維生素E對尼羅羅非魚生長和性腺發育影響的研究

張 旭，唐瞻楊,2，黃 凱，王麗群，宿志健，劉 婷，王婧杰，麻艷群

( 1.廣西大學 動物科學技術學院，廣西 南寧 530004； 2.廣西水產科學研究院，廣西 南寧 530021 )

維生素是機體生命活動中必需的一種微量化合物，對機體生長、繁育等具有促進作用[1]。作為維生素家族的一員，維生素E俗稱生育酚，可促進魚類生長、提高免疫力、增強抗氧化性、提高生產性能等，在魚類生命活動中起重要作用[2]。維生素E是魚類機體不可或缺的物質且自身無法合成需在食物中攝入，飼料中維生素E含量將影響魚類體內維生素E水平，長時間缺乏維生素E將會給魚類帶來不良影響[3]。維生素E在水生生物應用方面的研究報道已有很多，如細鱗鮭(Brachymystaxlenok)[4]幼魚和胭脂魚(Myxocyprinusasiaticus)[5]幼魚飼料中維生素E需求量的研究顯示，飼料中添加適量維生素E可以顯著提高細鱗鮭幼魚和胭脂魚幼魚的生長指數；在飼料中添加90 mg/kg劑量的維生素E可以顯著促進吉富羅非魚(Oreochromisniloticus)[2]的生長；缺乏維生素E鯉魚(Cyprinuscarpio)[6]性腺的發育指數明顯降低；飼料中添加600 mg/kg維生素E可顯著提高金鯽(Carassiusauratusred)[7]性腺發育指數；

飼料中添加維生素E促進了吉富羅非魚[8]的生殖和免疫功能。

羅非魚作為動物蛋白的主要來源在我國漁業經濟中發揮了重要的作用[9]。維生素E對尼羅羅非魚(O.niloticus)腸道形態結構及性腺發育組織學影響等方面尚缺乏研究。組織切片可用于觀察細胞形態、判斷組織發育狀況等，是反映組織形態變化的最有效方法[10-11]。樊佳偉等[12]對斜帶石斑魚(Epinepheluscoioides，♀)×鞍帶石斑魚(E.lanceolatus，♂)的受精細胞組織切片進行了觀察。隨著組織切片技術的不斷優化，其在斑馬魚(Daniorerio)[13]、吉富羅非魚[14]、草魚(Ctenopharyngodonidellus)[15]等水生生物中已得到廣泛應用。筆者對不同維生素E水平下雌、雄尼羅羅非魚腸道和性腺石蠟組織切片進行分析，擬從組織學角度探討維生素E對尼羅羅非魚腸道及性腺發育產生的影響。試驗結果將為尼羅羅非魚組織學研究提供理論基礎，亦為今后尼羅羅非魚產業健康可持續發展提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

1.1.1 試驗魚

試驗魚來源于廣西水產科學研究院，分別挑選健康、有活力的雌性尼羅羅非魚和雄性尼羅羅非魚作為試驗對象，試驗開始前在溫度(28.0±0.5) ℃、pH 8.0的環境中暫養10 d，暫養期間正常投食。

1.1.2 試劑

無水乙醇、二甲苯、鹽酸、氨水和中性樹膠(國藥集團化學試劑有限公司)，蘇木素—伊紅染液(武漢谷歌生物科技)，4%多聚甲醛通用型組織固定液(廣西南寧楚杰生物科技有限公司)。

1.1.3 儀器

脫水機(武漢俊杰電子有限公司JJ-12J)、包埋機(武漢俊杰電子有限公司JB-P5)、切片機(上海徠卡儀器有限公司RM2016)、烘箱(上海慧泰儀器制造有限公司DHG-9140A)、正置光學顯微鏡(日本尼康Nikon Eclipse CI)。

1.2 飼料制備

試驗基礎飼料由百洋產業投資集團股份有限公司提供，原料組成包括：玉米、次粉、魚粉、豆粕、菜粕、磷酸二氫鈣、氯化鈉等。維生素E(98%)由源葉生物提供，以30 mL/kg大豆油為溶劑。基礎飼料中添加不同劑量維生素E制備5種試驗飼料，分別為0 mg/kg組、40 mg/kg組、80 mg/kg組、120 mg/kg組和160 mg/kg組，飼料混合均勻后密封于低溫干燥處保存備用，試驗飼料營養水平見表1。

