維生素C對昆明裂腹魚幼魚抗樂果脅迫能力的影響

楊通枝，詹會祥，姚俊杰，楊 梅，韋玉來，楊龍保

( 1.貴州大學 動物科學學院，貴州 貴陽 550025； 2.畢節市水產技術推廣站，貴州 畢節 551700 )

魚類早期發育階段在整個生活史中最為脆弱，決定其個體存活率，存活率的高低對資源補充有直接影響，幼魚為魚類生活史的重要階段，此階段器官已形成，但尚未發育完全。昆明裂腹魚(Schizothoraxgrahami)是我國特有的高原魚類，被列為貴州省重點保護魚類之一[1]，養殖過程中其幼魚成活率受各種因素的影響。樂果是一種傳統的有機磷內吸性殺蟲劑和觸殺性殺螨劑，作為外圍因子，進入魚體會影響其正常生理功能，造成大量自由基的產生，引起機體損傷，影響其正常生長[2]。7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶能催化農藥在生物體內的降解[3]，伴隨產生的自由基由過氧化氫酶清除[4-5]，過氧化氫酶是機體重要的抗氧化酶，脂質過氧化最主要的代謝產物為丙二醛，均可作為機體受損傷程度的指標[6]。乙酰膽堿酯酶活性能反映農藥是否具有神經毒性。熱休克蛋白(HSPs)在整個生物界中廣泛存在，是一類在生物體中與應激相關的十分重要的蛋白，能對環境應激產生應答，在正常情況下，表達量小或者不表達，作為分子伴侶參與細胞凋亡、蛋白質代謝和細胞周期調控等生理過程。可以抑制產生氧自由基的關鍵酶NADPH氧化酶，其通過反饋作用減少氧自由基的產生，還可增加內源性過氧化氫酶活性。在生物體遇到低氧、高溫、饑餓等刺激時，HSP70 mRNA表達就會顯著增加，增大生物體對不良刺激的耐性，從而維持內環境和細胞生存[7]。HSP70基因是熱休克蛋白最保守的家族基因，發生細胞應激后，反應快速、明顯，具有維持細胞結構穩定以及提高對應激原的耐受性等作用[8]。Yar Ahmadi等[9]研究表明，HSP70 mRNA的表達刺激免疫應答，提高自身疾病抵抗。

維生素C是一種水溶性抗氧化劑，可清除氧自由基、保護細胞免受氧化損傷，在促進魚類生長、緩解應激脅迫和創傷愈合方面有明顯作用[10-13]。研究表明，飼料中維生素C含量的增加會促進血清總抗氧化能力的上升[14]，在孵化水體中添加適宜劑量的維生素C能提高胚胎期的抗氧化能力[15]，維生素C增加魚體內不同組織HSP70 mRNA表達[16-17]，且90 mg/L維生素C對匙吻鱘(Polyodonspathula)仔魚抗氧化有較好的保護作用[18]。

筆者以昆明裂腹魚幼魚為研究對象，探究其在樂果作用下，不同組織中7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶、過氧化氫酶、乙酰膽堿酯酶的活性和丙二醛含量以及肌肉中HSP70 mRNA的表達情況，進一步探究維生素C對其毒性的解脅迫效果，以期為昆明裂腹魚幼魚的養殖培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

昆明裂腹魚幼魚由貴州省畢節市鑫有農業綜合開發有限責任公司雙坪基地提供，選用規格一致、健康活潑，無病、無傷、無畸形的昆明裂腹魚幼魚，試驗魚體長(4.35±0.27) cm，體質量(1.52±0.26) g。暫養于實驗基地中馴養2周，馴養期間，其行為、攝食正常，無并發癥，死亡率<1%。試驗前24 h停止投食。

試驗用水為該基地養殖場所用山泉水，水溫(13.5±0.5) ℃，pH 6.0，溶解氧≥5.0 mg/L，氨氮<0.2 mg/L，亞硝態氮<0.005 mg/L。

試驗用樂果有效成分含量40%，為殺蟲劑，購自廣西匯豐生物科技有限公司。維生素C購自上海豪申化學試劑有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計與樣品的采集

