和厚樸酚對TGF-β1誘導的心肌成纖維細胞遷移的影響

譚嘉安，劉英華，張根水，宜 全

(廣州醫科大學藥學院藥理教研室，廣東 廣州 511436)

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是指在心肌缺血性損傷、部分外來性異物或全身性疾病的刺激下導致心肌組織發生嚴重炎癥反應甚至壞死后出現心臟修復反應。在心臟受到損傷后傷口愈合時，心肌成纖維細胞及其活化后的肌成纖維細胞起著關鍵作用：它們產生的纖維化瘢痕取代了受損組織。而纖維化瘢痕組織表現為堅韌缺乏彈性，硬度明顯增加，順應性明顯降低。因此可導致心臟的病理變化，例如心律失常、心力衰竭等[1]。受損心肌中細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分的積累是心肌纖維化過程的特點，正常情況下CFs合成與分泌少量纖連蛋白(fibronectin，FN)、Ⅰ-型膠原蛋白(collagen-1，COL-1)，維護ECM的穩態。然而，在心臟損傷和應激刺激下，受損心肌會募集免疫細胞并釋放大量轉錄生長因子-β (transcription growth factor-β，TGF-β)[2]。TGF-β1在多種器官和組織的纖維化中表達增加，并在調控細胞進程以及ECM包括膠原、FN等起著重要作用[3-4]。在接受TGF-β信號后，靜止的CFs活化并且轉變為MFs，表現出加劇的增殖，遷移和收縮能力，以及過度分泌FN和COL-1的能力[5]。活化的CFs還通過產生粘著相關蛋白促使ECM重塑及在胞外堆積[6]。這些變化共同導致了纖維化心臟的病理變化。因此，靶向受損心肌中的ECM成分蛋白的積累有益于緩解或治療心臟纖維化疾病。

和厚樸酚(honokiol，HKL)提取自中草藥厚樸，具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒的作用，且還具有抗炎抗氧化等藥理作用，能夠用于治療心律失常、心腦缺血/再灌注損傷[7]，因此和厚樸酚在治療心腦血管疾病方面表現出巨大的潛力。

本實驗使用TGF-β1處理誘導的心肌成纖維細胞活化遷移，構建體外的心肌纖維化模型[8]。研究和厚樸酚對TGF-β1誘導的大鼠乳鼠心肌成纖維細胞遷移的作用，檢測細胞外基質蛋白FN、COL-1表達的影響。為心肌纖維化疾病的藥物治療提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物 新生d 1～3的SD大鼠乳鼠，雌雄不限，購自廣東省實驗動物中心。動物使用許可證號：SYXK(粵)2016-0168。

1.1.2試劑 和厚樸酚(批號：F1904059，純度≥98%)購于阿拉丁試劑有限公司；DMEM培養基(Gibco)；胎牛血清(Gibco)；DMSO 、MTT、TGF-β1(批號：0331323)購于Novoprotein公司；Vimentin的一抗購于Santa Crus； GAPDH一抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購于中杉金橋；FN的一抗、COL-1的一抗的一抗均購于武漢三鷹生物技術有限公司；ECL發光液(CST)；

1.1.3儀器 三氣培養箱(美國Thermo)；超凈工作臺(蘇州儀器廠)；電子天平(德國BP2215)；-80 ℃低溫冰箱(美國Thermo)；酶標儀(德國Beckmen)；熒光正置顯微鏡(日本Nikon公司)；低溫高速離心機(德國Hettic)；垂直電泳槽、轉膜儀(美國Bio-Red公司)；自動洗片機(美國Kodak)。

