貯藏條件對江蘺瓊膠酶活性和瓊膠凝膠強(qiáng)度的影響

張曦文，伍 菱,2,3,4，童風(fēng)景，姜澤東,2,3,4，朱艷冰,2,3,4，肖安風(fēng),2,3,4，倪 輝,2,3,4，李清彪,2,3,4

( 1.集美大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.福建省食品微生物與酶工程重點實驗室，福建 廈門 361021； 3.廈門南方海洋研究中心經(jīng)濟(jì)海藻資源化利用重點實驗室，福建 廈門 361021； 4.廈門市食品生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021 )

江蘺(Gracilaria)是大型底棲海藻，屬紅藻門，真紅藻綱，杉藻目，江蘺科，江蘺屬[1-4]，具有藻體大、適應(yīng)能力強(qiáng)、生長快等特點[5]，在我國福建和廣東沿海以及東南亞地區(qū)沿海大規(guī)模養(yǎng)殖，是提取瓊脂(瓊膠)的主要原料[6-8]。瓊脂，俗稱洋菜、凍粉、凍膠或寒天，是江蘺、石花菜(Gelidium)、壇紫菜(Porphyrahaitanensis)等海洋紅藻的主要多糖組分，其含量占藻體干質(zhì)量的20%以上[9-10]。瓊膠在亞洲國家作為食材消費已有300多年[11-13]，主要由(1-3)-β-D-半乳糖和(1-4)-3,6-內(nèi)醚-α-L-半乳糖等組成的線性多糖構(gòu)成，溶于熱水，具有良好的膠凝性和凝膠穩(wěn)定性，常作為膠凝劑、穩(wěn)定劑、增稠劑和乳化劑等廣泛應(yīng)用于食品、輕工、醫(yī)藥等領(lǐng)域[14-17]。

凝膠強(qiáng)度是評價瓊膠品質(zhì)的主要指標(biāo)之一，對其應(yīng)用價值具有重要的影響[18-19]，探明瓊膠凝膠強(qiáng)度的影響因素對改善瓊膠凝膠品質(zhì)具有重要意義[20]。相關(guān)研究表明，提取條件對瓊膠產(chǎn)率和凝膠強(qiáng)度具有較大的影響[21-25]。此外，海藻種類、季節(jié)和環(huán)境參數(shù)也顯著影響瓊膠的提取得率和品質(zhì)。Marinho-Soriano等[26-27]發(fā)現(xiàn)，2種江蘺G.gracilis和G.bursa-pastoris分別在春季和夏季瓊膠提取得率最高，秋季和冬季最低，而瓊膠凝膠強(qiáng)度和凝膠溫度分別在夏季和秋季最高；從G.bursa-pastoris提取的瓊膠的凝膠溫度和凝膠強(qiáng)度呈正相關(guān)。Ordua-Rojas等[28]研究發(fā)現(xiàn)，加利福尼亞灣2種重要海藻真江蘺(G.vermiculophylla)和Gracilariopsislongissima在夏季收獲時，其瓊膠產(chǎn)率最高，而在冬季收獲時，其瓊膠產(chǎn)率最低；夏季收獲的真江蘺所提取瓊膠的凝膠強(qiáng)度顯著提高。Freile-Pelegrín[29]通過研究貯藏時間對于墨西哥尤卡坦州江蘺瓊膠的產(chǎn)率和品質(zhì)影響，發(fā)現(xiàn)海藻的貯藏時間顯著影響其瓊膠的凝膠強(qiáng)度、凝膠和熔化溫度。同時，F(xiàn)reile-Pelegrín[29]還報道了在高熱高濕度條件處理下，瓊膠被江蘺中微生物降解，分子量降低，致使其凝膠強(qiáng)度顯著下降，這說明海藻收獲貯藏過程中瓊膠酶作用對瓊膠的得率和凝膠強(qiáng)度具有重要影響。目前，對收獲后的江蘺進(jìn)行貯藏已經(jīng)成為瓊膠生產(chǎn)企業(yè)保持全年穩(wěn)定生產(chǎn)的必不可少的條件，雖然相關(guān)研究表明，江蘺貯藏過程中環(huán)境溫度、濕度和貯藏時間對瓊膠的提取得率和凝膠強(qiáng)度具有顯著影響，但其瓊膠酶在貯藏過程中的活性變化規(guī)律及對瓊膠凝膠強(qiáng)度和提取得率影響尚不明確。

