溫州地區水產品中哈維氏弧菌的耐藥分析

吳 越，鄭伊諾，陸榮茂，王瑤華，閆茂倉，胡 園，周朝生

( 浙江省海洋水產養殖研究所，浙江 溫州 325005 )

哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是水產養殖中常見的條件致病菌之一，可引起對蝦發光病[1-2]，也可感染多種海水魚類和貝類等，對養殖業發展造成嚴重影響[3-4]。此外，有研究表明，哈維氏弧菌除了是水產病原菌外，也可感染人類并致病[5]?；【〉姆乐魏艽蟪潭壬弦蕾囉诳咕幍氖褂茫壳翱咕幬餅E用現象普遍存在，細菌耐藥性情況日趨嚴峻，引起了研究人員的密切關注。哈維氏弧菌在近十多年才逐漸被發現是水產養殖中重要的致病菌，對其研究相比于副溶血性弧菌(V.parahemolyticus)等其他水產致病菌仍然較少，因此有必要對其開展耐藥性方面研究。細菌對抗菌藥的耐藥性檢測和抗性基因的檢測是細菌耐藥研究中的兩個重要內容。對于細菌耐藥性檢測多采用稀釋法和紙片擴散法[6-7]，其中最小抑菌質量濃度測定常用試管二倍稀釋法，但試劑配制操作較為繁瑣。筆者主要采用96孔藥敏分析板測定最小抑菌質量濃度，操作簡便，可快速檢測細菌對多種抗菌藥耐藥性。筆者還進一步通過高通量實時熒光定量PCR較為全面地檢測了樣品中3種抗生素抗性基因的攜帶情況。由于目前對于哈維氏弧菌的耐藥性研究仍然較少，且不同地區和菌株之間差異也較大，因此通過研究本地區的致病性哈維氏弧菌對14種常用抗菌藥物的耐藥性及3類抗性基因攜帶表達情況，可為重大流行病的防控提供用藥指導，并為闡明哈維氏弧耐藥分子機制積累重要的數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2.1 菌株來源

11株哈維氏弧菌H1～H11均由本單位分離自溫州地區發生病害的養殖海水魚類、蝦類和貝類體內，并均已做過生化鑒定和16S rRNA測序。

1.2.2 藥敏分析試劑盒

水產藥敏分析試劑盒(BAIVIETM)(上海柏微生物技術有限公司)；水解酪蛋白培養基和水解酪蛋白瓊脂培養基(杭州天和微生物試劑有限公司)，細菌基因組DNA試劑盒(ONE-4-ALL Genomic DNA Mini-Preps Kit)[生工生物工程(上海)股份有限公司]，熒光定量PCR試劑盒TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ (TliRNaseH Plus)[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.2 藥敏分析

取11株供試菌種分別接種于水解酪蛋白培養基中，35 ℃培養18～24 h，用無菌涂布棒分別均勻涂布于水解酪蛋白瓊脂培養基平板，35 ℃再次培養18～24 h，挑取單菌落，根據水產藥敏分析試劑盒說明書檢測最小抑菌質量濃度。因藥敏板上未包含噁喹酸，因此細菌對噁喹酸的藥敏性參考臨床和實驗室標準協會操作規范和文獻[6]的方法，選擇大腸桿菌(Escherichiacoli)ATCC 25922作為質控菌株進行測定。挑取單個菌落，接種到水解酪蛋白培養基中，35 ℃振蕩培養6～8 h。將新鮮菌液調至1×108～2×108cfu/mL。按照培養基、藥物、菌液的步驟依次加入96孔板中，分別設置0.125～128 mg/L的試驗組，細菌對照組和空白對照組，35 ℃，16～20 h 過夜培養。

1.3 細菌基因組DNA提取

根據ONE-4-ALL Genomic DNA Mini-Preps Kit說明書提取11株細菌的基因組DNA，DNA含量與質量用Quawell Q3000檢測。

