白方腐乳開蓋后儲藏過程中生物胺和理化指標的變化

馬艷莉,席曉麗,李大偉,梁靜靜,丁玉峰,李素萍,王 頡,孫劍鋒,*(1.南陽理工學院生物與化學工程學院,河南南陽 473004;.河北農業大學食品科技學院,河北保定 071000)

腐乳是以大豆為原料,經加工磨漿、制坯、培菌、發酵而成的調味制品[1],含有蛋白質、亞油酸、鈣以及維生素B12等物質[2]。它營養豐富而且還能夠起到抗氧化、降膽固醇、降血壓的作用[3-4]。Wang等[5]研究發現腐乳中的多肽具有清除DPPH自由基的作用;杭梅等[6]用乙醇提取毛豆腐樣品,并測定提取物的體外血管緊張素轉換酶(ACE)抑制活性,發現毛豆腐發酵第5 d時,60%的乙醇提取物對ACE的抑制活性最高。腐乳按其顏色可分為紅方、青方、白方以及各種花色腐乳,白方腐乳不添加著色劑且外表和內部均呈淡黃色[7]。因獨特的風味和外觀而深受大眾喜愛。但腐乳中蛋白質和氨基酸含量豐富,容易發生生物胺累積現象,因而存在安全風險。

生物胺是一類具有生物活性的含氮低分子量有機化合物,按其結構可分為脂肪族、芳香族和雜環胺[8]。不同的食品在加工或貯藏過程中產生的生物胺種類和含量也不相同。葡萄酒中腐胺檢出率最高,腐乳中生物胺主要有腐胺、β-苯乙胺、尸胺、酪胺、組胺及色胺等[9]。生物胺的合成需滿足3個條件:食品中存在前體物質氨基酸;含有能分泌氨基酸脫羧酶的微生物;有利于微生物生長以及氨基酸脫羧酶發揮作用的環境[10]。少量生物胺可以促進機體正常活動,但過量攝入可能會引起中毒等問題,而且中毒程度因人而異。目前,一些國家和組織對部分食品中生物胺的含量制定了限量標準,如美國限定可食用魚類中組胺的含量應低于50 mg/kg,我國限定可食用魚類中組胺的含量為200～400 mg/kg[11]。

腐乳類似奶酪,具有可涂抹的奶油稠度和獨特的味道,主要和米飯或饅頭一起食用,是一道受歡迎的配菜[12]。目前,對腐乳的研究大部分集中在分析微生物多樣性,優化加工條件以及營養價值和功能成分的挖掘等方面。但腐乳開蓋后,通常不能一次性全部食用,需對其儲藏,而對腐乳在不同儲藏條件下生物胺含量變化規律的研究較少。本研究以開蓋的白方腐乳為實驗材料,對其在不同儲藏條件下生物胺和理化指標的變化進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白方腐乳(生產日期2019年11月3日) 2019年11月15日購于河北省保定市當地商場,并當天進行實驗;丹磺酰氯 純度≥98%,上海麥克林試劑有限公司;乙腈 色譜級,上海Merck試劑有限公司;腐胺、色胺、組胺、苯乙胺、精胺、酪胺、尸胺和亞精胺 純度≥97%,美國Sigma-Aldrich試劑有限公司;氨水、碳酸氫鈉、氫氧化鈉、丙酮、濃鹽酸(37%)、甲醛(38%)和乙酸銨 分析試劑,天津市天力化學試劑有限公司。

CP214電子分析天平 奧斯豪儀器上海有限公司;2695型高效液相色譜儀 美國Waters儀器有限公司;Eclipse XDB-C18液相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) 美國Agilent儀器有限公司;STARTER2100酸度計 寧波新芝生物科技有限公司;Novasina CH-8533水分活度測定儀 瑞士步琦有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白方腐乳處理方法 將從超市購買的8瓶同一生產日期白方腐乳開蓋后,在不同溫度條件下(4、15、25和35 ℃)各放置2瓶,儲藏0、15、30、45和60 d后,取樣測定其生物胺含量和理化指標。

1.2.2 生物胺的測定 生物胺含量按照李大偉等[13]的方法進行測定。具體方法如下:在5 mL試管中依次加入1 mL待衍生樣品、200 μL氫氧化鈉溶液(2 mol/L)、300 μL飽和碳酸氫鈉溶液、1 mL丹磺酰氯溶液(10 mg/mL),渦旋1 min,混勻后置于42 ℃恒溫水浴中并在暗黑條件下衍生45 min,取出,加100 μL氨水避光反應30 min后,用乙腈定容至5 mL最后,有機膜過濾(0.45 μm)后用于高效液相色譜分析。色譜條件:色譜柱為Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱溫40 ℃,流速1 mL/min,進樣量20 μL,紫外檢測波長254 nm,流動相A為0.1 mol/L的乙酸銨,流動相B為乙腈。