筆者通過模擬江蘺采收及干燥后的自然貯藏條件，探究貯藏過程中溫度、濕度的變化對江蘺中瓊膠酶活性、還原糖含量以及所提取瓊膠產(chǎn)率和凝膠強(qiáng)度的影響，闡明江蘺瓊膠酶活性受貯藏條件影響的變化規(guī)律，明確瓊膠提取得率和凝膠強(qiáng)度與江蘺瓊膠酶活性之間的內(nèi)在聯(lián)系，為瓊膠生產(chǎn)企業(yè)穩(wěn)定貯藏江蘺提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑材料

經(jīng)自然風(fēng)干的江蘺購于綠新(福建)食品有限公司，采集于福建省龍海市東海海域；瓊膠粉(廣東環(huán)凱科技有限公司)；3，5-二硝基水楊酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；氫氧化鈉和無水乙醇等試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器設(shè)備

電子分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司]，HH-4/HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋(國華電器有限公司)，Epoch2T微量酶標(biāo)儀(美國伯騰儀器有限公司)，F(xiàn)E20 pH計[梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司]，冷凍離心機(jī)(BECKMAN COUNTER)，電熱恒溫干燥箱(上海智誠分析儀器制造有限公司)，高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 江蘺樣品的制備和貯藏條件模擬

分別稱取江蘺0.5 g (用于還原糖含量的測定)、1.0 g (用于提取粗瓊膠酶酶液)和5.0 g (用于提取瓊膠)，分為若干組，每組設(shè)置3個平行。迅速將分組后的江蘺分別密封于保鮮盒中，通過調(diào)控保鮮盒中濕度對藻體中水分含量進(jìn)行調(diào)整。經(jīng)含水量測定，獲得約10%、14%、40%和60% 4種不同水分含量的江蘺樣品。將盛裝各組江蘺樣品的密封保鮮盒分別置于5、15、25 ℃和35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中模擬貯藏溫度和濕度環(huán)境。每日測定經(jīng)處理后江蘺中瓊膠酶活性、還原糖含量、瓊膠提取得率、瓊膠凝膠強(qiáng)度等指標(biāo)，連續(xù)測定4 d、每組做3次獨立重復(fù)試驗。

1.3.2 江蘺中還原糖含量的測定(DNS法[30])

取0.5 g不同條件處理過的江蘺進(jìn)行液氮冷凍研磨破碎細(xì)胞壁后，置于50 mL離心管，加入超純水至10 mL刻度，45 ℃水浴浸提2 h。冷卻至常溫后，20 ℃下8000 r/min離心40 min, 留殘渣備用。取0.2 mL的上清液，加入3，5-二硝酸水楊酸試劑(150 μL)，在沸水浴中加熱10 min,取出后立即冷卻至室溫，以蒸餾水定容至0.5 mL，混勻，在540 nm波長下，測定吸光值，每組設(shè)置3個平行。根據(jù)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算還原糖含量。

1.3.3 江蘺中瓊膠酶粗酶液的制備和瓊膠酶的活性測定

1.3.3.1 瓊膠酶粗酶液的制備

取1.0 g不同條件處理過的江蘺進(jìn)行液氮冷凍研磨破碎胞壁后，置于50 mL離心管，加入5 mL預(yù)冷的Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5，500 mmol/L KCl 和10 mmol/L β-巰基乙醇)，混勻后，于冰浴中緩慢攪拌抽提24 h。在4 ℃下，經(jīng)12 000 r/min離心20 min，棄沉淀，取上清液備用。