1.4 抗性基因表達譜檢測

細菌抗性基因表達譜由上海啟因生物科技有限公司通過高通量熒光定量PCR進行分析。PCR反應體系如下：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ (2×)5 μL，上游引物 0.4 μL，下游引物 0.4 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.2 μL，DNA 模板 1 μL，超純水3 μL，反應總體系為10 μL。使用StepOnePlusTM實時熒光定量PCR平臺進行檢測。PCR反應條件如下：95 ℃，30 s，1個循環；95 ℃，5 s，40個循環；60 ℃，30 s，40個循環，CT檢測限為40個循環。內參為16S rRNA基因，上游引物為：GGGTTGCGCTCGTTGC，下游引物為：ATGGYTGTCGTCAGCTCGTG?？剐曰蝾悇e及引物見表1。抗性基因相對豐度以基因fold值(f)表示，檢測結果用TreeView軟件繪制熱圖。fold值(f)計算公式如下：

f=2-ΔCt

△Ct=Ctarg-Ctref

式中，Ctarg為目標基因Ct值，Ctref為內參基因Ct值。

表1 抗性基因引物Tab.1 Primers used in amplification of antibiotic resistance genes

(續表1)

2 結果與分析

2.1 藥敏結果

11株哈維氏弧菌對13種抗菌藥物的藥敏結果見表2。4種磺胺類藥物中，所有菌株對磺胺嘧啶耐藥率為100%，對磺胺甲噁唑的耐藥率為90.91%，對磺胺間甲氧嘧啶的耐藥率為81.82%，對磺胺二甲氧嘧啶則均敏感；3種喹諾酮類藥物中，所有菌株對鹽酸環丙沙星和恩諾沙星均敏感，對噁喹酸的敏感性存在一定差異，其最小抑菌質量濃度為0.5～2.0 mg/L；2種四環素類藥物中，所有菌株對強力霉素均敏感，對土霉素的敏感性也較一致，其最小抑菌質量濃度均為0.5 mg/L；哈維氏弧菌對2種大環內酯內藥物的敏感性差異較大，其中紅霉素的最小抑菌質量濃度為4～32 mg/L，硫酸新霉素為1～8 mg/L；哈維氏弧菌對2種氯霉素的敏感性較一致，其中甲砜霉素鹽酸的最小抑菌質量濃度均為2 mg/L，氟苯尼考的最小抑菌質量濃度均為0.25 mg/L?？傮w而言，11株哈維氏弧菌對鹽酸環丙沙星、恩諾沙星、磺胺二甲氧嘧啶和強力霉素敏感，對磺胺嘧啶和氨芐西林鈉耐藥，表明本試驗中哈維氏弧菌對四環素類抗菌藥較為敏感，對磺胺類和β-內酰胺類藥物耐藥率較高，且大部分菌株已經出現多重耐藥性。

2.2 抗性基因表達譜檢測

通過高通量實時熒光定量PCR方法檢測了抗性基因在哈維氏弧菌中的攜帶情況與相對豐度(圖1)。所有菌株中均有檢出磺胺類抗性基因，其中sul1的檢出率最高，達81.82%，其次為sul2和sul3，分別為63.64%和72.73%，sulA的檢出率最低，為9.09%。4種磺胺類基因中sul2的相對豐度最高，sulA的相對豐度最低。

11株哈維氏弧菌中，除H2菌株外，其他所有菌株均有檢出喹諾酮類抗性基因，其中qnrD在菌株中檢出率最高為63.64%，其次分別為qepA和parC，檢出率分別為37.36%和18.19%，qnrA、qnrB、qnrC和qnrS在所有菌株中均未檢出。幾種喹諾酮類抗性基因中，qnrD基因相對豐度最高。

所有菌株中均有檢出攜帶四環素類抗性基因，其中tet34、tet35和tet36檢出率最高均為100%，tet38、tet A、tet D、tet E、tet H、tet J、tet L和tet S在所有菌株中均未檢出。在四環素類抗性基因中，tet34和tet35的相對豐度較高，tet36雖然在所有菌株中均有檢出，但在各個菌株中相對豐度均較低。

表2 哈維氏弧菌耐藥性分析結果Tab.2 Susceptibility results of V. harveyi strain

圖1 哈維氏弧菌對磺胺類、喹諾酮類和四環素類抗性基因表達譜 Fig.1 The expression profile of resistance genes of sulfonamides, quinolone and tetracycline in V. harveyi

