馬鈴薯瘡痂病高效生防芽孢桿菌的篩選及發酵條件優化

周洋子，邱慧珍，董 莉，魏茹云，董愛菊，王友玲,王 川

(1.甘肅農業大學資源與環境學院/甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省畜禽廢棄物資源化利用工程研究中心，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學動物醫學學院，甘肅 蘭州 730070)

由鏈霉菌(Streptomycesscabies)引起的馬鈴薯瘡痂病是一種常見的土傳病害，在世界各地馬鈴薯栽培區均有發生[1-2]。目前對這一病害最有效的防治方法是化學防治[3]，但大量使用化學藥劑會造成土壤污染、降低土壤質量[4]、病原菌易產生抗性[5]等問題。生防菌中的芽孢桿菌，極易在環境中存活、定殖[6]，且具備環境友好、安全無毒等特點，是一類重要的植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR)[7]，因此在農業生產上得到廣泛應用，有效防控了黃瓜枯萎病[8]、香蕉枯萎病[9]、西瓜枯萎病[10]等作物的土傳病害。

抗菌物質的分泌是芽孢桿菌重要的生防機制[11]。脂肽類化合物是芽孢桿菌產生的主要抑菌活性物質，包括表面活性素(Surfactin)、伊枯草菌素(Iturin)和豐原素(Fengycin)3大類，不同種屬的芽孢桿菌可產生不同或相同的抗菌物質[12-14]。我們前期從土壤中分離到5株芽孢桿菌對馬鈴薯黑痣病病原菌立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)有很好的拮抗能力[15-17]，但其對鏈霉菌(Streptomycesscabies)引起的馬鈴薯瘡痂病是否有拮抗作用尚不清晰，而且是否具有合成脂肽類化合物等抑菌活性物質的能力也未見報道。為此，本研究旨在從該5株菌中篩選出對馬鈴薯瘡痂病原菌拮抗效果最佳的菌株，并對其生防機理進行初步探究，同時對篩選出效果最佳的菌株固態及液態發酵條件進行優化，以提高菌種生產量，為利用該菌株生產生物有機肥等應用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株 類芽孢桿菌(Paenibacillusjamilae)QHZ-1、萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)QHZ-2、萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)QHZ-3、莫海威芽孢桿菌(Bacillusaxarquiensisstrain)QHZ-4、萎縮芽孢桿菌(Bacillusatrophaeus)QHZ-5由本實驗室課題組分離、鑒定與保存[15-17]，

病原菌馬鈴薯瘡痂鏈霉菌(Streptomycesscabies)由甘肅省農業科學院惠贈。

1.1.2 供試培養基 LB培養基、燕麥瓊脂培養基、高氏1號培養基。

1.1.3 供試有機肥料 由江陰生物科技有限公司提供，有機質含量46.50 %，氮含量(N)1.41 %，磷含量(P2O5)3.25 %，鉀含量(K2O )0.82 %。

1.2 試驗設計與方法

1.2.1 生防菌的拮抗效果 將病原鏈霉菌接種于燕麥瓊脂培養基上，用無菌水沖洗孢子，4℃離心20 min，棄上清，用20%的甘油液重懸孢子，于-20℃保存備用。采用平板對峙法，取病原菌孢子懸液涂布于高氏1號培養基平板，并將已活化的待篩選菌種點接至培養基上，觀察比較抑菌圈大小。

1.2.2 拮抗菌株的功能基因分析 本試驗采用PCR對菌株基因組中脂肽抗生素合成相關基因進行檢測。采用的引物是以菌株SQR9的相應基因序列為模板[18]，通過軟件Primer Premier 5設計而來，另一部分引物序列見表1。將擴增產物進行檢測純化后，送至蘇州金唯智生物科技有限公司測序。將得到的核苷酸序列在NCBI上進行BLAST比對，并進行功能基因的同源性分析。

表1 PCR擴增所需引物

1.2.3 發酵濾液的抑菌活性測定 采用牛津杯法測定抑菌活性。取100 μL病原菌孢子懸液涂布于高氏1號培養基平板，在培養基中間放置1個無菌牛津杯，加入菌株發酵濾液，于28℃黑暗培養4 d，觀察抑菌圈的產生。

