不同種植年限老芒麥根際土壤營養與細菌群落多樣性

劉艷君，劉文輝，祁 娟，姚 拓，李建宏，李昌寧

(1.甘肅農業大學草業學院,草業生態系統教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.青海省畜牧獸醫科學院，青海省青藏高原優良牧草種質資源利用重點實驗室，青海 西寧 810016)

老芒麥(ElymussibiricusL.)是多年生疏叢型中旱生草本植物，具有很高的營養價值，產草量高，營養豐富，適口性好、消化率較高，為各類牲畜所喜食[1]。而且老芒麥適應性強，易栽培，具有抗寒、抗旱和耐鹽等特性[2]。近年來，該品種在青藏高原東緣生態恢復重建、退化沙化草地治理、三江源保護、退牧還草、種草養畜及人、草、畜三配套等工程建設中發揮著骨干草種的作用[3-4]。

研究表明，植物根際含有大量的營養元素和豐富的微生物群落結構，微生物群落中細菌是最主要的組成成分，生物學特性各異，繁殖速度較快[5]，且土壤和細菌之間存在復雜的互作關系，細菌可促進土壤中有機殘體的分解和潛在養分的轉化，提高土壤供肥能力，釋放出的CO2可供植物進行光合作用。同一作物種植年限越長，受自身和過多施肥等外界條件影響越大，土壤理化性質會發生劣變、質量下降;且種植年限過長會引起植物消耗過多養分，不利于保持養分供給平衡，同時引起土壤微生物群落結構失衡，有害真菌的種類和數量增加，細菌的種類和數量減少[6]。目前，國內關于不同種植年限果樹、蔬菜、藥材土壤養分的報道較多[7-8]，關于老芒麥的研究則主要集中在種植行距、播種量、施肥方式、雜草防治等方面[9-10]，對于不同種植年限老芒麥根際土壤營養特性和微生物群落多樣性方面的報道極少，零星報道表明隨著種植年限的延長，出現老芒麥根系分泌物和鹽分積累、養分失衡、土傳病害加重等一系列問題，形成對老芒麥生長不良的逆環境[4,11]。因此本研究以高通量測序技術研究不同種植年限對老芒麥根際土壤細菌群落多樣性和營養指標的影響，采用相關性分析揭示老芒麥根際土壤細菌群落(屬水平)和營養指標間的相互關系，以期為老芒麥人工草地科學管理、根際土壤養分改善和根際微生態調控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地位于祁連山系大通山脈西南麓，青海省海晏縣國家牧草繁育基地，地處36°54′N，100°59′E，海拔3 159 m，是高原大陸型氣候，屬高寒地貌，干濕季分明，雨熱同季，年平均降水量403.6 mm左右，年蒸發量1 581.75 mm左右，無絕對無霜期[12]。

1.2 樣品采集

試驗材料為不同生長年限的青牧1號老芒麥根際土壤。以種植3 a老芒麥 (Y3)根際土壤為對照組，4 a生老芒麥(Y4) 和7 a生老芒麥(Y7)根際土壤為試驗組。試驗地選擇坡度、坡向、海拔一致的樣方(10 m×10 m)，按照對角線法選擇長勢一致的蠟熟期老芒麥，將其整株挖出，去除根系周圍附著土壤，抖落離老芒麥根系1 cm 的土壤即為根際土壤[13]。分別采集Y3、Y4和Y7的根際土壤，每個樣品3次重復。剔除可見的動、植物殘體和石塊后，將取得的土壤裝入無菌樣品采集袋中，放入采樣箱(-4℃)帶回實驗室。一部分土壤置于室內自然風干，過1 mm及 0.25 mm篩子后用于理化性質測定；另一部分于-80℃保存，用于土壤總DNA 的提取。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤pH值和營養指標的測定 土壤理化性質的測定方法參考 《土壤農化分析》[14]，其中，土壤理化指標包括土壤pH、有機質(SOM)、全氮 (TN)、全磷 (TP)、全鉀 (TK)、速效氮 (AN)、速效鉀 (AK)和速效磷 (AP)。