1.3 試驗設計

養殖試驗時間為2019年7月15日—8月14

表1 飼料的組成與營養水平 %Tab.1 The ingredients and nutritional levels of the diet

日，為期30 d。試驗共設10個組別，分別為：雌性尼羅羅非魚對照組(0 mg/kg組)，雌性尼羅羅非魚試驗組(40 mg/kg組、80 mg/kg組、120 mg/kg組和160 mg/kg組)；雄性尼羅羅非魚對照組(0 mg/kg組)，雄性尼羅羅非魚試驗組(40 mg/kg組、80 mg/kg組、120 mg/kg組和160 mg/kg組)。每個試驗組3個平行，每個平行30尾試驗魚，養殖期間保持養殖環境不變，同一編號雌性、雄性尼羅羅非魚投喂相同飼料。試驗雌性尼羅羅非魚初始體質量為(19.81±3.90) g，初始全長為(9.73±0.66) cm，試驗雄性尼羅羅非魚初始體質量為(18.55±3.65) g，初始全長為(9.75±0.71) cm。養殖用水為曝曬除氯自來水，換水1次/3 d。每日9:00和17:00各飽食投喂1次，飼料以1 h內吃完為基準，養殖期間試驗魚狀況良好均未出現染病及死亡現象。

1.4 生長參數測定

養殖試驗結束后，分別測量雌、雄尼羅羅非魚全長、體質量，計算生長參數：

特定生長率/%·d-1=(lnm2-lnm1)/t×100%

質量增加率/%=(m2-m1)/m1×100%

相對增長率/%=(L2-L1)/L1×100%

式中，m1為試驗魚初始體質量(g)，m2為試驗魚終末體質量(g)，L1為試驗魚初始全長(cm)，L2為試驗魚終末全長(cm)，t為養殖時間(d)。

1.5 腸道及性腺組織分析

試驗結束時，在雌性、雄性每組試驗魚中分別隨機選取3尾，用魚安定麻醉處理后立即在冰盤上解剖采集中腸和性腺組織，隨即浸泡于4%多聚甲醛通用型組織固定液進行固定。

石蠟組織切片制作方法如下：

脫水機脫水、浸蠟過程：75%酒精4 h→85%酒精2 h→90%酒精2 h→95%酒精1 h→無水乙醇Ⅰ 30 min→無水乙醇Ⅱ 30 min→醇苯5～10 min→二甲苯Ⅰ 5～10 min→二甲苯Ⅱ 5～10 min→蠟Ⅰ 1 h→蠟Ⅱ 1 h→蠟Ⅲ 1 h。包埋機、切片機分別進行包埋和切片處理，片厚4 μm，60 ℃烘箱烤片。

脫蠟程序：二甲苯Ⅰ 20 min→二甲苯Ⅱ 20 min→無水乙醇Ⅰ 10 min→無水乙醇Ⅱ 10 min→95%酒精5 min→90%酒精5 min→80%酒精5 min→70%酒精5 min→蒸餾水洗。

蘇木精—伊紅染色過程：蘇木精染3～8 min，自來水沖洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水沖洗，0.6%氨水返藍，流水沖洗，伊紅染液染色1～3 min。

脫水封片過程：95%酒精Ⅰ 5 min→95%酒精Ⅱ 5 min→無水乙醇Ⅰ 5 min→無水乙醇Ⅱ 5 min→二甲苯Ⅰ 5 min→二甲苯Ⅱ 5 min中脫水透明處理，切片從二甲苯取出稍晾干，中性樹膠封片。

使用正置光學顯微鏡對每張性腺和腸道組織切片進行拍照，在每張腸道切片中隨機選取3根完整絨毛應用Image-Pro Plus 6.0軟件分別測量絨毛高度(mm)、肌層厚度(mm)、絨毛中間區域寬度(mm)并求平均值。

1.6 數據分析

試驗數據由SPSS 17.0統計軟件進行統計分析, 利用Duncan′s 功能進行多重比較分析, 差異顯著水平為0.05。

2 結 果

2.1 生長參數

尼羅羅非魚生長參數見表2。飼料中添加維生素E對雌性尼羅羅非魚終末體質量、終末全長、質量增加率、相對增長率和特定生長率均起到促進作用，其中添加量為120 mg/kg時作用效果最佳(P<0.05)。維生素E添加量為160 mg/kg時雄性尼羅羅非魚終末體質量、質量增加率和特定生長率達到最大值(P<0.05)。飼料中添加維生素E對雄性尼羅羅非魚終末全長和相對增長率無顯著影響(P>0.05)。以飼料中維生素E添加量為自變量，雌、雄尼羅羅非魚質量增加率為因變量，分別將雌、雄尼羅羅非魚質量增加率(y)與維生素E添加量(x)進行回歸分析，回歸方程如下：