3 討 論

3.1 哈維氏弧菌耐藥性

本試驗檢測了來自不同水產動物的11株哈維氏弧菌對14種水產漁藥的敏感性，結果顯示，所有哈維氏弧菌對喹諾酮類的鹽酸環丙沙星、恩諾沙星，磺胺類的磺胺二甲氧嘧啶和四環素類的強力霉素均敏感，因此在水產養殖過程中可以優先考慮選用這幾種抗菌藥物進行哈維氏弧菌病害的防治。另外，噁喹酸、土霉素、甲砜霉素、氟苯尼考等對哈維氏弧菌的最小抑菌質量濃度均較小(≤2 mg/L)，可作為備選的藥物。本研究中哈維氏弧菌藥敏結果與文獻[8-9]等的研究結果不完全一致，這可能是由菌株宿主、來源以及養殖環境理化性質及養殖過程中抗菌藥使用情況存在差異所致，這也說明在水產病害防治中應參照致病菌的藥敏結果進行抗菌藥物的選擇，但是與其他研究相似，本研究中大部分菌株也已經產生了多重耐藥性，不過多重耐藥的情況還不是十分嚴重，菌株同時耐受的抗菌藥的種類還較少。本試驗中，哈維氏弧菌對磺胺類藥物的耐藥表型較為突出?；【鷮前纺退幍膱蟮垒^為常見。劉旭[10]研究了副溶血性弧菌、哈維氏耐藥性和創傷弧菌(V.vulnificus)等13種90株弧菌的耐藥譜，其中磺胺類的磺胺甲惡唑耐藥率高達74.4%；劉迪[11]研究了10株哈維氏弧菌對16種抗菌藥的耐藥性，其中磺胺甲惡唑耐藥率為40%。與上述研究相比，本試驗中菌株磺胺類耐藥的檢出率更高，種類也更多，說明本地區磺胺類藥物耐藥情況更為嚴重，因此在本地區水產養殖病害臨床治療中應減少磺胺類藥物的使用。本試驗中所有菌株對氨芐青霉素的耐藥情況也很明顯，耐藥檢出率高達100%。諸多研究表明，弧菌對氨芐青霉素普遍具有抗性。吳立婷等[6]對54株哈維氏弧菌進行13種抗菌藥的藥敏分析發現，所有菌株對氨芐西林均耐藥；而王春艷等[12]研究了哈維氏弧菌對先鋒必素、先鋒霉素Ⅳ、先鋒霉素Ⅵ、單環菌素、美福仙等其他β-內酰胺類抗生素的藥敏性，發現耐藥率均超92%，進一步PCR檢測發現所有菌株均攜帶TEM型β-內酰胺酶。β-內酰胺類抗生素的高耐藥率也被發現于其他弧菌中。江艷華等[13]對84株副溶血性弧菌進行21種抗生素的耐藥性分析，結果發現，其對氨芐青霉素的耐藥率最高，為91.7%。有研究認為，弧菌普遍對β-內酰胺類抗生素具有抗性，主要機制之一是產生β-內酰胺酶降解β-內酰胺類抗生素[14]。研究發現，弧菌除了對氨芐西林高度耐受外，對早期使用的第1代和第2代頭孢類抗生素也高度耐受[15-16]，而這些藥物在水產養殖過程中極少使用，因此推測弧菌對某些β-內酰胺類抗生素存在固有耐藥性也是弧菌對β-內酰胺類抗生素不敏感的原因之一。