1.2.3 理化指標的測定

1.2.3.1 水分活度的測定 水分活度(Water activity,Aw)用水分活度儀進行測定,同一樣品重復測定3次。

1.2.3.2 pH的測定 pH的測定參照劉振鋒[14]的方法。

1.2.3.3 氨基態氮的測定 氨基態氮(Amino acid nitrogen,FAAN)含量按照SB/T 10170-2007的方法進行測定。

1.3 數據處理

數據用SPSS 22.0分析顯著性,實驗結果由平均值±標準偏差表示,P<0.05表示差異顯著。用SPSS 22.0對生物胺含量和理化指標作Pearson相關性分析。繪圖使用Origin 8.6。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下白方腐乳中生物胺組成及含量的動態變化

不同溫度條件下(4、15、25和35 ℃)開蓋白方腐乳儲藏過程中生物胺的變化如表1所示。在4 ℃儲藏期間,白方腐乳中色胺、腐胺、組胺、酪胺、精胺和亞精胺儲藏至第15 d時含量達到最大,此時,總胺含量最高為835.51 mg/kg,其中亞精胺、色胺和組胺的含量增加較大,共占總胺含量約68.92%;苯乙胺和尸胺貯藏至第45 d時含量達到最大,分別為39.83和75.57 mg/kg。在整個儲藏過程中,總胺含量呈現先上升后下降的趨勢。在15 ℃儲藏期間,白方腐乳中尸胺的含量隨著儲藏時間的延長而升高,在第60 d達到最大值65.99 mg/kg;在整個儲藏過程中,生物胺呈現出波動的趨勢;酪胺、色胺、腐胺、亞精胺和精胺的含量均在第15 d達到最高,苯乙胺含量在第60 d達到最高,組胺含量在第30 d達到最大。在25 ℃下儲藏,白方腐乳中色胺和酪胺含量在剛開蓋時最高,二者大體呈下降趨勢;亞精胺在儲藏至第60 d才檢測到,總胺含量隨著儲藏時間的延長而增加,在第60 d時,占總胺比重較大的是組胺(43.16%)和亞精胺(27.96%)。在35 ℃下儲藏,色胺、苯乙胺、尸胺、組胺和亞精胺的變化趨勢大體與25 ℃下呈現的趨勢一致。在第15 d組胺和酪胺含量突增,此時總胺含量也增高。

表1 開蓋白方腐乳在不同儲藏條件下生物胺含量的變化Table 1 Changes of biogenic amines in the opened sufu products under different storage conditions

綜上所述,以美國食品藥品監督管理局規定的限量標準為參照,總胺含量在安全范圍內;在25和35 ℃貯藏的白方腐乳苯乙胺含量比4和15 ℃的要高,說明25和35 ℃下苯乙胺更容易累積;組胺在25和35 ℃含量增長較快;酪胺在35 ℃儲藏至第15 d時,其含量超出建議標準,其余不同溫度不同貯藏時間酪胺含量均<100 mg/kg。在貯藏期間腐胺和尸胺的含量較低,盡管二者對人體的毒性相對較弱,但在一定程度上可增強組胺與酪胺的中毒風險,主要是由于腐胺和尸胺可抑制組胺代謝酶與甲基轉移酶的活性[15-16]。Bover等[17]在研究貯藏條件對發酵風干腸中生物胺含量的影響時發現,貯藏在4 ℃下比貯藏在19 ℃下生物胺含量低。由此可知,低溫儲藏對生物胺的累積有一定的抑制作用,因為低溫處理在一定程度上可抑制部分微生物生長并降低氨基酸脫羧酶活性。

2.2 不同溫度下白方腐乳中理化指標的變化

2.2.1 不同溫度下水分活度(AW)的變化 水分活度能反映產品中潛在微生物對水分的可利用性,不同微生物生長所需的水分活度都有一定的閾值。不同溫度條件下(4、15、25和35 ℃)開蓋白方腐乳儲藏過程中AW的變化如圖1所示,AW在0.85～0.92之間。在貯藏過程中,4 ℃儲藏的白方腐乳AW相對較低。在15、25、35 ℃下儲藏的前15 d,AW均呈下降趨勢,其中35 ℃下白方腐乳的AW下降速度最快。不同溫度下儲藏,開蓋白方腐乳的AW均高于0.85,有利于微生物生長以及酶的分泌,可能會促進樣品中生物胺的積累。