1.3.2 土壤總DNA提取及細菌16S rRNA基因擴增 土壤總DNA 基因組采用DNA提取試劑盒進行提取，參考試劑盒說明書操作，并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質量。將每個土樣提取出的3個DNA樣品充分混合后作為PCR擴增模版，采用16S rRNA基因V3～V4 區域通用引物338F和806R進行PCR擴增，擴增條件參照Fadrosh等[15]方法進行擴增。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，送至上海可力梅塔生物醫藥科技有限公司，采用Illumina Miseq 高通量測序技術進行測序和分析。

1.3.3 生物信息學分析 Miseq測序完成后，得到原始的下機數據，利用overlap將雙端數據進行拼接，并進行質控、嵌合體過濾，獲得高質量的有效數據。對最終獲得的有效數據進行97%的相似度聚類，過濾singleton序列，獲得最終的OTU豐度及代表序列，進一步進行多樣性分析、物種分類組成分析和差異分析等[16]。

1.4 數據分析

采用SPSS 19.0軟件對營養指標的數據進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan 新復極差法進行差異顯著性檢驗(α=0.05)，表中所有數據為平均值±標準差。用QIIME軟件計算Chao1、Shannon 和Simpson指數，用R軟件繪制稀釋曲線、Venn圖及物種分類柱狀圖。用R軟件中psych包的corr.test函數計算細菌群落和土壤營養指標的Spearman相關系數值并檢驗其顯著性，然后用pheatmap包中的pheatmap函數進行可視化。

2 結果與分析

2.1 土壤營養特征變化規律

表1表明，老芒麥種植年限對pH的影響表現為隨種植年限的增加而增大，但Y4與Y7間差異不顯著。較Y3而言，全氮、速效氮和速效磷含量隨種植年限的增加均呈顯著降低趨勢(P<0.05)，連續種植老芒麥4 a和7 a分別可使全氮減少21.9%和34.5%，速效氮減少12.0% 和24.2%，速效磷減少32.0% 和38.9%。有機質、全磷和全鉀含量亦隨種植年限的增加而降低，老芒麥種植第4年SOM、TP和TK較第3年分別減少28.5%、27.3% 和17.8%，但Y4與Y7之間差異均不顯著。速效鉀(AK)含量以Y4的含量最高，Y7最低，說明種植老芒麥第4年時對AK的含量貢獻最大，種植第7年可使AK的含量減少。

2.2 測序數據分析及OTU量

本研究通過高通量測序共得到有效序列41022 條，質控過濾后得到36308 條優質序列，在97%的相似水平下對序列進行OTUs聚類，共產生6033 個OTUs (系列號：PRJNA562109)。OTUs的稀釋曲線均趨于平緩，說明測序數據量已飽和，能夠準確反映土壤細菌群落信息(圖1)。

從圖2可以看出，3個土壤樣品所共有的OTUs為1149個，其中Y3、Y4和Y7中所特有的OTUs數目分別為221、101和152個，較Y3而言，Y4和Y7的OTUs出現減少的現象，Y4的OTUs最少。

表1 不同種植年限老芒麥的根際土壤營養指標

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Sample rarefaction curve

圖2 不同樣地根際土壤細菌OTUs數量韋恩圖Fig.2 Wenn diagram of the number of bacterio OTUs inrhizosphere soil from different plots

2.3 細菌群落多樣性

2.3.1 細菌群落Chao 1指數和Shannon指數的變化 Chao1指數越高表明樣品物種豐富度越高，由圖3(a)可知，Y3、Y4、Y7的Chao 1指數分別為2 605.42，2 518.46，2 483.89，隨著老芒麥種植年限的增加呈下降趨勢，表明種植年限越長，老芒麥根際土壤細菌群落的豐富度下降。

Shannon指數越高表明樣品物種多樣性越高，從圖3(b)可以看出，不同年限老芒麥根際土壤細菌群落Shannon指數呈現減小的趨勢， Y3、Y4和Y7的Shannon指數分別為9.79，9.65和9.62(P>0.05)，表明種植老芒麥4 a以后細菌群落的多樣性趨于不變。

2.3.2 細菌群落門水平Unifrac 距離的UPGMA聚類分析 通過對Y3、Y4和Y7樣品在門水平上進行加權Unifrac 距離的UPGMA聚類分析(圖4)，結果顯示Y4與Y3樣地間細菌組成及豐度相似性基本一致，與Y7樣地間差異較大。

圖3 不同種植年限老芒麥根際土壤細菌群落Chao 1 (a)和Shannon (b)指數的變化Fig.3 Changes of Chao 1 (a) and Shannon (b) indices of bacteria community ofrhizosphere soil of Elymus sibiricus in different planting years

