人羊膜間充質細胞誘導成骨及與膠原-明膠海綿載體復合的實驗研究

王芳 宋慶高 郭佳男 陳尚 何葦 鄒亞莉

(遵義醫科大學附屬口腔醫院口腔頜面外科，貴州 遵義 563000)

牙槽突裂常與唇腭裂并發，是最常見的先天顱面部發育畸形之一，但目前的治療手段效果不盡人意。近年來，隨著組織工程及干細胞技術的興起，學界普遍認為這將有望是修復牙槽突裂的新方法。而有研究發現，羊膜來源的干細胞免疫原性低，具有免疫調節和免疫抑制作用等優點，同時來源豐富、擴增能力強、易于富集，且無醫學倫理學的爭議[2-3]，具有作為修復人體組織的種子細胞的特性和潛力。由于先天性牙槽突裂往往在出生時才被發現，若此時患者自身的羊膜在其后期的修復上可以得到充分的利用，相較于其他來源的干細胞就可以不用考慮免疫排斥反應的問題。因此，本研究以人羊膜間充質細胞(human amniotic mesenchymal cells，hAMCs)及經成骨誘導的hAMCs作為種子細胞，并將其負載于膠原-明膠海綿上進行復合培養，為將來動物實驗及臨床應用修復牙槽突裂缺損提供前期體外實驗基礎。報告如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 (1)組織標本的采集和實驗分組:經遵義醫科大學附屬醫院倫理委員會批準以及產婦知情同意后，從遵義醫科大學附屬醫院手術室無菌采集8例足月剖宮產胎盤，hAMCs的分離培養在采集后2 h內進行。培養至第三代后隨機分為正常培養基培養的正常對照組和成骨誘導培養基培養的成骨誘導分化組。(2)實驗試劑為：膠原酶Ⅱ(美國Sigma公司)，胰蛋白酶(美國Amreseo公司)，DNaseⅠ(美國Worthington公司)，FBS(美國Gibco公司)，L-glutamine(美國Hyclone公司)，L-DMEM(美國Gibco公司)，人單抗CD29-PE、CD44-PE、CD73-FITC、CD166-FITC、CD34-PE(美國BD公司)，β-甘油磷酸鈉(美國Sigma公司)，地塞米松(瑞士Alexis公司)，維生素C(美國Sigma公司)，明膠海綿(中國南京金陵制藥廠)。(3)實驗儀器為：倒置相差顯微鏡(CX40RF400，日本Olympus公司)，自動顯微照相裝置(PM20-35，日本Olympus公司)，二氧化碳培養箱(3141，美國Forma公司)，流式細胞儀(FACS calibur，美國Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1實驗試劑的配置 L-DMEM培養基:低糖型DMEM培養基干粉1包及NaHCO33.7g，將其溶于1 000 mL超純水中，混勻并調pH值至7.25，過濾除菌，分裝，4℃保存；10% EDTA-2Na:EDTA 100 g及NaOH 15g，將其溶于450 mL蒸餾水(60-70℃)，攪拌直至完全溶解，加入0.2M的PBS 500 mL，調節pH值至7.3，蒸餾水定容為1 000 mL，常溫保存；培養基I:L-DMEM 87 mL，10% FBS(1 mol)，2 mLL-谷氨酰胺，100 u/mL青霉素，0.1mg/mL鏈霉素；成骨誘導培養基:培養基I中加入100 nmol/L地塞米松、50 ug/mL維生素C和10 nmol/L β-甘油磷酸鈉。

1.2.2hAMCs的分離、培養和鑒定 用機械法及酶分離法得到原代hAMCs，培養于培養基I中，培養至第三代用波形蛋白標記后進行免疫組織化學染色，另外同時用多色熒光標記后(熒光標記人單抗CD73-PE、CD44-PE、CD45-PerCP、CD34-PE、CD29-PE-Cy5、CD49d -FITC、CD166-PE)，流式細胞術對其進行分選鑒定，利用Cell Quest軟件進行表型分析。

1.2.3hAMCs的成骨誘導及鑒定 將第三代hAMCs以5×105個/mL密度接種于培養瓶內，待其生長密度達到80-90%的面積后，棄去培養基，換成成骨誘導培養基。于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養生長，每隔3 d更換培養基，于倒置相差顯微鏡下觀察細胞形態變化。誘導21 d后，利用茜素紅進行染色檢測鈣鹽沉積，顯微鏡下觀察并照相。培養瓶中細胞用于后續膠原-明膠海綿載體復合培養實驗。

1.2.4hAMCs與膠原-明膠海綿載體的復合 將膠明膠海綿于超凈臺切成0.3 cm×0.5 cm大小，置于平皿內，用鼠尾膠原浸滿24 h，自然晾干后取出，PBS緩沖液沖洗3次后，再用L-DMEM培養基清洗至培養基不變色。將第3代hAMCs以及經誘導21 d后的hAMCs消化，制成6×106個/mL的細胞懸液，吸取100μl細胞懸液，分別接種于膠原-明膠海綿載體，復合培養72 h后觀察。

1.3統計學方法 采用SPSS 19.0軟件進行統計學數據分析，各組間的數值以單因素方差分析(One-way ANOVE)，以P<0.05表示結果差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1hAMCs的表型分析 倒置相差顯微鏡觀察顯示:第三代hAMCs在培養24 h后，大部分貼壁細胞變為梭形或多角形，接種3-4 d覆蓋面積可達90%以上，細胞呈漩渦狀排列生長。流式細胞術分選結果顯示:第三代hAMCs高表達CD29、CD166 、CD44、CD73、CD49d等間充質干細胞表面標志，但不表達CD34、CD45等造血細胞和MHC-II類分子表面標志(圖1)。免疫組織化學結果顯示:第三代hAMCs波形蛋白染色陽性(圖2)。