根據前期試驗可知，樂果96 h半致死質量濃度為39.598 mg/L，安全質量濃度為10.182 mg/L。將樂果分5個組進行試驗，分別為1個對照組和4個試驗組，每組3個平行。樂果的質量濃度分別為：0(對照組)、5.091、10.182、24.890、39.598 mg/L，各組持續染毒120 h，且在第96 h采樣后在各試驗組水體中加入90 mg/L維生素C，每12 h換水1/3。分別于0、24、48、96、120 h時，每組取10尾昆明裂腹魚幼魚，每尾魚取肌肉、肝臟和鰓組織，經0.85%的生理鹽水潤洗，濾紙吸干表面水分后迅速投入2 mL離心管中，于冰箱-20 ℃保存，用于酶活性的測定。另取肌肉置于裝有5～10倍體積的RNA保存液的離心管中，4 ℃放置1 d，待RNA保存液充分浸入組織，再置于-20 ℃保存，用于基因克隆及表達的測定。

1.2.2 酶液制備及酶活性測定

稱取對應組織樣品，加入預冷的10倍體積(m/V)的0.85%生理鹽水(等滲)，在冰浴條件下用勻漿器對組織進行勻漿，2500 r/min離心10 min，取上清液于冰箱4 ℃保存，用于酶活測定，且在24 h內測定完畢，否則重制。

采用考馬斯亮藍法測定酶液蛋白濃度，7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶測試盒購自江萊生物，乙酰膽堿酯酶測試盒購自艾美捷科技，過氧化氫酶和丙二醛測試盒購自南京建成生物技術有限公司，均按其說明書進行測定。

1.2.3 實時定量PCR標準曲線的建立及HSP70 mRNA的定量測定

在GenBank中查找收錄的裂腹魚近緣物種齊口裂腹魚(S.prenanti)HSP70的保守序列，運用 Primer 5.0、Editseq和Primerselect軟件設計特異性引物，選取肌動蛋白(β-actin)基因作為實時熒光定量PCR的內參基因，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，其參數見表1。

表1 引物序列及擴增片段大小Tab.1 Sequences and amplified fragment size of the primer used in the experiment

采用動物組織RNA提取試劑盒(康為世紀)對昆明裂腹魚幼魚的肌肉組織進行總RNA提取，用cDNA反轉錄試劑盒(康為世紀)對總RNA反轉錄成cDNA，對cDNA作10倍稀釋，用于制作目的基因和內參基因的標準曲線。以稀釋后的cDNA為模板進行實時熒光定量PCR。實時熒光定量PCR反應體系(10 μL)：2×Talent qPCR preMix 5 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 2 μL，模板2 μL。反應條件：95 ℃下預變性5 min；95 ℃下變性30 s，55 ℃退火溫度30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行30個循環。

1.3 數據處理

數據用SPSS 19.0軟件處理，利用單因素方差分析和Duncan多重比較，結果以平均值±標準誤表示，P<0.05表示差異顯著，P>0.05表示差異不顯著。按照相對比較Ct法(2-△△Ct)計算目的基因的相對表達情況。△Ct為目的基因Ct與內參基因Ct的差值，△△Ct為各處理組△Ct與正常組的△Ct的差值，2-△△Ct為試驗組目的基因的表達相對于對照組變化的倍數。

2 結 果

2.1 樂果對昆明裂腹魚幼魚7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶的影響及維生素C的解脅迫作用

昆明裂腹魚幼魚不同組織7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性變化見圖1。肝臟第24 h各試驗組7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶均顯著上升(P<0.05)，且39.598 mg/L試驗組活性最高，為開始的3.44倍；48 h，10.182、24.890、39.598 mg/L試驗組均顯著下降(P<0.05)，對照組和5.091 mg/L試驗組均顯著上升(P<0.05)；96 h所有試驗組均顯著下降(P<0.05)；120 h除對照組外，其余試驗組均不同程度顯著上升，質量濃度由低到高各組7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性分別上升了1.06、1.05、1.02、1.06倍。