圖4 門水平上物種組成UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of bacteria communitycomposition at phylum level

2.4 土壤細菌群落分布特征

2.4.1 細菌群落在門水平上的組成 由圖5(a)可見，在門分類水平上，對豐度前20的細菌群落組成進行分析，不同種植年限老芒麥根際土壤細菌群落以變形菌門 (Proteobacteria)、放線菌門 (Actinobacteria)、酸桿菌門 (Acidobacteria)、綠彎菌門 (Chloroflexi)、芽單胞菌門 (Gemmatimonadetes)、擬桿菌門 (Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)為主。其中變形菌門的豐度以Y7(35.3%)的最高，Y3(31.4%)次之，Y4(28.6%)最低；酸桿菌門以Y4(21.2%)的最高，Y3(17.5%)次之，Y7(17.3%)最低；放線菌門隨種植年限的增加而減少，其豐富度在Y3、Y4和Y7中依次為28.6%、26.8%和26.7%；芽單胞菌門隨種植年限的增加而增加，Y3、Y4和Y7中的豐富度依次為5.9%、6.6% 和8.0%。

2.4.2 細菌群落在屬水平上的組成 圖5(b)表明，在屬分類水平上，Y3、Y4和Y7中未鑒定的菌屬分別為48.4%、52.9%和47.1%，對Y3、Y4和Y7已鑒定的細菌群落豐富度在前20的細菌進行分析，發現優勢菌群依次為Norank_c_Subgroup_6、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)、Norank_f_Gemmatimonadaceae、芽球菌屬(Blastococcus)和RB41。其中Norank_c_Subgroup-6在Y3、Y4和Y7的相對豐度分別為9.4%、11.6%和10.2%，Sphingomonas的相對豐度分別為 5.5%、4.8%和5.1%，Norank_f_Gemmatimonadaceae的相對豐度分別為3.7%、4.3%和5.8%，Blastococcus的相對豐度分別為4.2%、3.7%和3.4%。

2.5 細菌組成與土壤營養指標的Spearman相關性分析

Spearman相關性分析表明(圖6)，土壤pH與Bacillus、RB41和Norank_f_67-14呈極顯著正相關(P<0.001)，與Norank_f_Gemmatimonadaceae、Norank_c_Subgroup_6、Cryobacterium、Ellin6055和Ellin6067呈極顯著負相關；SOM與Gaiella和MND1呈極顯著正相關(P<0.001)，與Norank_o_Rokubac-teriales、Norank_c_KD4-96、Skermanella、Solirubrobacter和Candidatus_Alysiosphaera呈極顯著負相關；TN、TP和TK 與Norank_o_Rokubacteriales、Norank_c_KD4-96、Skermanella、Solirubrobacter和Candidatus_Alysiosphaera均呈極顯著正相關(P<0.001)，與MND1和Gaiella呈極顯著負相關；AN與Norank_f_JG30-KF-CM45、鞘氨醇單胞菌屬、Rubrobacter、芽球菌屬和Arthrobacter呈極顯著正相關(P<0.001)； AP和AK與Candidatus_Alysiosphaera、Skermanella、Solirubrobacter、Norank_c_KD4-96和Norank_o_Rokubacteriales呈顯著正相關(P< 0.001)，與MND1和Gaiella呈極顯著負相關。

圖5 細菌群落在門水平(a)和屬水平(b)分布特征分析 Fig.5 Analysis of distribution characteristics about bacterial communities at phylum level (a) and genus level (b)

注: X軸和Y軸分別為環境因子和物種，通過計算獲得相關性R值和P值。R值在圖中以不同顏色表示，若P<0.05則用 * 標出，右側圖例是不同R值的顏色區間； * 表示0.01

3 討論與結論

3.1 不同種植年限老芒麥根際土壤肥力特性

作物的連續種植會向土壤釋放一系列的次生代謝產物，代謝產物的積累會引起土壤營養指標的惡化并且產生嚴重的毒害作用[17]。本研究發現老芒麥人工草地4 a以后，隨著年限的逐漸延長，土壤根際的全氮、速效氮、速效磷的含量逐漸減少。有研究發現茶樹連續種植4 a后可使土壤的全氮、速效磷含量及脲酶的活性下降，致使土壤營養元素缺乏和循環能力降低[7]，并且植物的生產力也會受到抑制[18]。

