水產品中撲草凈氣質聯用檢測方法及基質效應的研究

桂英愛，葛祥武，孫程鵬，丁 勇

( 1.大連市檢驗檢測認證技術服務中心，遼寧 大連 116037； 2.大連市現代農業(yè)生產發(fā)展服務中心，遼寧 大連 116023 )

撲草凈，化學名稱為4,6-雙異丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪，是均三氮苯類內吸傳導選擇性除草劑，分子式為C10H19N5S，分子量241.36。近年來，除了在農業(yè)生產中廣泛作為稗草、馬齒莧、車前草等1年生禾本科及闊葉草的除草劑外，還在水產養(yǎng)殖業(yè)中作為環(huán)境改良劑清除魚、蝦、蟹、貝、海參等養(yǎng)殖水體中的絲狀藻類(青苔)、大型草類及有害藻類。由于大面積及不合理使用，撲草凈通過吸附遷移及食物鏈等造成了生態(tài)環(huán)境和相關產品中的殘留。2012年4月—2019年7月，我國出口的水產加工品和鮮品有幾十個批次被日本檢出(為一律基準10 μg/kg)含有撲草凈，作廢棄銷毀處理[1-2]，給中國水產品出口企業(yè)帶來了極大的經濟損失。水產品對撲草凈的富集能力較強，如在海水暴露質量濃度為1 μg/L的情況下，文蛤(Meretrixmeretrix)對撲草凈的最大富集系數達到22.9[3]，說明監(jiān)控水產品中撲草凈殘留量的重要性。所以當務之急需要盡快摸索出高效、快捷的適用檢測方法。

迄今，國內外已有諸多對撲草凈檢測方法的報道，有氣相色譜法、氣質聯用法及液質聯用法等，其中以氣質聯用法最多，主要涉及水體[4]、土壤[5]和海產品[6-7]等。由于撲草凈分子2個側鏈具有R-NH-特征的特殊結構極易產生基質效應，導致測量數據中的樣品信號可能與純組分不同，通過常規(guī)的外標校準法對這樣的信號進行量化可能產生不可靠的結果，在氣質檢測過程中這種基質增強效應極大地影響了結果的準確性和定量，在低含量時表現尤為明顯，而產品中撲草凈檢測的技術關鍵是在一律基準質量濃度10 μg/kg處能夠精準定量。因此，分析方法建立時，必須考察樣品的基質效應及定量限附近的結果。有多篇文獻提到了撲草凈的基質效應及采取的措施，如朱曉華等[8]采用固相萃取—氣質串聯法檢測水產品撲草凈時，嚴格匹配了各種基質，并采用基質匹配校準法和用內標法糾正回收率和系統(tǒng)誤差增大的現象；Garrido等[9]采用標準加入法對潛在的可能超過最大允許殘留量水平的陽性樣品進行了準確的定量，并同時監(jiān)測2～3個特征離子篩選鑒別潛在的非負性樣品；Hernndez Torres等[10]通過溶液校準和基質匹配校準曲線的斜率和截距進行配對比較，采用校正函數對基質影響的不確定度進行了描述。Stüber等[11]測試了3種不同的校準方法(內標法、外標法和基質匹配校準法)補償樣品中基體效應，并與標準加入法進行比較，認為高度復雜的樣品，3種方法都不能得到與標準加入法相當的可靠數據。因此標準加入法提供了最精確的結果，是補償高負載樣品中基質效應有效的量化方法。

筆者在以上研究的基礎上，進一步探索了撲草凈的氣質聯用檢測、基質效應、復雜基質樣品的處理和假陽性的排查等方法，為開展仿刺參(Apostichopusjaponicus)、菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)等水產品中的撲草凈含量檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

仿刺參和菲律賓蛤仔樣品均購自大連市市場。

1.1.2 主要儀器與試劑

7890A-5975C型氣相色譜—質譜聯用儀(美國Agilent公司)；SQP電子天平，感量0.01 g(賽多利期科學儀器公司)；BS224S天平，感量0.1 mg(賽多利期科學儀器公司)；N-EVAPTMⅢ氮吹儀(Organomation公司)。

