明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較，DIZE組、益母草堿高劑量組CTGF、FN蛋白質表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；CTGF、FN在 DIZE組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表2，圖4-5。

表2 各組大鼠心肌組織CVF及CTGF、FN蛋白質表達水平的檢測

圖4 各組大鼠心肌組織CTGF表達(×200) 圖5 各組大鼠心肌組織FN表達(×200)

2.5血清及左心室肌組織ACE2、AngⅡ、Ang 1-7含量檢測 與正常組比較，其他各組大鼠血清及左心室肌組織ACE2、AngⅡ、Ang1-7含量均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，與模型組比較，DIZE組、益母草堿高劑量組ACE2、Ang1-7含量明顯升高，AngⅡ含量明顯降低，差異有統計學意義(P<0.05)；ACE2、AngⅡ、Ang 1-7在DIZE組和益母草堿高劑量組組間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 各組大鼠血清及心肌組織AngⅡ、ACE2、Ang 1-7的含量

3討 論

心肌重構是多種心血管疾病發展至心力衰竭的基本病理機制，是在多種生長因子、激素刺激下出現的心肌細胞結構及功能改變，主要表現為心肌細胞肥大、凋亡、細胞外基質的過度纖維化[6]。生長因子CTGF可刺激成纖維細胞增殖及膠原沉積，促進心肌纖維化及心肌重構[7]，FN是重要的細胞外基質，也有促進心肌纖維化及心肌重構的作用[8]，CTGF和FN是心肌纖維化的重要病理學標記物。

本研究通過異丙腎上腺素誘導心肌重構大鼠模型，心臟超聲結果顯示其LVEDd、LVEDs升高，FS%、EF%下降，大鼠心臟結構發生改變，心臟功能下降；HE染色見心肌細胞肥大或固縮、排列紊亂，Masson染色見膠原纖維明顯增生，免疫組化顯示CTGF、FN蛋白質的表達水平明顯升高，從影像學及病理形態學提示造模成功。為觀察益母草堿對心肌重構是否有抑制作用，本研究予益母草堿低、中、高劑量(7.5 mg/kg/d、15 mg/kg/d、30 mg/kg/d)進行干預治療，結果發現，高劑量益母草堿干預后大鼠心臟LVEDd、LVEDs明顯下降，FS%、EF%明顯升高，提示高劑量益母草堿可改善心肌重構大鼠心臟結構和功能異常；經HE染色和Masson染色結果顯示高劑量益母草堿組心肌組織心肌的細胞形態結構較清晰，膠原纖維增生明顯減輕，且免疫組織化學檢測顯示CTGF、FN蛋白質的表達水平也明顯下降，提示高劑量益母草堿可改善大鼠心肌重構病理形態學異常。本研究結果還顯示，高劑量益母草堿組大鼠血清及心肌組織AngⅡ含量明顯降低，而ACE2、Ang1-7含量明顯升高，綜合影像學、病理學檢查結果，與ACE2內源性激動劑DIZE組效應一致。心衰時RAS系統的激活是引起心肌重構的重要原因，AngⅡ水平升高，可直接刺激心肌細胞增殖肥大和醛固酮分泌增加，進一步加重水鈉潴留、促進膠原合成及心肌纖維化。AngⅡ作為刺激因子，還可激活(p38 mitogen-activated protein kinase,p38MAPK)信號通路，p38MAPK是MAPK信號通路的重要途徑，激活后可致心肌細胞肥大、細胞凋亡失調，引起炎性反應、成纖維細胞活化，促進心肌重構[9]。ACE2是2000年發現的RAS新成員，與ACE具有較高的同源性[10]，它是RAS系統重要的負調控因子，在心臟心肌細胞、成纖維細胞、血管內皮細胞等均有表達，可催化AngⅡ生成Ang1-7，而Ang1-7與其特異性抗體Max結合發揮拮抗AngⅡ的生物學效應[11]。研究[12]發現，心力衰竭時ACE2水平升高，且心衰程度越重，ACE2水平越高，雖然ACE2升高，但同時ACE升高更加顯著，ACE/ACE2比值升高，ACE2不足以對抗ACE對心肌的毒害作用[13]。結合本研究模型組ACE2水平升高，推測在心肌重構發生過程中，ACE2升高作為一種代償機制，刺激Ang1-7水平進一步升高，但此時升高的水平不足以對抗ACE-AngⅡ-AT1軸的不利作用。DIZE作為ACE2的內源性激活劑，本實驗予DIZE干預治療后，ACE2及Ang1-7水平進一步升高，產生了可以和ACE-AngⅡ-AT1軸相平衡的效應，心肌重構得以改善，高劑量益母草堿具有和DIZE相同的干預治療效果。

現有的研究證實，Ang1-7抑制MAPK信號通路，降低心肌組織p38MAPK的蛋白磷酸化水平[14]，從而抑制心肌重構[15]。課題組前期研究發現，高劑量益母草堿可通過抑制p38MAPK信號通路逆轉心肌重構[5,16,17]，結合本研究結果及前期研究，推測高劑量益母草堿抑制大鼠心肌重構，其機制可能與升高ACE2水平轉化AngII生成Ang1-7，進而抑制p38MAPK信號通路活化有關，具體機制有待進一步研究。