雌性：y=-8×10-5x2+0.0173x+0.8434 (r2=0.9875)

雄性：y=0.0051x+1.9059 (r2=0.9225)

經回歸分析發現，雌性、雄性尼羅羅非魚體質量增加率與維生素E添加量的回歸曲線擬合優度r2分別為0.9875和0.9225，說明回歸曲線對觀測值的擬合程度較好滿足試驗分析。試驗結果表明，雌性尼羅羅非魚質量增加率在維生素E添加量為120 mg/kg時達到最大值，雄性尼羅羅非魚質量增加率在維生素E添加量為160 mg/kg時達到最大值。

2.2 腸絨毛參數

尼羅羅非魚雌魚、雄魚中腸組織形態結構見圖1。對每張切片絨毛高度、絨毛寬度和肌層厚度進行分析發現，飼料中維生素E添加量為80 mg/kg時，雌性尼羅羅非魚肌層厚度最大(P<0.05)(表3)；維生素E添加量為120 mg/kg時，雌性尼羅羅非魚絨毛寬度顯著升高(P<0.05)。飼料中添加維生素E對雄性尼羅羅非魚中腸組織形態結構無顯著影響(P>0.05)。

表2 雌性、雄性尼羅羅非魚的性狀參數Tab.2 Growth parameters of male and female Nile tilapia O. niloticus

表3 腸道形態學參數 mmTab.3 Intestinal morphological parameters

2.3 性腺發育指數

尼羅羅非魚卵巢、精巢組織發育情況見圖2，參照文獻[16]的性腺分期方法對尼羅羅非魚性腺發育情況進行分析。尼羅羅非魚卵巢發育情況：0 mg/kg(♀)組卵巢組織細胞形態不規則，細胞質呈嗜堿性被染成深藍色，細胞核呈嗜酸性被染成紅色，細胞核內出現多個核仁，屬Ⅱ期卵巢(圖2a)。40 mg/kg(♀)組、80 mg/kg(♀)組和160 mg/kg(♀)組卵巢組織細胞形態規則多為圓形，細胞質、細胞核顏色減弱，胞內出現不規則空泡，核仁緊貼核膜排布，屬Ⅲ期卵巢(圖2b,c,e)。120 mg/kg(♀)組卵巢組織細胞變大，核膜開始溶解，核仁消失，細胞質內充滿大的卵黃顆粒與空泡交錯排列，屬Ⅴ期卵巢(圖2d)。試驗結果顯示，維生素E含量為120 mg/kg時尼羅羅非魚卵巢發育程度最好，屬Ⅴ期卵巢。

尼羅羅非魚精巢發育情況：0 mg/kg(♂)組和40 mg/kg(♂)組精巢組織中初級精母細胞較多且細胞較小，細胞形態規則多為圓形，細胞核染色較深，屬Ⅱ期精巢(圖2f,g)。80 mg/kg(♂)組和120 mg/kg(♂)組精巢組織中次級精母細胞、初級精母細胞和精子細胞并存，細胞核嗜堿性染色較深，屬Ⅲ期精巢(圖2h,i)。160 mg/kg(♂)組精巢組織中發現精小管含有大量精子細胞以及少數成熟精子，精子細胞沒有明顯核質界限，染色較深，屬Ⅳ期精巢(圖2j)。在維生素E添加量為160 mg/kg時尼羅羅非魚精巢發育程度最高，屬Ⅳ期精巢。

圖2 尼羅羅非魚性腺組織(♀：卵巢； ♂：精巢)切片Fig.2 The gonad histological section of Nile tilapia O. niloticus (♀：ovary； ♂：testis)N.細胞核； Nu.核仁； PS.初級精母細胞； Sp.精子； St.精子細胞； YV.卵黃泡； ZR.放射帶.N.nucleus; Nu.nucleolus; PS.primary spermatocyte; Sp.sperm; St.spermatid; YV.yolk vesicle; ZR.zona radiata.