1.2 方法

1.2.1SD乳鼠CFs的提取與培養 全程在無菌操作臺中進行，所有器材提前30 min照射紫外消毒。取新生d 1～2的SD乳鼠，酒精清洗3遍移至超凈臺，倒“T”形打開胸腔，輕輕擠壓乳鼠背部令心臟從開口處露出，使用鑷子快速取下心臟，使用預冷 HBSS緩沖液清洗干凈，然后移至100 mm 培養皿中修剪，并收集心室組織，繼續使用HBSS緩沖液沖洗，剪碎直到所有大的心臟組織碎片被分散為止；加入8 mL的HBSS、2 mL的0.25胰酶(控制HBSS ∶胰酶=4 ∶1) ，封口膜封口至4 ℃冰箱消化14～16 h后取出。吸取所有組織液體混合物至15 mL離心管中，加入2 mL血清終止消化；37 ℃水浴復溫后，加入25XⅡ型膠原酶置于 37 ℃水浴搖床搖晃45 min；取出，吸取離心管中的混合液到200 目濾網中過濾到50 mL 離心管中，加入適量 L-15 細胞培養液到剩余組織中吹打取上清過濾，確保多數細胞從消化后的組織中解離至細胞懸液。離心(1 000 r·min-1，室溫，5 min)，棄去上清，加入5 mL 10% FBS的高糖培養基，使用移液槍輕輕吹打混勻，然后均勻接種至100 mm 直徑的培養皿中，置 37 ℃，5% CO2培養箱中培養 45 min，小心吸棄皿中液體，更換為10% FBS。此時培養皿中貼壁細胞為心肌成纖維細胞，這個過程為差速貼壁分離。通過傳代再差速純化心肌成纖維細胞。

1.2.2CFs的形態以及純度鑒定 將差速貼壁分離分離的CFs培養至90%以上進行傳代，然后以1.0×104個/皿接種至共聚焦小皿中，24 h后更換10%FBS。在細胞匯合度達到60%時，使用預熱的PBS緩沖液洗去培養基，再用4%的多聚甲醛固定20 min。用PBS緩沖液輕輕晃洗4次吸干。1%的曲通破膜30 min，處理然后用PBS緩沖液洗去殘余曲通；100 mmol甘氨酸封閉，PBS緩沖液清洗5 min×3次；5% BSA封閉1 h后加入心肌成纖維細胞骨架成分Vimentin(1 ∶500)一抗，4 ℃過夜。d 2取出后使用PBST清洗5 min×4次，室溫孵育相應的熒光二抗1 h，后面過程均避光操作。然后用PBST清洗5 min×3次；加入細胞核染液DAPI室溫孵育10 min，先用PBST清洗5 min×3次，再用超純水輕輕晃洗2次；往共聚焦小皿中加入適量的抗淬滅劑，于正置熒光顯微鏡下分析樣本，拍照記錄。

1.2.3MTT檢測不同濃度的TGF-β1對CFs活力的影響 將處于指數增長期的CFs進行消化傳代處理，然后以7×103/孔進行接種至96孔板，放置三氣培養箱培養24 h。設置對照組(正常成纖維細胞)，TGF-β1組(2.5、5、10、20、40 pg·L-1)，培養24 h。每孔加入100 μL用PBS稀釋的0.5 g·L-1的MTT溶液，在三氣培養箱中孵育3～4 h。從培養箱中取出，可使用0.5 mL規格的注射器小心吸棄孔內培養上清液，每孔加150 μL DMSO，震蕩10 min，使孔內紫色結晶物充分溶解。于490 nm處測定吸光度(OD)值。

1.2.4劃痕實驗檢測和厚樸酚對CFs遷移的影響 所有器材均經過紫外消毒30 min。在6孔板背部橫著用marker筆畫5道直線，大約每道間隔0.5 cm。將處于指數增長期的心肌成纖維進行消化傳代處理，然后以5×105/孔均勻接種于6孔板中，放置三氣培養箱培養。設置對照組(正常成纖維細胞)，模型組(僅加入10 pg·L-1的TGF-β1)，給藥組(含10 pg·L-1TGF-β1并依次加入1、2.5、5 μmol·L-1的和厚樸酚)，對照藥組(小檗堿10 μmol·L-1)，在0.1%FBS條件下培養，24 h后在正置顯微鏡下拍照記錄。通過比較0 h刮擦面積百分比之間的差異來分析數據。

1.2.5激光共聚焦檢測纖連蛋白FN的表達 將差速貼壁分離分離的CFs培養至90%以上進行傳代，然后以1.0×104個/皿接種至共聚焦小皿中，培養24 h。設置對照組，模型組(10 pg·L-1的TGF-β1)，給藥組(TGF-β1+HKL5 μmol·L-1),給藥處理24 h后取出。按照“1.2.2”項所述的免疫熒光步驟操作，孵育Vimentin(1 ∶500)、FN(1 ∶400)一抗4 ℃過夜。d 2取出后使用PBST清洗5 min×4次，熒光二抗室溫避光孵育45 min，后面步驟參見“1.2.2”。最后加入抗淬滅劑，于正置熒光顯微鏡下分析樣本，拍照記錄。