肌肉中7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性第24 h除對照組外均顯著上升(P<0.05)，48 h均顯著下降(P<0.05)，96 h 39.598 mg/L試驗組仍顯著下降(P<0.05)，120 h，質量濃度由低到高各組7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性分別上升了1.04、1.05、1.07、1.04和1.02倍。

鰓中7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性第24 h除對照組外均顯著上升(P<0.05)，24.890、39.598 mg/L試驗組分別增長了2.82和3.44倍，5.091、10.182 mg/L試驗組活性分別上升了1.21和2.28倍；48 h 39.598 mg/L試驗組活性顯著下降(P<0.05)，其他各組活性均顯著上升，24.890 mg/L試驗組活性達最大；96 h均顯著下降，39.598 mg/L試驗組活性低于對照組；120 h 39.598 mg/L試驗組活性持續降低，其他組活性均不同程度升高。

圖1 昆明裂腹魚幼魚不同組織中7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性隨日齡變化情況Fig.1 Changes in EROD activities in different tissues of juvenile S. grahami with age in days圖中同一處理組中，不同字母表示不同試驗組間差異顯著(P<0.05)，相同字母表示無顯著差異(P>0.05)，各組織0 h自上而下的字母分別對應39.598、24.89、10.182、5.091 mg/L，對照組，下同.Means with different letters in the same treatment group are significant differences among test groups (P<0.05), and means with the same letter are no significant differences (P>0.05); the letters from the top to the bottom in each tissue for 0 h correspond to 39.598 mg/L, 24.89 mg/L, 10.182 mg/L, 5.091 mg/L and that in control group, respectively; et sequentia.

2.2 樂果對昆明裂腹魚幼魚過氧化氫酶的影響及維生素C的解脅迫作用

昆明裂腹魚幼魚不同組織過氧化氫酶活性變化見圖2。肝臟過氧化氫酶活性24 h除對照組，其他試驗組均顯著上升(P<0.05)，且39.598 mg/L試驗組活性最高，為0 h的9.46倍，為24.890 mg/L試驗組的5.11倍；48 h 39.598 mg/L試驗組活性顯著下降(P<0.05)，24.890 mg/L試驗組活性上升，其他組活性上升；96 h除對照組外，各組活性均下降，10.182 mg/L試驗組活性達最大，39.598 mg/L試驗組活性低于對照組；120 h各組活性持續下降。

圖2 昆明裂腹魚幼魚不同組織中過氧化氫酶活性隨日齡變化情況Fig.2 Changes in CAT activities in different tissues of juvenile S. grahami with age in days

肌肉過氧化氫酶活性24 h 39.598 mg/L試驗組活性最高，為0 h的5.5倍，為24.890 mg/L試驗組的3.64倍；48 h 39.598 mg/L試驗組活性顯著下降(P<0.05)，24.890 mg/L試驗組活性上升，5.091、10.182 mg/L試驗組活性顯著上升(P<0.05)；96 h 39.598 mg/L試驗組活性低于對照組，其他3組的活性仍持續上升；120 h除對照組，各組過氧化氫酶的活性不同程度下降。

鰓的過氧化氫酶活性第24 h 39.598 mg/L試驗組活性最高為0 h的1.82倍；48 h 39.598 mg/L試驗組活性顯著下降(P<0.05)，24.890 mg/L試驗組活性上升，但仍小于39.598 mg/L試驗組的活性；96 h各組的活性均下降，39.598 mg/L試驗組的活性低于對照組；120 h除對照組，各組過氧化氫酶的活性不同程度下降。

2.3 樂果對昆明裂腹魚幼魚丙二醛的影響及維生素C的解脅迫作用

昆明裂腹魚幼魚不同組織丙二醛含量變化見圖3。肝臟丙二醛含量24 h 24.890、39.598 mg/L試驗組含量分別上升了6.44和8.59倍；48 h含量均下降，但24.890試驗組含量達最高，高于39.598 mg/L試驗組；96 h 24.890 mg/L試驗組含量下降，其余組均上升，39.598 mg/L試驗組含量達最高；120 h各組丙二醛含量均不同程度下降。