2.2hAMCs的成骨分化及鑒定 hAMCs經成骨誘導后細胞形態由長梭性(圖3A)逐漸變成多角形(圖3B)，誘導21 d后被茜素紅染色檢測發現呈紅染的鈣結節(圖3C)。

2.3hAMCs與膠原-明膠海綿復合體 倒置相差顯微鏡觀察顯示:第三代hAMCs與膠原-明膠海綿載體復合培養后的24 h內，細胞貼壁能力較弱，晃動可導致細胞脫離。復合培養72 h后，hAMCs在膠原-明膠海綿上生長牢靠，且在外力作用下不易脫落，細胞數量顯著增多，細胞生長狀況良好(圖4)，膠原-明膠海綿在1周后出現液化降解。

注：A.未作處理的膠原-明膠海綿(×100)；B.hAMCs與膠原-明膠海綿復合培養后即刻(×100)；C.hAMCs與膠原-明膠海綿復合培養后72 h(×100)圖4 hAMCs與膠原-明膠海綿復合培養(箭頭所指為細胞聚集區)

3 討 論

先天性唇腭裂是人類新生兒最常見的出生缺陷之一，且往往合并有牙槽突裂的發生，而對于牙槽突裂的修復重建目前仍以自體髂骨骨松質移植的方法為主，為了避免髂骨量限制及開辟第二術區給患者帶來的痛苦，隨著對組織工程及干細胞的研究越來越深入，近年來越來越多學者的研究主張使用組織工程及干細胞技術骨修復牙槽突裂，遺憾的是仍未尋找到一種理想的種子細胞。自從In't Anker等首先從人羊膜中分離出大量的間充質細胞并發現在特定的環境下可以將其向成骨樣細胞和脂肪樣細胞分化以來，hAMCs逐漸為越來越多研究者們所關注。hAMCs來源于孕婦生產胎兒的遺棄物——胎盤，來源廣泛充足且沒有醫學倫理學的爭議，有研究報道從一份人羊膜所分離的hAMCs的細胞數量可高達(6.72±1.21)×107個，因此數量上也不存在問題，另有研究表明hAMCs表達間充質干細胞的表面標志物，如CD29、CD44、CD71、CD73、CD90、波形蛋白等，不表達CD34、CD45等造血細胞的表面標志。我們的實驗研究結果顯示:本課題組培養的hAMCs中CD73、CD29、CD44、CD166、CD49d高表達，CD34、CD45不表達，因此為高純度的hAMCs，符合后續實驗的需求。而且加入一定的成骨誘導劑可使其向成骨細胞分化，使得hAMCs具有成為利用組織工程手段修復牙槽突裂的種子細胞的潛能。

組織工程技術能否成功與理想的細胞載體密切相關。于開濤等的研究發現，經膠原處理后的明膠海綿更有利于成骨細胞的增殖和分化，同時也證明了明膠海綿是良好的基質材料和組織工程骨良好的載體。王海燕等在經多聚賴氨酸處理過的明膠海綿上接種骨髓間充質干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)，72 h后發現細胞粘附在明膠海綿的深面。1周后明膠海綿開始降解，并成功的向神經元樣細胞分化，研究證實經多聚賴氨酸處理過的明膠海綿與BMSCs具有良好的相容性。結合牙槽突裂修復的特點，其支架材料的選擇更應著重注意良好的可塑性、可降解性及可吸收性，因此，我們采用的是容易獲得，價格低廉，生物相容性好，可吸收，X線可透射，利于成骨細胞增殖分化等特點的明膠海綿。為了使細胞更容易的生長于支架上，對明膠海綿采用膠原預處理。在實驗中觀察到hAMCs種植于膠原-明膠海綿載體上復合培養24 h后，倒置相差顯微鏡觀察見細胞成群生長，48 h后膠原-明膠海綿表面細胞數量明顯增多并連成片狀，72 h后細胞進一步增多且晃動時不易脫落。這些發現都與之前文獻的報道基本一致，也表明了hAMCs與膠原-明膠海綿具有較好的生物相容性。同時，相較于未經成骨誘導的hAMCs，我們觀察到經誘導后的hAMCs的增殖速度有所下降，此外在膠原-明膠海綿上的生長狀況也較差，這可能與hAMCs誘導后其表面標志改變及干細胞特性減弱有關。

綜上，我們的研究結果表明hAMCs具有成骨分化的能力，而且與膠原-明膠海綿載體復合培養后生長良好，顯示了hAMCs具有成為組織工程修復牙槽突裂的種子細胞的潛能，為后續進行動物體內實驗提供了前期體外實驗基礎。

(本文圖1～3見封三)

圖1 ｈＡＭＣｓ表型的流式細胞術分選結果

注：Ａ．波形蛋白染色陽性（如箭頭所示）（×４００）；Ｂ．陰性對照（×４００）圖2 ｈＡＭＣｓ免疫組織化學染色

注：Ａ．誘導前（×１００）；Ｂ．誘導中（×１００）；Ｃ．誘導２１ｄ后發現紅染的鈣結節（如箭頭所示）（×１００）圖3 ｈＡＭＣｓ成骨誘導２１ｄ后茜素紅染色結果