1.2.6Western blot檢測相關蛋白的表達 將差速貼壁分離的CFs培養至90%以上進行傳代，然后以4.5×105個/皿接種至60 mm培養皿中，24 h后更換10% FBS。待細胞匯合度為75%時進行給藥處理，設置分組對照組、模型組(10 pg·L-1TGF-β1)、給藥處理組(1、2.5、5 μmol·L-1的和厚樸酚)。放置三氣培養箱24 h后取出，預冷的PBS輕輕晃洗3次，使用濾紙吸干殘余水分，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液裂解30 min，刮下離心收集上清。使用蛋白定量試劑盒測定待測樣品總蛋白濃度，制備蛋白上樣液。經過上樣-電泳-轉膜的過程將蛋白轉移至PVDF膜上，使用體積分數為3的BSA室溫封閉2 h。孵育一抗，FN(1 ∶500)、COL-1(1 ∶1 000)、GAPDH(1 ∶5 000), 4 ℃孵育過夜。TBST洗膜5 min×3次。室溫孵育二抗1 h，TBST洗膜10 min×4次，ECL化學發光法檢測。

2 結果

2.1 CFs的形態以及純度從Fig 1可以觀察到，大鼠乳鼠心肌成纖維細胞為扁平狀不規則的多邊形細胞，對多個視野下的細胞使用ImageJ進行細胞計數，統計得到使用差速貼壁分離的得到的細胞中心肌成纖維占0.954 6±0.017 0。

2.2 TGF-β1對CFs增殖的影響如Fig 2所示，與Control組比較，使用不同TGF-β1處理成纖維細胞24 h時，在10 pg·L-1時能夠明顯促進成纖維細胞增殖，結果差異具有統計學意義(P<0.05)，我們采用TGF-β1為10 pg·L-1作為后續實驗濃度。

Fig 1 Morphology identification of CFs

Fig 2 Effect of different concentrations of TGF-β1 on cell activity n=3)*P<0.05 vs control

2.3 HKL對TGF-β1刺激后CFs遷移能力的影響劃痕實驗中將所有組對應同一個視野下的兩個時間點劃痕面積進行統計，結果顯示，與空白對照組相比，采用TGF-β1處理的成纖維細胞傷口愈合更快(P<0.05)；與模型組(TGF-β1)組相比，和厚樸酚能夠抑制TGF-β1處理后的傷口愈合速率(P<0.01)，即和厚樸酚能夠抑制TGF-β1刺激后成纖維細胞遷移能力。

2.4 HKL對TGF-β1刺激后成FN蛋白分泌的影響Fig 4的免疫熒光結果表明，與正常對照組相比，TGF-β1(10 pg·L-1)處理組FN蛋白熒光強度增加，而與TGF-β1組相比，HKL(5 μmol·L-1)組FN蛋白熒光強度減弱，提示和厚樸酚能夠抑制TGF-β1刺激后成纖維FN分泌。

Fig 3 Effect of different concentrations of HKL on CFs migration induced by TGF-β1 n=3)*P<0.05 vs control; #P<0.05, ##P<0.01 vs TGF-β1

Fig 4 Effect of HKL on FN secretion after TGF-β1 stimulation

2.5 CFs對TGF-β1誘導的CFs中FN、COL-1蛋白表達的影響如Fig 5所示，與空白對照組相比，使用TGF-β1處理后FN蛋白表達水平明顯增高(P<0.01)，給予和厚樸酚處理后，FN蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。經TGF-β1處理24 h后COL-1蛋白表達水平升高(P<0.05)，給予和厚樸酚處理后能夠明顯降低COL-1蛋白表達(P<0.01)。

Fig 5 Effect of HKL on expression of FN and COL-1 induced by TGF-β1 n=3 )*P<0.05, **P<0.01 vs control; ##P<0.01 vs TGF-β1