撲草凈標準品(德國Dr公司，純度大于98.0%)；乙腈、丙酮和正己烷均為色譜純；無水硫酸鈉(分析純)，550 ℃烘4 h，冷卻后裝瓶于干燥器中密封保存；Envi-Carb/LC-NH2固相萃取柱500 mg/500 mg×6 mL(Supelco公司)。

1.2 方法

1.2.1 儀器條件

色譜：毛細管色譜柱DB-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；柱溫程序升溫條件：初始溫度50 ℃以10 ℃/min升至150 ℃保持0.50 min，然后以30 ℃/min升至213 ℃，以30 ℃/min升至280 ℃保持2 min；進樣口溫度：280 ℃；進樣方式為不分流進樣；載氣為高純氦氣(99.999%)，流速1.0 mL/min；進樣量1 μL。

質譜：電子轟擊離子源(EI)；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度為230 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電離能量70 eV。測定方式為40～480分子量全掃描(SCAN)和選擇離子掃描(SIM)；溶劑延遲時間為5.00 min，監(jiān)測離子時間為5.00～21.93 min。

1.2.2 標準曲線配制

準確稱取撲草凈標準品0.0100 g，用正已烷溶解，定容于100 mL容量瓶中，配制成質量濃度為100 μg/mL的標準儲備溶液，再用正已烷稀釋成相應質量濃度的工作混合溶液。

(1)采用正已烷作為溶劑配制質量濃度為0、0.005、0.01、0.02、0.04、0.10、0.20、1.0 μg/mL的撲草凈系列標準溶液，得到撲草凈標準曲線。

(2)向空白仿刺參樣品中分別添加不同濃度的撲草凈標準溶液，使添加水平為0、5.0、10、20、40 μg/kg和100 μg/kg，樣品提取過程見1.2.3，得到基質校準曲線。

1.2.3 樣品前處理

樣品提取主要參照文獻[8]方法。以仿刺參為例，準確稱取2.00 g已勻漿的試樣于100 mL離心管中，加入30 mL乙腈溶劑超聲30 min，4000 r/min的轉速離心10 min，取上清液通過無水硫酸鈉的漏斗于250 mL雞心瓶中，再重復用10 mL乙腈提取1次，合并提取液于同一個雞心瓶中，于40 ℃水浴中旋轉蒸發(fā)至干燥，殘渣用2 mL正己烷溶解，備用。

將ENVI-Carb/LC-NH2固相萃取柱依次用3 mL丙酮和3 mL正己烷活化。轉移濃縮的樣品溶液至柱子中，再用3 mL正己烷清洗瓶子并過柱，過完后抽干。以5 mL正己烷∶丙酮(體積比為6∶4)的混合液分2次以1 mL/min流速過柱洗脫，收集全部洗脫液至10 mL小試管中，氮吹儀緩慢吹干。用1 mL正己烷定容，供氣相色譜—質譜分析檢測。

2 結果與分析

2.1 色譜圖

數據采集模式：在1.2.1色譜及質譜條件下，得到撲草凈標準溶液全掃描質譜圖(圖1)，選擇相對豐度高的4個特征離子241(100%)，184(85%～90%)，226(60%～65%)和199(22%～25%)，以m/z241作為撲草凈的定量離子。

2.2 線性方程、基質效應和檢出限

撲草凈標準溶液在0.005～1.0 μg/mL濃度線性范圍內曲線回歸方程為y=11 658x-2.78，r2=0.9994(圖2)和在0.010～0.2 μg/mL質量濃度線性范圍內標準加入法工作曲線為y=21 189x-1.90，r2=0.9984。以提取前加標峰面積/撲草凈在溶劑中峰面積評價基質影響[12]。兩者斜率比超出80%～120%[13]，達到145%，這與Rodríguez-Gonzlez等[14]的129%～142%相近。說明存在比例誤差，相比系統(tǒng)誤差[10]可以忽略，有明顯的基質增強效應，需要采取相應的基質補償措施。