3.2 哈維氏抗性基因表達譜

細菌對抗菌藥物的抗性機制不盡相同，但抗性基因的誘導表達是細菌產生抗性的共同特點。在前期開展的溫州市水產品質量安全監測工作中發現，磺胺類、喹諾酮類和四環素類抗菌藥物的檢出率較高?；前奉?、喹諾酮類和四環素類藥物是水產養殖環境中常見的抗菌藥物[17]，因此本研究通過高通量熒光定量PCR進一步檢測了11株哈維氏弧菌中這3類抗性基因的攜帶情況。高通量熒光定量PCR最早由美國WaferGen公司研發[18]，它能直接進行幾百至上千個基因擴增反應，且所需的反應體系在納米級。傳統的熒光PCR存在單次研究的基因種類數量等信息有限的缺點，高通量熒光定量PCR具有強大的檢測能力和更大通量的反應，可更加高效全面地進行基因表達分析。高通量熒光定量PCR已經被運用于環境中抗性基因的檢測[19-20]，但用于細菌攜帶抗性基因檢測的研究仍鮮見報導。本研究將高通量熒光定量PCR方法用于哈維氏弧菌中磺胺類、氟喹諾酮類和四環素類抗性基因的檢測，發現3類抗性基因在11株哈維氏弧菌中均有檢出。

細菌對磺胺類藥物的抗性主要與sul1、sul2、sul3、sulA等抗性基因有關。本試驗所有菌株中都有檢出攜帶磺胺類抗性基因，其中sul2的相對豐度最高。王瑞旋等[21-22]報道，自雜色鮑(Haliotisdiversicolor)和圓眼燕魚(Plataxorbicularis)等水產動物中分離的哈維氏弧菌中均鑒定出攜帶sul2基因，與本研究結果相似。結合11株哈維氏弧菌對4種磺胺類藥物中的3種均已產生較高程度耐藥性的藥敏結果，說明哈維氏弧菌磺胺類的耐藥表型和磺胺類抗性基因的攜帶情況可能存在一定的相關性，但對磺胺二甲氧嘧啶仍然高度敏感，推測可能與此地區磺胺類用藥的種類及頻率有關，這也表明耐藥表型與抗性基因攜帶并不是完全一致。喹諾酮也是一類在水產養殖中被廣泛使用的抗菌藥。研究認為殘留在水產養殖環境中的喹諾酮類藥物會導致水生細菌產生喹諾酮抗性[23]。本試驗中11株哈維氏弧菌的qnrD基因檢出率及相對豐度均最高。張文文[24]檢測了32株水產致病菌中喹諾酮類抗性基因，結果也顯示qnrD檢出率最高，這與本試驗結果一致，表明qnrD可能是水產致病菌中較為普遍存在的喹諾酮類抗性基因。本試驗中11株哈維氏弧菌對鹽酸環丙沙星和恩諾沙星均敏感，對噁喹酸的最小抑菌質量濃度也較小，但熒光定量PCR檢測結果表明，91%的菌株攜帶喹諾酮類抗性基因。王小亮等[25]研究魚源病原菌也發現，喹諾酮類的抗性基因陽性檢出率顯著高于耐藥檢出率，與本試驗結果相似，說明喹諾酮抗性基因的攜帶與耐藥表型并不一致。另外本試驗中四環素類也有類似情況，所有菌株中均有檢出四環素類抗性基因，其中tet34、tet35的檢出率及豐度均占優勢。Nonaka等[26]發現，海水魚中分離的攜帶tet34的弧菌可表達高水平四環素抗性。本試驗中tet34和tet35在所有菌株中均有檢出且相對豐度整體較高，然而所有菌株對2種四環素類藥物中的土霉素的最小抑菌質量濃度均較低，對強力霉素均較為敏感，表明四環素類抗性基因攜帶與耐藥性情況明顯不一致。本試驗結果表明，弧菌的耐藥表型與抗性基因攜帶常常并不一致，其豐度高低與菌株的耐藥程度也不一定呈正相關。這可能是多種原因引起，如抗性基因發生變異引起功能減弱或功能喪失，也可能是由于抗性基因在菌株受到相應抗生素處理時表達受到抑制等等。因此，細菌抗性基因表達與耐藥表型和耐藥程度的關系值得進一步研究。

4 結 論

本試驗中收集的溫州地區11株哈維氏弧菌對四環素類抗菌藥物較為敏感，對磺胺類和β-內酰胺類藥物耐藥率較高，且大部分菌株已經出現多重耐藥性。所有哈維氏弧菌均攜帶磺胺類、喹諾酮類和四環素類抗性基因，其中磺胺類耐藥表型和抗性基因的攜帶存在一定相關性，而喹諾酮類和四環素類耐藥表型和抗性基因之間則明顯不一致。