1.2.4 代謝抑菌物質對pH、紫外、溫度的耐受性檢測 酸堿耐受性檢測：0.1 mol·L-1的鹽酸與氫氧化鈉調節無菌濾液pH值，pH值范圍為3～11，保持1 h后調節pH為7.0，各取100 μL加入牛津杯，28℃黑暗培養4 d，記錄抑菌圈大小。

熱耐受性檢測：將無菌濾液分別在20、40、60、80、100℃下保溫20 min，冷卻后各取100 μL加入牛津杯，28℃黑暗培養4 d，記錄抑菌圈大小。

紫外耐受性檢測：將無菌濾液放置紫外燈下 2、4、6、8 h，以不做處理的無菌濾液為對照，各取100 μL加入牛津杯，28℃黑暗培養4 d，記錄抑菌圈大小。

1.2.5 液態發酵條件優化 液態發酵種子液的制備：將菌株在LB培養基上活化，挑單菌落于液體LB培養基中，培養菌液OD值達到2.0左右，作為種子液，此時菌體量約為108cfu·mL-1。

活菌數的測定:采用平板稀釋法，將發酵菌液用無菌水稀釋后各取50 μL，涂布于平板，3 d長出菌落后計數，公式為：

活菌數(cfu·mL-1)=菌落數/吸取量×稀釋倍數

裝液量優化試驗：每250 mL的三角瓶中裝液量分別為20、40、60、80、100、120 mL，將新鮮菌液按1%接種量，于37℃、170 r·min-1的條件下振蕩培養24 h后，測其生長量，檢測其對氧氣的需求情況。

接種量優化試驗：將新鮮菌液分別按1%、2%、4%、6%、8%、10%的接種量，于裝液量60 mL、37℃、170 r·min-1的條件下振蕩培養24 h后，測其生長量，檢測其最適接種量。

培養時間優化試驗：將新鮮菌液按1%的接種量，于裝液量60 mL、37℃、170 r·min-1的條件下，分別振蕩培養24、36、48、60、72 h后，測其生長量，檢測其最適培養時間。

轉速優化試驗：將新鮮菌液按1%的接種量，于37℃，裝液量60 mL，轉速分別為150、160、170、180、190 r·min-1的條件下振蕩培養24 h后，測其生長量，檢測其最適轉速。

液態發酵條件正交優化試驗：在以上單因素試驗的基礎上選取3個最適水平進行L9(34)正交試驗。

1.2.6 二次固體發酵接種量的優化 取有機肥7 kg放置于周轉箱(內徑56 cm×36 cm×28 cm)，將氨基酸水解液(AA)按15 %(V/m )加入，攪拌混勻。定期取樣測pH值，平衡7 d后備用。以液態發酵優化后的條件培養二次固體發酵的種子液，將QHZ-3-RFP菌株發酵液分別按1%、5 %、10%、15%(V/m)接入，每天翻堆1次，好氧發酵8 d。每天定時取樣，采用平板計數法測定細菌數量(平板計數培養基：酵母浸粉5 g、蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、卡那霉素100 μg·mL-1)。

1.3 數據處理

采用 SPSS 17.0對單因素試驗結果進行單因素方差分析(one-way ANOVA)和LSD多重比較，origin 2017 64Bit制圖。

2 結果與分析

2.1 生防芽孢桿菌對馬鈴薯瘡痂病病原菌的抑菌效果

從圖1可以看出，5株生防菌中，除QHZ-4對馬鈴薯瘡痂病病原菌沒有明顯抑制效果以外，其他4株菌對病原菌均有不同程度的抑制，其中QHZ-3的抑菌效果最佳，結合表2數據可得，抑菌圈直徑達20 mm，抑菌率高達44.4%。

2.2 5株生防芽孢桿菌脂肽類抗生素合成基因檢測

為了驗證5株生防菌是否具有產生抗菌物質的能力，對5株菌中抗菌物質合成基因進行了測定，結果如圖2所示。

圖1 5株生防芽孢桿菌對馬鈴薯瘡痂病病原菌的抑菌效果Fig.1 Inhibitory effect of 5 biocontrol bacteria on potato scab pathogen