肌肉24 h 24.890、39.598 mg/L試驗組丙二醛含量分別為0 h的10.5和12.75倍；48 h各組含量均顯著下降(P<0.05)；96 h各組含量均不同程度上升；120 h除對照組，各組丙二醛含量均不同程度下降。整體含量變化較為一致。

鰓24 h 24.890、39.598 mg/L試驗組丙二醛含量分別為0 h的7.96和11.15倍；48 h 39.598 mg/L試驗組含量顯著下降(P<0.05)，24.890 mg/L試驗組含量上升，高于39.598 mg/L試驗組；96 h上述兩組含量顯著升高(P<0.05)，39.598 mg/L試驗組含量再次達最高；120 h除對照組，各組丙二醛含量不同程度下降，但24.890、39.598 mg/L試驗組含量仍較高。

2.4 樂果對昆明裂腹魚幼魚乙酰膽堿酯酶的影響及維生素C的解脅迫作用

昆明裂腹魚幼魚不同組織乙酰膽堿酯酶活性變化見圖4。肝臟乙酰膽堿酯酶活性24 h 24.890、39.598 mg/L試驗組活性分別上升了2.82和3.44倍；48 h活性均下降，24.890 mg/L試驗組活性達最大；96 h 24.890、39.598 mg/L試驗組活性顯著下降(P<0.05)，5.091、10.182 mg/L試驗組活性顯著上升(P<0.05)；120 h各組乙酰膽堿酯酶的活性均不同程度下降，39.598 mg/L試驗組低于對照組。

肌肉的乙酰膽堿酯酶活性24 h 39.598 mg/L試驗組為0 h的6.58倍；48 h各組活性均顯著下降(P<0.05)；96 h各組活性再次上升；120 h均顯著下降(P<0.05)。各組乙酰膽堿酯酶的活性隨時間變化較為一致。

圖3 昆明裂腹魚幼魚不同組織中丙二醛含量隨日齡變化情況Fig.3 Changes in MDA levels in different tissues of juvenile S. grahami with age in days

鰓的乙酰膽堿酯酶活性24 h 24.890、39.598 mg/L試驗組活性分別為0 h的3.83和4.96倍；其隨時間變化情況與肌肉較為一致。

圖4 昆明裂腹魚幼魚不同組織中乙酰膽堿酯酶活性隨日齡變化情況Fig.4 Changes of AchE activities in different tissues of juvenile S. grahami with age in days

2.5 樂果脅迫下昆明裂腹魚幼魚HSP70 mRNA的表達及維生素C的影響

樂果脅迫下昆明裂腹魚幼魚HSP70 mRNA的表達及維生素C的影響見圖5。不同質量濃度樂果誘導下HSP70 mRNA水平顯著表達(P<0.05)，隨著脅迫時間的延長，由24 h至96 h，除39.598 mg/L試驗組外，其余各組變化均不顯著(P>0.05)，120 h在添加維生素C后各組HSP70 mRNA表達水平均顯著下降(P<0.05)，5.091、10.182 mg/L試驗組的表達水平接近對照組。

圖5 樂果對昆明裂腹魚幼魚HSP70 mRNA相對表達量的影響及維生素C作用的變化Fig.5 Effect of dimethoate on the relative expression level of HSP70 mRNA and the effect of VC on the relative expression level of dimethoate in juvenile S. grahami

3 討 論

3.1 樂果對昆明裂腹魚幼魚不同組織7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性的影響及維生素C對該影響的作用