結合表1結果，在回收率和精密度滿足殘留檢測要求的前提下，根據3倍信噪比計算檢出限4 μg/kg ，定量限(10 S/N)為10 μg/kg亦為基準含量值，比Chae等[15]的定量限40 μg/kg還要低，可以滿足日本對我國水產品出口的撲草凈限量要求。

2.3 加標回收率和精密度

在2.00 g空白仿刺參樣品中分別添加10、20和100 μg/kg 3個水平的撲草凈，每個水平設6份加標平行樣，應用標準加入法計算的回收率為99.6%～112.6%(表1)，精密度分別為15.4%、9.0%和2.0%。

圖1 撲草凈標準全掃描質譜圖及譜庫檢索結構式Fig.1 Standard full scan mass spectrum and library search structure of prometryn

圖2 不同水平撲草凈標準溶液響應Fig.2 Responses of the different standard solution of prometryn

表1 仿刺參中撲草凈3個添加水平加標回收率和精密度(n=6)Tab.1 Spike recovery rate and precision of prometryn in sea cucumber at 3 doses

試驗中發(fā)現檢測含量越低，精密度越差，基質干擾越嚴重，但是在定量限10 μg/kg處可以滿足檢測要求。由圖3～4可見，同時對500 μg/kg高水平添加撲草凈樣品進行全掃描，得到4個監(jiān)測離子241、184、226和199的理論豐度比符合撲草凈的定性要求，經譜庫檢索吻合度達99%，與標準品出峰時間15.507 min一致，說明目標物就是撲草凈。

2.4 樣品定量中假陽性的判斷

菲律賓蛤仔樣品經其他固相萃取柱凈化得到的色譜圖見圖5，出峰時間和撲草凈標準完全一致(15.508 min)，但是監(jiān)測特征離子對184/241的比例和標準溶液184/241離子對85%～90%比例相比遠超過20%的偏差，可見樣品峰為干擾物質不是目標物，判定為假陽性。

2.5 實際樣品測定

分別抽取22個菲律賓蛤仔和12個仿刺參樣品按以上試驗條件進行測定，同時采用標準加入法和結合標準溶液曲線進行定量，有1個菲律賓蛤仔樣品信號較強。選取此樣品重新進樣，同時選定2個特征離子(241和184)，結果表明184/241離子比例為85.3%，在85%～90%內，符合<20%的相對偏差要求(圖6)，確認是撲草凈組分但經計算其含量低于10 μg/kg限量值。其他33個菲律賓蛤仔和仿刺參樣品未檢出撲草凈，產品質量也同樣滿足企業(yè)出口要求。

圖3 未知樣品(上)和仿刺參加標樣品20 μg/kg(下)TIC圖Fig.3 TIC diagrams of unknow samples (top) and spiked samples (bottom) in sea cucuber exposed to 20 μg/kg

圖4 仿刺參加標樣品提取離子流圖Fig.4 Ion current diagram of standard sample extraction in sea cucumber

圖5 菲律賓蛤仔假陽性樣品的TIC色譜圖和提取離子流圖Fig.5 TIC diagram and extracted particle flow diagram of false positive samples in Manila clam

圖6 菲律賓蛤仔實際樣品的測定及定性結果(保留時間15.404 min)Fig.6 Determination and qualitative results of actural samples (retention time=15.404 min)

3 討 論

3.1 樣品處理方法及進樣條件的選擇

線性方程的穩(wěn)定性：由于儀器狀態(tài)如進樣口、色譜柱、檢測器等隨時間發(fā)生變化，表現在每批撲草凈標準溶液曲線法及標準加入法的響應值和線性方程都有差異，不同進樣時間段的保留時間也會有所偏移，所以需要在同一設備同一色譜質譜方法條件下保證標準和樣品同時進樣比較才能實現定量的準確性。