圖1 白方腐乳開蓋后不同貯藏溫度條件下水分活度(Aw)的變化Fig.1 The change of water activity of opened sufu under different storage temperature

2.2.2 不同溫度下pH的變化 pH能引起酶活性的改變,而氨基酸脫羧酶對生物胺的產生有較大影響。因此,pH可間接影響生物胺的合成。肖洪等[18]發現在低的pH環境下細菌為了抵抗外部酸性環境會產生更多的氨基酸脫羧酶。不同溫度條件下(4、15、25和35 ℃)開蓋白方腐乳儲藏過程pH的變化如圖2所示,pH均在5.4～6.8之間,4 ℃下白方腐乳的pH相對較低,且波動范圍較小。當儲藏至30～45 d,35 ℃下放置的白方腐乳樣品pH呈現大幅度增加,其它溫度下儲藏的白方腐乳pH變化較小,這可能與樣品中生物胺等堿性物質的含量有關。

圖2 白方腐乳開蓋后不同貯藏溫度條件下pH的變化Fig.2 The change of pH of opened sufu under different storage temperature

2.2.3 不同溫度下氨基態氮(FAAN)的變化 樣品中各種氨基化合物所含氮的總量為氨基態氮含量,通過對氨基態氮的測定可以了解蛋白質的水解程度[19-20]。不同溫度條件下開蓋白方腐乳儲藏過程中氨基態氮含量變化如圖3所示。白方腐乳在4、15、25、和35 ℃貯藏時,氨基態氮含量達到的最大值分別為0.31、0.41、0.22、0.43 g/100 g。15 ℃貯藏的白方腐乳氨基態氮含量最高時,相應的總胺含量也達到最大。Lu等[21]將40份醬油樣品分成氨基氮低含量、中含量和高含量組,結果發現在氨基氮含量高的樣品中,生物胺的總含量普遍較高,而氨基氮含量低的醬油樣品中,生物胺的總含量較低,說明氨基態氮含量與生物胺含量存在一定的正相關關系。

圖3 白方腐乳開蓋后不同貯藏溫度條件下氨基態氮含量的變化Fig.3 The change of FAAN of opened sufu under different storage temperature

2.3 生物胺與理化指標的相關性分析

對生物胺與理化指標進行皮爾遜相關性分析,結果見表2。雙變量分析結果表明,腐胺與精胺、亞精胺,苯乙胺與尸胺、組胺的相關性較高;尸胺與組胺相關性最高(r=0.824,P<0.01);苯乙胺與腐胺、精胺,酪胺與精胺呈顯著正相關。這可能與菌株種類以及生物胺的轉化相關。例如,腐胺在亞精胺合成酶的催化下形成亞精胺,亞精胺在精胺合成酶的作用下形成精胺[22]。此外,精氨酸會水解或脫羧成鳥氨酸或胍丁胺,因而是腐胺合成的重要前體物質。胍丁胺作為腐胺的起始底物,主要有胍丁胺酶路徑和胍丁胺亞氨基路徑,而菌株的種類決定了產生腐胺的具體路徑[23]。pH與苯乙胺呈顯著正相關,與其余生物胺之間呈弱相關;氨基態氮與苯乙胺、尸胺、組胺呈顯著正相關。大多數研究發現氨基態氮與生物胺之間存在一定的正相關關系[24]。Andic等[25]發現含氮量較高的干酪樣品中總胺含量也較高。

表2 生物胺與理化指標的相關性Table 2 Correlation between biogenic amines and physical and chemical indicators

3 結論

生物胺是影響腐乳品質和食用安全的重要因素,其含量可作為評價食品質量安全的重要指標之一。本研究采用柱前衍生高效液相色譜分析開蓋白方腐乳生物胺,結果表明,8種生物胺均有檢出,總胺含量在151.11～835.51 mg/kg之間,未超過食品中生物胺的總含量建議值1000 mg/kg,但組胺含量超過100 mg/kg,這可能使白方腐乳存在潛在的中毒風險。通過對理化指標的分析,發現水分活度在0.85以上,超出病原體生長的安全界限,需要采取冷藏或其它措施。本研究為開蓋的白方腐乳提供了基礎數據,之后將進一步研究白方腐乳開蓋后儲藏過程中微生物和風味物質的變化,這可能有助于確定開蓋腐乳的最佳食用期,以保證腐乳的食用口感和安全性。