7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶是細胞色素氧化酶P450中同工酶CYP1A1的一族，可被誘導參與外源物質的降解反應，作為外源污染物的生物標志物[19]，在監測水質對于水產動物生理影響的指標中具有一定的代表性作用。本試驗中，38.598 mg/L(96 h半致死質量濃度)的樂果試驗組對昆明裂腹魚幼魚7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶的誘導均顯著大于10.182 mg/L(安全質量濃度)試驗組，表現出劑量—效應關系，即指一種外來化合物劑量與個體或群體呈現某種效應的定量強度，或平均定量強度之間的關系。同時，樂果對鰓中7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶的誘導作用最大，其次為肝臟，對肌肉的誘導作用最小，且對3種不同組織7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶的誘導均表現出隨時間的延長呈現先升后降的變化趨勢，在添加維生素C后又出現升高的現象，但鰓組織中38.598 mg/L試驗組的7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性無法恢復。這可能是因為樂果進入水體，直接作用于昆明裂腹魚幼魚的鰓組織，對其作用最強，導致其被損壞，無法再正常參與生命活動。而肝臟是生物體主要內源和外源污染物的解毒代謝組織，其具有相對肌肉更強的解毒代謝功能[20]。添加維生素C后，7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶活性升高，說明維生素C能在一定程度上促進機體對農藥等外源物質的降解水平，提高機體耐藥性。

3.2 樂果對昆明裂腹魚幼魚不同組織過氧化氫酶活性的影響及維生素C對該影響的作用

7-乙氧基試鹵靈—脫乙基酶降解農藥的過程中，伴隨著大量自由基的產生，自由基在體內蓄積，將導致機體損傷，使生命體出現病理癥狀[21]。保持自由基處于動態平衡的穩定狀態需綜合外源和內源兩種因素的作用[22]。生物體內的抗氧化酶防御系統在清除活性氧過程中產生過氧化氫，過氧化氫酶自身分解過氧化物自由基，能將過氧化氫轉化成水[4-5]，排出體外，避免機體損傷。本試驗中，過氧化氫酶活性亦表現出劑量—效應關系，其在肝臟、肌肉和鰓中均被大量誘導，且在肝臟中誘導倍數最大，而鰓的誘導基數最大，這可能是因為樂果進入魚體后，直接作用于鰓組織，導致其活性較高，而肝臟主要為解毒代謝器官，其產生的大量自由基釋放于肌肉組織中，導致肌肉中過氧化氫酶活性增高，但肝臟也是樂果直接攻擊受體，損傷程度大于肌肉，在一定程度上喪失解毒功能，表現出過氧化氫酶活性降低，此時肌肉承擔了清除自由基的主要作用，96 h的過氧化氫酶活性上升。添加維生素C后，各組過氧化氫酶活性顯著降低，說明維生素C對機體清除自由基起到了一定的輔助作用，減輕了過氧化氫酶的負擔，使過氧化氫酶活性降低，這與秦國兵等[18]的研究結果一致。

3.3 樂果對昆明裂腹魚幼魚不同組織丙二醛活性的影響及維生素C對該影響的作用

自由基在體內積累到一定程度，會導致脂質過氧化，脂質過氧化程度可通過丙二醛含量體現，其水平高低能夠代表脂質過氧化強度和速率，反映機體氧化損傷程度[6]。本試驗結果表明，鰓中脂質過氧化程度最大，肌肉中最小，說明鰓中自由基積累程度最高，這可能是因為樂果直接作用于昆明裂腹魚幼魚鰓組織后，短時間內自由基無法得到清除而發生脂質過氧化。48 h機體應激反應強烈，自由基被大量清除，經過適應階段后，96 h脂質過氧化不同程度升高。添加外源維生素C后，自由基得到內外雙重作用的清除，積累量少，脂質過氧化程度低。說明維生素C可以直接參與機體內過量自由基的清除，從而保護組織免受自由基過氧化作用損傷[23]。明建華等[24-25]等對維生素C抗應激方面的研究也都得到了相似的結論。姜亞軍等[26]的研究也表明，維生素C能有效捕捉和清除自由基，防止或阻斷自由基引發的氧化反應，參與調節抗氧化酶活性，增強機體對自由基的清除能力。