3 討論

活化的纖維細胞介導的纖維化組織重塑發生在大多數器官中，特別是在硬皮病、動脈粥樣硬化、心力衰竭、肝硬化、腎纖維化和許多癌癥等主要疾病的末期。當心臟在各種因素誘導下發生纖維化時能夠導致心律失常、心功能紊亂、心力衰竭等不良后果。在纖維化過程中，成纖維細胞受到多種細胞因子的刺激后活化，而活化的成纖維細胞是主要的效應細胞。活化的成纖維細胞也稱為肌成纖維細胞，是一類高度收縮的細胞類型，其特征是過多的沉積細胞外基質(ECM)蛋白，這也是纖維化發生的特點和標志。纖維化是一個多種信號通路并存的過程，它與轉化生長因子β(TGF-β)/Smad信號傳導，炎癥和氧化應激信號傳導，腎素-血管緊張素系統，Wnt/β-catenin信號通路和脂質代謝都有關。其中最經典的是TGF-β/Smad途徑，TGF-β/Smad級聯反應由三元信號復合物組成，當TGF-β1與轉化生長因子β 受體Ⅱ(TGFβRⅡ)相互作用時，TGF-β1受體I被激活，繼而磷酸化細胞質介體Smad2和Smad3，并與Smad4形成異源三聚體復合物，然后移位進入細胞核，結合共有序列，并調節基因轉錄。有文獻報導，TGF-β1可以經TGF-β/Smads信號通路參與調節心肌成纖維細胞的增殖、轉化、遷移和ECM的產生, TGF-β1是促MF的最主要因素[9]。本研究通過使用TGF-β1刺激心肌成纖維細胞建立心肌纖維化的體外模型，在10 pg·L-1時能夠刺激成纖維增殖，同時劃痕實驗結果表明，在該濃度下成纖維細胞遷移速度增加，當給予和厚樸酚處理后，能夠以濃度依賴的抑制成纖維的遷移[10]。在心臟纖維化過程中，心肌梗死等原因誘導成纖維細胞大量增殖，隨后遷移到受損部位活化為肌成纖維[11]。當心肌成纖維活化后會分泌FN及COL-1等細胞外基質并沉積在細胞周圍，并以此改變肌成纖維的細胞網絡微環境，從而影響心臟功能，最終導致心臟纖維化[12]。故抑制受損心臟中的成纖維的遷移和活化，可以改善細胞外基質ECM的分泌沉積。

在我們的實驗結果中，使用TGF-β1刺激成纖維細胞后，對FN蛋白進行熒光標記并通過共聚焦顯微成像技術觀察到，與空白對照組相比，成纖維細胞內外的熒光更強烈，而在使用TGF-β1刺激的同時給予和厚樸酚處理，能夠減弱成纖維細胞內外的熒光強度，該結果表明，和厚樸酚能夠抑制TGF-β1刺激后FN蛋白的分泌。盡管膠原蛋白是心臟中最豐富的ECM蛋白，但細胞纖連蛋白在心臟纖維化中起關鍵作用。有文獻報道，纖連蛋白能夠與整合素、纖維蛋白等細胞表面受體相互作用，在基質組織和細胞-基質相互作用中充當橋接分子，當FN蛋白聚合到細胞外基質中才能使I型膠原蛋白沉積共同介導纖維化過程[13]。最近研究報道，在心力衰竭的體內模型中，抑制FN聚合或心臟成纖維細胞基因表達可減弱MF的病理學特性，并改善不良的心臟重塑和纖維化[6]。同時還有研究表明，二甲雙胍能夠抑制博來霉素誘導的肺纖維化，機制是抑制胰島素樣生長因子-1介導的FN蛋白、α-SMA、I型和III型膠原的產生進而抑制小鼠肺纖維化[14]。因此，干預細胞FN蛋白的生成和沉積，能夠減輕心臟纖維化，改善心臟功能。

為量化和厚樸酚對TGF-β1刺激的成纖維細胞中FN蛋白以及COL-1蛋白表達變化，隨后我們使用TGF-β1刺激原代成纖維，并用高中低濃度的和厚樸酚給予治療。Western blot結果表明，與模型組相比，和厚樸酚能夠降低FN、COL-1蛋白的表達水平，這提示和厚樸酚可以減少TGF-β1誘導的CFs細胞外基質蛋白FN和COL-1的分泌與沉積。多項研究表明，和厚樸酚能夠抑制多種器官纖維化，他們共同機制可能是通過TGF-β1/SMAD2/3信號通路實現[15]。

綜上，我們發現HKL能夠減輕TGF-β1誘導的CFs的遷移，抑制成纖維在受損心肌部位的聚集和活化，從而影響FN蛋白、COL-1蛋白的分泌和沉積，最終改善心臟纖維化。因此，和厚樸酚對心肌纖維化過程中抑制FN、COL-1蛋白的沉積作用的發現，將為開發新的抗心肌纖維化藥物提供實驗參考。