1.3.3.2 瓊膠酶的活性測定

采用DNS法[30]對瓊膠酶的活力進(jìn)行測定。取100 μL酶液加入400 μL含0.5%(m/V)海藻酸鈉的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.5)，混勻后45 ℃反應(yīng)20 min。加入500 μL DNS試劑，混勻后置于沸水浴5 min，冷卻至室溫后，于波長540 nm處測定吸光值，對照組采用滅活的酶。酶活性單位定義：在45 ℃、pH 7.5條件下，1 min產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量。

1.3.4 瓊膠的提取[31]

取不同條件處理過的江蘺5.0 g置于250 mL燒杯中，加入7% NaOH溶液(m/V)至100 mL，91 ℃水浴浸泡2 h。加水清洗至pH<9.0后，酸化30 min(酸化液：草酸0.05 g，硫酸33 μL，EDTA 0.01 g，加水定容至200 mL)，過濾。加水清洗至pH>5.5后，用0.2%的次氯酸鈉(m/V)漂白30 min。然后清洗至pH>8.0。向處理后的各組江蘺中加入100 mL純水，100 ℃水浴抽提2 h，過濾棄去殘渣。過濾后，將濾液進(jìn)行冷凍干燥，得到瓊膠多糖。瓊膠提取得率按下式計算：

提取得率/%=m2/m1×100%

式中，m1為江蘺干質(zhì)量，m2為瓊膠粉末質(zhì)量。

1.3.5 凝膠強(qiáng)度的測定

分別稱取1.3.4中各組江蘺中提取的瓊膠粉末0.1 g于50 mL離心管中，加蒸餾水10 mL，經(jīng)沸水浴加熱，溶解至澄清溶液，于60 ℃下水浴保溫30 min后，封住離心管管口，于20 ℃下倒置15 h，凝固后，采用TA-XT2型質(zhì)構(gòu)儀測定其凝膠強(qiáng)度。測定方法和參數(shù)：采用D/0.5探頭，選擇壓縮模式，測試前速度1 mm/s，測試速度1 mm/s，測試后速度5 mm/s，應(yīng)變30%，觸發(fā)力5 g。記錄凝膠破裂時最大的力(g)，再根據(jù)探頭截面積換算為凝膠強(qiáng)度(g/cm2)。

2 結(jié)果與分析

2.1 貯藏溫度和濕度對江蘺中瓊膠酶活性的影響

考察在連續(xù)貯藏4 d的過程中，不同的貯藏溫度對不同含水量的江蘺中瓊膠酶活性的影響。由圖1a可見，瓊膠酶活性的總體趨勢是隨著貯藏時間的增加而逐漸降低，而隨著江蘺中水分含量的增加

圖1 不同溫度，不同貯藏時間其水分含量對瓊膠酶活性影響Fig.1 Effect of moisture on agarase activity in different storage time at various temperaturesa.5 ℃; b.15 ℃; c.25 ℃; d.35 ℃.

而增加。在貯藏溫度為5 ℃、江蘺水分含量為60%時，貯藏1 d后，其瓊膠酶活性達(dá)到最高。由圖1b可見，在貯藏溫度為15 ℃時，瓊膠酶活性與江蘺中水分含量呈正相關(guān)性，其隨著江蘺水分含量的增加而增加。在貯藏1 d后，其瓊膠酶活性最高，活性隨著江蘺中水分含量下降呈下降趨勢。同時，與5 ℃組結(jié)果一致，在貯藏溫度為15 ℃，江蘺水分含量為60%時，貯藏1 d后，其瓊膠酶活性達(dá)到最高。由圖1c可見，在貯藏溫度為25 ℃時，江蘺中瓊膠酶活性隨著水分含量的增加呈上升趨勢，在貯藏第3 d后，酶活性達(dá)到最高，而后呈現(xiàn)下降趨勢。由圖1d可見，在貯藏溫度為35 ℃時，連續(xù)貯藏過程中，隨著時間的增加，瓊膠酶活性呈下降趨勢；但隨著江蘺中水分含量的增加，其瓊膠酶活性呈上升趨勢。由以上結(jié)果可知，貯藏過程中環(huán)境溫度和濕度的變化對江蘺瓊膠酶活性具有重要的影響，而貯藏濕度是最關(guān)鍵的影響因素，江蘺瓊膠酶活性隨著貯藏濕度的上升呈升高趨勢。