3.4 樂果對昆明裂腹魚幼魚不同組織乙酰膽堿酯酶活性的影響及維生素C對該影響的作用

有機磷農藥進入魚體后，會抑制其乙酰膽堿酯酶活性[27]，而乙酰膽堿酯酶主要存在于神經組織和血細胞中，因此，乙酰膽堿酯酶的活性變化可反映外源物質是否對機體造成神經毒性。本試驗中，樂果對昆明裂腹魚具有神經毒性，且在鰓中毒性最大，因為樂果進入魚體，直接導致鰓組織遭受破壞，影響氣體交換，呼吸器官肌肉麻痹，流量降低后造成機體處于缺氧狀態[28]。急、慢性缺氧均可導致斑馬魚(Daniorerio)幼魚腦組織產生氧化應激損傷[29]，造成神經毒性。昆明裂腹魚幼魚肌肉中較高的乙酰膽堿酯酶活性，表明肌肉組織中的乙酰膽堿酯酶也是有機磷農藥結合的靶酶，這與齊紅莉等[30]的研究結果一致。而肝臟中乙酰膽堿酯酶活性相對較低，說明樂果對肝組織亦造成了損傷，但對其敏感性低于鰓和肌肉組織，所以昆明裂腹魚幼魚的鰓和肌肉組織中乙酰膽堿酯酶活性高低可以作為衡量水體環境中有機污染物對其造成影響程度的指標。添加維生素C后，不同組織各試驗組的乙酰膽堿酯酶活性均顯著降低，說明維生素C在緩解有機磷對魚類神經損傷方面發揮了積極作用，但具體作用機理有待進一步研究。

3.5 樂果對昆明裂腹魚幼魚肌肉組織HSP70 mRNA表達的影響及維生素C對該影響的作用

HSP70 mRNA在一般情況下不表達或表達量少，在受到外界脅迫時，生物體內的HSP70 mRNA會顯著表達，增加生物體對不良刺激的耐受性，從而維持內環境穩定和正常的生理活動[7]。試驗表明，樂果能在短時間內引起神經膠質U87瘤細胞HSP70 mRNA表達的顯著變化，并存在一定的劑量—效應關系[31]。楊東仁等[32]的研究也表明，樂果作用后可使機體HSP70 mRNA表達增加。HSP70 mRNA表達量升高能增強生物體對農藥的耐受能力[33]。本試驗中，樂果作用24 h，昆明裂腹魚幼魚HSP70 mRNA的表達量顯著升高，與上述研究一致。隨著時間的延長，為保持生命體的內環境穩定性，自身的解毒作用使HSP70 mRNA表達量逐漸下降，但在添加維生素C后，該基因表達量下降更為顯著，增強了昆明裂腹魚幼魚對樂果的耐受性，協助機體完成自身調節功能。

3.6 樂果96 h半致死質量濃度和安全質量濃度對昆明裂腹魚幼魚的毒性差異

96 h半致死質量濃度指96 h造成魚類死亡的外源物質半數致死質量濃度。安全質量濃度表示對魚類影響極小或基本無影響的外源物質含量。本試驗結果表明，樂果質量濃度大于10.182 mg/L(安全質量濃度)的24.890 mg/L試驗組和39.598 mg/L(96 h半致死質量濃度)試驗組對魚類的毒性作用極大，39.598 mg/L試驗組甚至對機體組織造成難以修復的損傷。而10.182 mg/L試驗組和5.091 mg/L試驗組對機體的毒性作用較小，剛開始作用時產生應激反應，隨著作用時間的延長，能通過自身調節逐漸恢復穩定狀態。

4 結 論

本試驗通過模擬養殖水體毒性環境，探究有機磷農藥樂果對昆明裂腹魚幼魚造成的機體損傷，以及維生素C對該損傷的解脅迫能力。試驗結果表明，樂果對昆明裂腹魚幼魚造成的損傷在一定程度上無法恢復，而維生素C能增強機體的抗脅迫能力，提高機體耐藥性，可直接參與機體內過量自由基的清除，在緩解有機磷農藥對魚類神經及氧化損傷方面發揮了積極作用。試驗結果有助于及時正確判斷養殖水體中昆明裂腹魚幼魚對樂果等外源物質的反應和適應程度，并制定有效防治措施，減少不必要的損失，對幼魚培育過程中減少機體損傷，提高養殖存活率有重要意義。