本試驗先后采用了乙酸乙酯、正已烷和乙腈做為提取溶劑，乙酸乙酯提取溶液顏色較深，含部分色素，而正已烷顏色雖淺但是共萃取的脂類雜質較多，均對結果產生了干擾，增加了凈化的復雜性，而用乙腈溶劑提取則干擾少峰形好而且提取效率高。

由于水產品中基質成分復雜，含大量的脂肪、蛋白質和色素等大分子物質，如果樣品處理不好，將直接影響后續(xù)的定性和定量。本試驗采用了常用的弗羅里硅土柱、N-丙基乙二胺(PSA)柱和ENVI-Carb/LC-NH2柱聯用等進行凈化試驗，發(fā)現用弗羅里硅土柱凈化回收率較高，超過90%，但是除色素能力沒有ENVI-Carb/LC-NH2柱聯用高。PSA填料是極性吸附劑，有2個氨基，具有一定的陰離子交換能力，單獨使用可去除部分雜質但凈化不夠徹底。ENVI-Carb碳黑填料去除產品色素功能強大，而氨基Amino-NH2柱屬正相萃取柱適合極性化合物，弱陰離子交換萃取，ENVI-Carb/LC-NH2柱聯用使洗脫液呈透明色，凈化效果好，在譜圖干擾峰、除色素能力和回收率(可達99%以上)等方面均獲得理想結果。

綜上，本試驗采用乙腈溶劑提取和ENVI-Carb/LC-NH2柱聯用凈化。

3.2 樣品定量中假陽性的判斷及基質效應的排除

試驗中發(fā)現樣品種類不同、加標水平不同，基質增強效應也不同，同時發(fā)現仿刺參和菲律賓蛤仔樣品均有本底，對撲草凈檢測的干擾不可忽視，樣品中待測含量越低干擾越嚴重，故當樣品中分析物含量接近(或超過)限量水平即處于邊緣值時，極易造成結果的高估。為了保證定量的準確性，在測定過程中要盡量選擇干凈的樣品作為空白基質，樣品含量測試結果要保證同時用同批同類樣品結合同一基質加標樣品并與溶劑標準比較進行校正。

針對檢測過程中復雜樣品基質和撲草凈目標物峰重疊產生背景干擾造成譜庫檢索匹配相似度降低及定量干憂的情況，Wu 等[16]采用化學計量法對撲草凈進行解析，從韭菜樣品的重疊峰中提取目標物信號，Yu 等[17]則采用免疫算法對頭發(fā)中撲草凈復雜重疊色譜信號進行解析，并均采用標準加入法進行定量。本試驗對樣品中的撲草凈組分主要通過保留時間和定量離子等參數信息對采集到的譜圖進行篩選判斷是否有撲草凈檢出，以限量值10 μg/kg的30%，即7 μg/kg作為截止值，如果檢出目標物，則認為該樣品可能是非陰性的。考慮到樣品中撲草凈的峰值可能隱藏在漂移基線和高水平背景重疊峰里，本試驗主要通過SIM方法確認，即同時監(jiān)測潛在的非負性樣品中241和184 2個特征離子，如果在樣品和標準中的離子豐度比例偏差<20%則證實存在撲草凈，即判斷樣品為非陰性，對檢測含量可能超過10 μg/kg的陽性樣品，則通過標準加入法進行精確的量化。

撲草凈的檢測受干擾因素較多。這可能是農業(yè)生產過程中先后使用了多種結構類似的三嗪類農藥，加上土壤中原有殘留的影響，從而導致樣品中可能含有撲草凈降解物及類似物，但還不能確定其在氣質進樣過程中是否共同對定量和譜圖解析造成干擾，需進一步的試驗論證。

4 結 論

本試驗探索了水產品中撲草凈的固相萃取—氣質聯用法檢測法，采用乙腈提取Envi-Carb/LC-NH2串聯固相萃取柱凈化氣質聯用法檢測結合標準加入法定量，采用同時監(jiān)測2個特征離子進行確證有效排除了樣品中的假陽性。試驗結果表明，該方法靈敏度、準確度和精密度均滿足國家規(guī)定的要求，可用于水產品中撲草凈的檢測和確證分析。