表2 5株生防芽孢桿菌對馬鈴薯瘡痂病病原菌的拮抗作用

表2結果表明：所有菌株均擴增出與目的片段(535 bp)相同大小的條帶。結合測序結果，我們可以確定所有菌株均具fengycin合成酶編碼基因，序列比對結果表明，5株生防菌中的fen B基因與Bacillus subtilis fengycin合成酶基因(L42523.1)同源性分為98%、95.28%、95.34%、95.22%、95.22%。

針對抗菌物質Iturin，選擇其調控基因itu A(616 bp)作為合成酶的代表基因進行擴增。檢測結果如圖3所示。

注：M為DNA 標記 DL2000。泳道1～5分別為菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板為ddH2O。下同。Note: M is DNA marker DL2000. Lanes 1-5 are strains QHZ-1, QHZ-2, QHZ-3, QHZ-4, and QHZ-5, respectively. CK template is ddH2O. The same below.圖2 5株生防菌fen B功能基因的檢測分析結果Fig.2 Detection of functional genes of fen B from 5strains of biocontrol bacteria

圖3 5株生防菌itu A功能基因的檢測分析結果Fig.3 Detection of functional genes of itu A from 5strains of biocontrol bacteria

QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5菌株擴增得到目的片段大小的明亮條帶，QHZ-1、QHZ-2菌株中的itu A基因序列分別與B.atrophaeusUCMB-5137菌株的itu A基因(CP011802.1)同源性達到99%和97%，QHZ-3、QHZ-5與B.atrophaeus GQJK17菌株的itu A基因(CP022653.1)同源性達到99%。結合測序結果我們得知，QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-5具iturin合成酶編碼基因。

5株生防菌中，QHZ-3與QHZ-5擴增出與目的基因一致的明亮條帶(圖4)，測序結果與BacillussubtilisSurfactin合成酶基因(KC454625.1)同源性分別為97%和98%。因此， QHZ-3與QHZ-5具備Surfactin合成酶基因。

上述結果表明，5株生防菌中可檢測到表面活性素Surfactin、伊枯草菌素 Iturin A、豐原素 Fengycin等合成酶基因，因此，5株生防菌株可能通過產生脂肽抗生素抑制病原菌的生長。

2.3 生防菌QHZ-3發酵濾液的抑菌活性測定

上述結果表明在5株生防菌中，QHZ-3對馬鈴薯瘡痂病病原菌的拮抗效果最為顯著，且該菌株存在抑制植物病原菌的3種脂肽類抗生素合成相關基因，推測該菌株可能同時具有抑制細菌性與真菌性病原菌活性的作用，為驗證該菌株是否產生抑菌物質，我們測定其發酵濾液對病原菌的抑菌活性，見圖5。

注：M, DNA 標記 DL2000；泳道1-5分別為菌株QHZ-1、QHZ-2、QHZ-3、QHZ-4、QHZ-5，CK模板為ddH2O。Note: M, DNA marker DL2000; lanes 1-5 are strains QHZ-1, QHZ-2, QHZ-3, QHZ-4, and QHZ-5; CK template is ddH2O.圖4 5株生防菌srf AA 功能基因的檢測分析結果Fig.4 Detection of functional genes of srf AA from 5strains of biocontrol bacteria

圖5 菌株QHZ-3無菌濾液對馬鈴薯瘡痂病病原菌的抑制效果Fig.5 Inhibitory effect of QHZ-3 aseptic filtrateon potato scab pathogen

由圖5可見，QHZ-3的發酵濾液對馬鈴薯瘡痂病病原菌具有拮抗效果，抑菌圈直徑達到30.4 mm，表明QHZ-3可通過產生抗菌物質抑制病原菌。生防菌在實際施用時，由于光照、溫度、土壤酸堿度等條件的不同，會對生防菌的抑菌效果產生影響，故了解生防菌發酵液的抑菌穩定性可為生防菌在不同地區的應用提供理論依據。

2.4 菌株QHZ-3發酵液穩定性檢測

生防菌QHZ-3發酵濾液經不同溫度處理后的結果如圖6所示。菌株QHZ-3的發酵液分別在20、40、60、80℃的溫度條件下處理后，抑菌圈直徑仍保持在30 mm以上，在100℃處理30 min后，抑菌率略有下降，但仍保持了一定的抑菌活性，表現了良好的熱穩定性。