本研究發現，pH隨種植年限的增加而增大，這一結論與研究不同種植年限對設施蔬菜土壤pH逐年酸化的結論相反[19]。此外，本研究還發現老芒麥根際土壤有機質、全磷和全鉀含量也隨種植年限的增加而降低，但Y4與Y7均差異不顯著。這說明不同種植年限的老芒麥根際土壤的有機質、全磷和全鉀呈現先減少后保持穩定的趨勢，究其原因可能是老芒麥人工草地建植的前3年適應能力強，草地的物種組成單一，微生物主要在老芒麥根際進行繁殖及代謝活動，促進了土壤有機質的大量分解，全磷被溶磷微生物所分解，致使全磷的含量減少[7,16]，這一研究結論通過相關性分析也得到了證實(圖6)，如Norank_o_Rokubacteriales、Norank_c_KD4-96、Skermanella、Solirubrobacter和Candidatus_Alysiosphaera均與全磷呈極顯著正相關(P<0.001)，而MND1和Gaiella與全磷呈極顯著負相關。但也有研究發現隨著人工草地種植年限的增加，會有大量的雜草不斷生長，草地發生演替，植物的豐富度和多樣性會逐年升高，植物根際的有機質和全磷被其他的雜草生命活動所利用[20]。

3.2 不同種植年限老芒麥根際土壤細菌群落多樣性

Chao 1指數和Shannon指數分別表示樣品中細菌群落的豐富度和多樣性，Chao 1值越高表明細菌群落的豐富度越高，Shannon指數越高表明微生物群落的多樣性越高[21]。試驗發現Y3、Y4和Y7的Chao1指數呈不斷下降趨勢，表明隨種植年限增長，老芒麥根際土壤細菌群落的豐富度下降越明顯。Shannon指數的變化趨勢與Chao 1相一致。邵穎等[18]研究發現微生物群落的組成和多樣性主要與其所處的生境有關，種植年限增加，植物根際分泌的次生代謝物降低了根際生態環境的穩定性，使得根際微生物的數量減少。

本研究發現在門水平上變形菌門和放線菌門的相對豐度均較高且含量大于18%，并且放線菌門的豐度在Y3、Y4和Y7中依次減少，表明老芒麥種植年限的增加不利于放線菌門細菌群落的繁殖，究其原因主要是放線菌門參與土壤中有機質的代謝活動，能將有機質分解為碳源[22]，這也與本研究中隨著老芒麥種植年限的增加有機質含量減少的結論相似。變形菌門和酸桿菌門由于其不同的生活方式，常被用作衡量土壤營養狀況的指標[21]，酸桿菌門的相對豐度能夠表明土壤的酸性條件[23]。芽單胞菌門的豐度在Y3、Y4和Y7中依次增大，因為芽單胞菌門有很強的脫氮功能，其相對豐度隨著氮素水平的增加而降低[24]，而本研究中隨著老芒麥種植年限的增加,全氮及速效氮的含量均減小。

在屬水平上，細菌群落芽球菌屬的豐富度隨著老芒麥種植年限的增加呈減少趨勢，表明老芒麥種植年限會影響芽球菌屬的相對豐富度，不利于芽球菌屬細菌群落的繁殖，通常芽球菌屬可適應干旱、酸性、重金屬、抵抗輻射和厭氧等極端環境，可產生孢子，但不容易分離培養，其抗逆境的特性可在環境修復、沙漠治理等方面應用[25-26]。鞘氨醇單胞菌屬在Y3、Y4和Y7中的細菌群落豐富度以Y4最低，Y7次之，Y3的豐富度最高，此結果表明，較Y3而言，鞘氨醇單胞菌屬的豐富度以第4年下降最快，已有研究表明鞘氨醇單胞菌屬的群落在其生命活動中可分泌過氧化氫酶，而過氧化氫酶可分解植物根系分泌的有毒性物質，通常起到解毒作用，被視為植物益生菌[27]。此外，本研究發現在老芒麥根際細菌群落未鑒定菌屬豐富度在Y3、Y4和Y7中分別為48.4%、52.9%和47.1%，表明在老芒麥種植的樣地中依然存在大量的未挖掘利用的微生物資源。