3 討 論

3.1 維生素E對尼羅羅非魚生長性能的影響

大量研究結果表明，維生素E是魚類維持正常生命活動的必需物質，缺乏維生素E會引起魚體各項機能發生紊亂，不利于魚類的生長發育[3]。王源等[17]研究表明，在飼料中添加30 mg/kg維生素E可顯著促進三文魚生長發育；劉漢鵬[18]研究表明，在七彩神仙魚(Symphysodonharaldi)幼魚飼料中添加80 mg/kg維生素E可顯著促進其生長發育。常杰等[4,19]研究表明，適量維生素E可改善細鱗鮭幼魚和瑪拉巴石斑魚(E.malabaricus)的生長性能；張志強等[5]在胭脂魚幼魚對維生素E需求量的研究中發現，飼料中維生素E添加量為50.60 mg/kg時獲得最大生長性能。本試驗結果表明，飼料中維生素E添加量為120 mg/kg時雌性尼羅羅非魚生長性能最佳，雄性尼羅羅非魚在維生素E添加量為160 mg/kg時生長性能最佳，飼料中添加適量維生素E可顯著提高尼羅羅非魚生長性能，這與上述研究結果相符。此外，物種不同或相同物種生長階段不同都會造成對維生素E的需求量不同[20-22]，推測尼羅羅非魚雌魚與雄魚由于所處生長發育階段不同造成了維生素E最適添加量的差異。

3.2 維生素E對尼羅羅非魚消化道結構的影響

腸道是魚類進食后消化吸收的重要器官，其絨毛形態和肌層厚度將影響魚類的消化吸收能力[23-24]。腸絨毛作為腸道內部消化吸收的主要部位，其長度和寬度影響腸道內部消化吸收的表面積，面積越大則腸道消化吸收營養物質的效率越高；肌層厚度影響腸道肌肉蠕動能力，能力越強越有利于腸道內物質的運輸和吸收[25]。王壇等[26]研究發現，飼用溶菌酶可以顯著促進吉富羅非魚腸道絨毛高度，對吉富羅非魚的生長起到促進作用；胡海濱等[27]在大豆黃酮對大菱鲆(Scophthalmusmaximus)生長、消化酶活力、抗氧化力及腸道結構影響的研究中發現，適量的大豆黃酮可以改善大菱鲆后腸腸道結構,保護腸道結構完整性。本試驗中，維生素E添加量為80 mg/kg時雌性尼羅羅非魚肌層厚度顯著升高，維生素E添加量為120 mg/kg時雌性尼羅羅非魚絨毛寬度顯著升高，同樣維生素E添加量條件下雌性尼羅羅非魚生長均受到顯著促進作用，由此可知，飼料中添加維生素E可以通過改善雌性尼羅羅非魚腸道組織形態結構，提高腸道消化吸收能力進而促進雌性尼羅羅非魚的生長發育。但本試驗結果發現，飼料中添加維生素E對雄性尼羅羅非魚腸道組織結構影響不顯著，推測試驗魚性別不同造成了維生素E需求量的不同，雄性尼羅羅非魚對維生素E需求量的研究還有待進一步深入。綜上所述，飼料中添加適量維生素E可改善雌性尼羅羅非魚絨毛形態和肌層厚度，提高雌性尼羅羅非魚的消化吸收能力，促進雌性尼羅羅非魚的生長。

3.3 維生素E對尼羅羅非魚繁殖性能的影響

維生素E作為一類酚類化合物與機體固醇類激素合成密切相關，其在促進水生動物性腺發育提高繁殖性能等方面具有重要的作用[28]。大量研究表明，維生素E對半滑舌鰨(Cynoglossussemilaevis)[29]、克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)[30]、鯉魚[6]、金鯽[7]等水生動物的繁殖性能均有顯著促進作用。本試驗結果表明，維生素E對尼羅羅非魚卵巢、精巢發育均起到促進作用，其中，維生素E添加量為120 mg/kg時，尼羅羅非魚卵巢發育成熟度最好，維生素E添加量為160 mg/kg時，尼羅羅非魚精巢發育成熟度最好，這與上述研究結果相符。

4 結 論

維生素E作為一種重要的微量營養因子和天然的抗氧化劑，是存在于所有細胞膜和細胞器中的高效生物抗氧化劑，與動物生長發育密切相關。飼料中添加適量維生素E不但可以有效調控性腺中類固醇激素的生物合成，促進機體性腺發育提高動物的繁殖性能，而且也可以調節動物機體新陳代謝促進動物機體的生長。