由圖7可見，菌株QHZ-3的發酵濾液分別經紫外線照射2、4、6、8 h后，抑菌率低于CK處理，但抑菌活性沒有完全喪失，且隨著處理時間的增加，抑菌率沒有明顯變化，說明菌株QHZ-3發酵液對紫外光照有著較好的穩定性。

注: 不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，下同。 Note: Different letters indicate that the difference between treatments is significant (P<0.05)，the same below.圖6 菌株QHZ-3發酵液在不同處理溫度下抗菌物的穩定性分析Fig.6 The stability analysis of antimicrobial substance infermentation broth of strain QHZ-3 at differenttreatment temperature

圖7 不同紫外光照射時間下菌株QHZ-3發酵液抗菌物的穩定性分析Fig.7 The stability analysis of antimicrobial substanceof strain QHZ-3 at different UV irradiation time

不同pH條件下菌株QHZ-3的無菌發酵濾液對瘡痂鏈霉菌的抑菌活性變化情況如圖8。結果顯示，在極酸和極堿的條件下，QHZ-3發酵液抑菌活性均一定程度的降低，但整體來看抑菌圈直徑保持在27 mm以上，抑菌率無明顯變化。

2.5 生防菌QHZ-3的發酵條件優化

以上結果可以看出QHZ-3及其無菌發酵濾液對病原菌有一定的抑制作用，且其代謝抑菌物質對紫外光線、不同酸堿度等均具一定的耐受性，可成為防治馬鈴薯瘡痂病生物有機肥開發的潛質菌源，為此對該菌株液態及固態發酵條件進行優化，以提高其產量。

2.5.1 裝液量對拮抗菌QHZ-3生長的影響 裝液量與轉速通過控制溶氧量來影響菌株生長[20]，裝液量對QHZ-3生長的影響見圖9。QHZ-3的生長量在一定裝液量范圍內隨裝液量的升高而增加，在60 mL生長狀態最佳。當裝液量超過80 mL時生長量極大程度下降，在裝液量為120 mL時活菌數僅達到3.6×107cfu·mL-1。

圖8 不同pH處理下菌株QHZ-3發酵液抗菌物的穩定性分析Fig.8 The stability analysis of antimicrobial substance ofstrain QHZ-3 treated with different pH

圖9 不同裝液量對QHZ-3菌株生長的影響Fig.9 Effects of different liquid loadings on thegrowth of strains QHZ-3

2.5.2 接種量對拮抗菌QHZ-3生長的影響 接種量指待接種的培養基與接種的種子液的體積百分比。接種量對菌株QHZ-3生長的影響如圖10所示，隨著接種量的增加，菌株的生長量呈現增加的趨勢，在接種量為6%與8%時生長量達到最大，均可達到1.3×109cfu·mL-1，當接種量為10%時，菌體生長受阻，生長量降低，活菌數為5.3×108 cfu·mL-1。

2.5.3 轉速對拮抗菌QHZ-3生長的影響 圖11為轉速對菌株QHZ-3生長的影響，隨著轉速的升高，菌株的生長量加大，在180 r·min-1時菌體生長量達到最大，活菌數為5.9×108cfu·mL-1。190 r·min-1后菌體生長量明顯減少，降低到2.94×108cfu·mL-1。

2.5.4 培養時間對拮抗菌QHZ-3生長的影響 發酵時間對QHZ-3生長的影響見圖12，在24～60 h內，菌體生長量與時間的增長呈正比，當時間增長到60 h時，菌體生長量最高，達到5.3×107cfu·mL-1。時間過久，菌體達到衰亡期，菌體生長量呈下降趨勢。

圖10 不同接種量對菌株QHZ-3生長的影響Fig.10 Effect of different inoculation amounton strain QHZ-3 growth

圖11 不同轉速對菌株QHZ-3生長的影響Fig.11 Effect of different rotational speedson strain QHZ-3 growth

2.5.5 液態條件的正交試驗優化 為了確定液態發酵的最佳條件，在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗考察4種因素對QHZ-3生長的影響，正交試驗因素水平表如表3所示。