2.2 貯藏溫度和濕度對江蘺中還原糖含量的影響

貯藏濕度、溫度和時間對江蘺中還原糖含量的影響見圖2。江蘺中水分含量與藻體中生成的還原糖含量呈正相關(guān)性，均隨藻體水分含量的增加而呈上升的趨勢。這與2.1部分結(jié)果較為一致，江蘺瓊膠酶活性隨著貯藏濕度的上升呈升高趨勢，瓊膠酶將藻體中瓊膠降解產(chǎn)生還原糖，致使水分含量較高的江蘺中還原糖含量相應(yīng)升高。

圖2 不同溫度下隨著貯藏時間增加水分含量對還原糖含量的影響Fig.2 Effect of moisture content on reducing sugar content with increasing storage days at different temperaturesa.5 ℃; b.15 ℃; c.25 ℃; d.35 ℃.

2.3 貯藏溫度和濕度對江蘺瓊膠提取得率和凝膠強(qiáng)度影響

根據(jù)江蘺中瓊膠酶活性的變化曲線(圖1)和江蘺中還原糖含量變化曲線(圖2)，在江蘺水分含量為10%和60%，貯藏1 d和2 d后，瓊膠酶活性和還原糖含量變化最為明顯。因此，選取該貯藏濕度，設(shè)置貯藏溫度處理江蘺，并對處理后的江蘺中瓊膠進(jìn)行提取，測定瓊膠提取得率和其凝膠強(qiáng)度(圖3)，明確瓊膠提取得率和凝膠強(qiáng)度與江蘺瓊膠酶活性之間的內(nèi)在聯(lián)系。由圖3可見，在貯藏1 d后，江蘺的瓊膠提取得率沒有隨江蘺中水分含量的升高或降低呈現(xiàn)增加或減少的變化趨勢，而在貯藏2 d后，江蘺的瓊膠提取得率呈現(xiàn)隨藻體水分含量的升高而下降的變化趨勢；同時，在貯藏溫度為15 ℃，濕度為10%條件下，貯藏1 d和2 d后江蘺中瓊膠的提取得率均達(dá)到最高。由圖4可見，所提取瓊膠的凝膠強(qiáng)度呈現(xiàn)隨原料濕度的升高而呈降低的趨勢，在江蘺水分含量為60%的條件下提取瓊膠的凝膠強(qiáng)度普遍低于水分含量為10%的江蘺所提取的瓊膠的凝膠強(qiáng)度。以上結(jié)果表明，貯藏過程中環(huán)境溫度和濕度的變化對江蘺所提取的瓊膠的凝膠強(qiáng)度具有重要的影響，而貯藏濕度是最關(guān)鍵的影響因素，江蘺中瓊膠的凝膠強(qiáng)度隨著貯藏濕度的上升呈下降趨勢。

圖3 不同貯藏時間江蘺瓊膠得率Fig.3 Extraction yield of agar from Gracilaria at different storage timea.1 d; b.2 d.

圖4 不同貯藏時間江蘺瓊膠凝膠強(qiáng)度Fig.4 Concentration strength of agar from macroalga Gracilaria at different storage timea.1 d; b.2 d.