根據上述單因素試驗結果，各因素對 QHZ-3菌株生物量都有影響，正交試驗的結果與分析見表4。

表4可見，影響菌株QHZ-3液態發酵的因素作用由大到小依次為搖床轉速>發酵時間>裝液量>接種量。結合各水平的最大K值，菌株QHZ-3的最佳液態發酵條件為裝液量40/250 mL三角瓶、搖床轉速170 r·min-1、接種量6%、發酵時間48 h，在此條件下，活菌數可達到1.31×1010cfu·mL-1。

表3 L9(34)正交試驗因素水平表

圖12 不同發酵時間對菌株生長的影響Fig.12 Effect of different fermentation time on strain growth

表4 L9(34)正交試驗結果

2.6 二次固體發酵接種量對QHZ-3生長的影響

二次固體發酵中接種量對QHZ-3生長的影響結果如圖13所示，在本試驗條件下，接種量增加至10%時，活菌數已達到1.02×109cfu·mL-1，繼續增加接種量至15%，菌體數量達到1.14×109cfu·mL-1，與10%的接種量無顯著差異，且過高的接種量會增加成本。因此，選擇10%作為種子液發酵最適接種量。

圖13 二次固體發酵不同接種量對菌株QHZ-3生長的影響Fig.13 Effect of different inoculation amounton strain QHZ-3 growth

3 討 論

在生防菌的不同拮抗機制中，產生抗菌物質是重要的方式。抑菌物質中表面活性素是最強的表面活性劑，有很強的殺細菌能力，而伊枯草菌素與豐原素則具備廣泛的抑制絲狀真菌和酵母生長的能力[21]，且這三者之間存在協同效應[22]。QHZ-3則具有編碼這3種抗生素合成酶的基因，結合對峙試驗的結果，我們認為萎縮芽孢桿菌QHZ-3為抑制馬鈴薯瘡痂病效果最佳的生防菌株，且其發酵濾液對瘡痂病原菌也具有抑制作用，代謝抑菌物質有較好的穩定性，推測抗菌脂肽物質的產生是其生防機制之一。

為了能夠將該生防菌更好地應用到田間農業生產上，培養條件的優化必不可少[23-25]。

本研究將QHZ-3菌株的生長量作為主要考量指標，從培養環境對菌株發酵條件進行優化。研究發現，在發酵條件優化中，接種量對QHZ-3的生長有著顯著的影響，過高的接種量會導致菌體之間黏性加大，產生過多的代謝廢物而阻礙生長[26]。轉速與裝液量都是溶氧量影響菌株生長的體現，裝液量或搖床轉速過高，菌體獲得的氧含量過低，阻礙菌體自生物質有氧降解，無法產出微生物正常生長所需要的能量。發酵時間對菌株生長的影響僅次于搖床轉速，發酵時間過短，細菌在培養基中生長緩慢，導致發酵周期延長。發酵時間過長，菌株活力下降，引起菌體自溶，導致發酵菌體總量降低。

生物有機肥的發酵通常采用液-固兩相的發酵方式進行，先通過液態發酵，快速培養大量高活力菌體，然后通過無菌輸送將高活力菌體接種到固態培養基進行發酵[27]，這個過程中適宜的接種量非常重要[28]。本試驗研究發現二次固體發酵中15%的接種量活菌數最高，但當接種量大于10%時，接種量對菌體數量的影響減少，且接種量過大會加速固態發酵培養基的消耗，使基質中溶氧不足或營養物質過度消耗，不利于菌落數的增加[29]。因此，考慮后期生物有機肥生產成本，選取10%為最佳接種量。

4 結 論

從供選的5株生防芽孢桿菌中，篩選出QHZ-3菌株，其對馬鈴薯瘡痂病的拮抗效果最明顯，能產生多種抗菌脂肽。針對QHZ-3菌株優化了其發酵條件，采用液-固兩相發酵，在最佳發酵工藝條件下，即液態發酵裝液量40 mL·250mL-1,搖床轉速170 r·min-1,接種量6%，發酵時間48 h；二次固態發酵接種量為15%時，生物有機肥中QHZ-3的活菌數可達1.14×109cfu·mL-1。