3 討 論

3.1 預(yù)處理溫度和濕度對瓊膠酶酶活的影響

經(jīng)自然風(fēng)干后的江蘺對其進(jìn)行預(yù)處理，不同濕度和溫度均可以影響江蘺中瓊膠酶活性。酶的表面需要一定量的水分子使酶催化底物的活性中心達(dá)到一定的柔韌性的“開放”構(gòu)象，剛性降低，較易與底物分子結(jié)合[32]。已有研究表明，除了海藻種類、季節(jié)和環(huán)境參數(shù)顯著影響瓊膠的提取得率和品質(zhì)外[24-25]，海藻的貯藏時間也顯著影響其所產(chǎn)瓊膠的凝膠強(qiáng)度、凝膠和熔化溫度[29]。目前，海藻如江蘺、龍須菜(G.lemaneiformis)等在貯藏過程中環(huán)境參數(shù)(如溫度、濕度、時間等)的變化對藻體中瓊膠酶活性的影響尚無報道。基于此，筆者針對原料貯藏條件對江蘺瓊膠酶活性影響的變化規(guī)律進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)江蘺在貯藏過程中溫度和濕度的變化對江蘺瓊膠酶活性具有重要的影響，并且貯藏濕度是最關(guān)鍵的影響因素，其藻體中酶活性與貯藏濕度呈正相關(guān)性。這一結(jié)果為進(jìn)一步研究江蘺瓊膠酶活性與瓊膠提取得率和凝膠強(qiáng)度之間的內(nèi)在聯(lián)系奠定研究基礎(chǔ)。

3.2 瓊膠酶酶活對瓊膠凝膠強(qiáng)度的影響

另一方面，貯藏過程中環(huán)境參數(shù)(如溫度、濕度、時間等)的變化對藻體中瓊膠的提取得率和凝膠強(qiáng)度的影響尚無報道。本試驗結(jié)果顯示，江蘺的瓊膠提取得率呈現(xiàn)隨藻體水分含量的升高而下降的變化趨勢，而所提取瓊膠的凝膠強(qiáng)度隨江蘺中水分含量的升高呈現(xiàn)降低的趨勢，表明貯藏濕度也是影響瓊膠的提取得率和凝膠強(qiáng)度最關(guān)鍵的因素，江蘺中瓊膠的凝膠強(qiáng)度隨貯藏濕度的上升呈下降趨勢。凝膠強(qiáng)度是瓊膠品質(zhì)評價的重要指標(biāo)之一。在貯藏過程中，較高的環(huán)境濕度會導(dǎo)致江蘺中提取的瓊膠的凝膠強(qiáng)度明顯下降。結(jié)合在不同貯藏條件下，江蘺藻體中瓊膠酶活性的變化和還原糖含量變化，推測在高濕度環(huán)境下藻體中瓊膠酶活性較高，會大量降解藻體中的瓊膠。藻體中瓊膠的降解導(dǎo)致所提取的瓊膠的提取得率和凝膠強(qiáng)度顯著下降[33-34]。此外，高濕度的貯藏條件下相關(guān)分解代謝酶活性提高，可有效促進(jìn)海藻中瓊膠的降解[32,35-36]。因此，有效抑制藻體中瓊膠酶活性、減少微生物的活動和降低分解代謝酶活性是提高瓊膠提取得率和品質(zhì)的有效方法。通過低濕度和低溫度的條件下對海藻進(jìn)行貯藏可有效提高瓊膠提取得率和品質(zhì)。同時，在海藻原料收獲后，通過高鹽腌漬、干燥的方法可有效降低海藻的水分含量和減少海藻從潮濕環(huán)境吸收水，并且高鹽度可有效控制微生物的活動和相關(guān)分解代謝酶活性，防止藻體中瓊膠降解。

4 結(jié) 論

通過研究，明確了江蘺貯藏過程中溫度和濕度對其瓊膠酶活性、瓊膠提取得率、瓊膠凝膠強(qiáng)度具有重要的影響，并且發(fā)現(xiàn)濕度是最關(guān)鍵影響因素，瓊膠酶活性與貯藏濕度呈正相關(guān)性，而瓊膠提取得率和凝膠強(qiáng)度與貯藏濕度呈負(fù)相關(guān)性。此外，還發(fā)現(xiàn)江蘺中的瓊膠酶會加速瓊膠的降解，導(dǎo)致瓊膠提取得率和凝膠強(qiáng)度下降。本試驗為通過對江蘺進(jìn)行合理貯藏而提高瓊膠得率和質(zhì)量提供了科學(xué)依據(jù)。