壬二酸凝膠的制備與質量控制

劉 丹 許 靜 李志平 何 皎 宮燦儀 韋 甫 夏筆軍

南方醫科大學皮膚病醫院，廣東廣州 510095

壬二酸為9碳直鏈二元酸，別名杜鵑花酸。壬二酸為無色至淡黃色晶體或粉末，熔點98～103℃，微溶于冷水，溶于熱水、乙醚，易溶于乙醇。壬二酸能直接抑制黑素細胞、抑制和殺滅細菌，具有抗炎、抑制細胞增殖等藥理作用[1-2]。目前，壬二酸凝膠在治療痤瘡、黃褐斑、酒糟鼻、色素過度沉著等方面得到了廣泛應用，該藥安全性好，局部應用未見明顯不良反應[3-4]，但起效劑量需大于10%（g/g）。由于壬二酸在水中的溶解度低，熔點高以及起效劑量大，易變色，使其應用受到很大限制。2003年國內藥廠中康恩貝生產的20%壬二酸乳膏上市，但目前批準文號尚未轉正，長期斷貨。目前，壬二酸臨床上使用的劑型有乳膏、霜、軟膏[5-9]。因壬二酸制劑的處方設計有一定難度，主要是高濃度壬二酸導致沙礫感或易引起破乳。在已報道的制劑中，壬二酸為不能完全溶解的細粉分散在基質中，這降低了壬二酸的生物利用度[10]。本研究發現加入非離子型增溶劑聚氧乙烯蓖麻油EL可改善壬二酸的溶解度，提高其在水中的溶解性。本研究研發了新型15%壬二酸凝膠外用制劑，壬二酸凝膠具有清爽、滲透性好、顯效快、作用持久等優點。該凝膠劑無沙礫感，無分層和破乳，質量穩定可控，安全、有效。本研究探討了一種加VIPER柱前管路高效液相色譜法直接測定壬二酸含量的方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

紫外分光光度儀（UV-2450，日本島津），高效液相色譜儀（LC-20A，日本島津），C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，Aquasil，Thermo），VIPER柱前管路（Thermo），十萬分之一電子天平（MS-105，梅特勒），光學顯微鏡（CX31，OLYMPUS），集菌儀（HTY-601型集菌儀，浙江泰林生物技術有限公司）。

1.2 試藥

壬二酸凝膠（15%，批號：20190320、20190324、20190326，南方醫科大學皮膚病制劑中心配制），壬二酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，101067-200901）；超純水，甲醇（Merck，色譜純），其余試劑均為分析純。

1.3 培養基

胰酪大豆胨瓊脂培養基（批號：181221），沙氏葡萄糖瓊脂培養基（批號：190115），胰酪大豆胨液體培養基（批號：181119），沙氏葡萄糖液體培養基（批號：190126），甘露醇氯化鈉瓊脂培養基（批號：180828），溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基（批號：180820），以上培養基均購于北京陸橋技術股份有限公司，經適用性檢查均符合規定。

1.4 菌株

銅綠假單胞菌（pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]，金黃色葡萄球菌（staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]，白色念珠菌（candida albicans）[CMCC（F）98001]，黑曲霉（aspergillus niger）[CMCC（F）98003]，枯草芽孢桿菌（bacillus subtilis）（ATCC6633）均購于廣東省藥品檢驗所。

2 處方與制備

2.1 處方

壬二酸150g，卡波姆940 12g，三乙醇胺12g，丙二醇120g，乙醇50g，聚氧乙烯蓖麻油EL 150g，EDTA-2Na 0.3g，純化水465.7g，共制1000g。

2.2 制備

2.2.1 增溶劑選擇的選擇 比較增溶劑吐溫80和聚氧乙烯蓖麻油EL的增溶效果，聚氧乙烯蓖麻油EL增溶效果優于吐溫80。所以，確定增溶劑為聚氧乙烯蓖麻油EL。考察處方中聚氧乙烯蓖麻油EL 10%、12%、15%三種含量的增溶作用，15%的聚氧乙烯蓖麻油EL能使壬二酸在水中完全溶解。所以，確定增溶劑聚氧乙烯蓖麻油EL的濃度為15%。

2.2.2 制備方法 卡波姆940用50℃水分散浸泡24h得A液；取壬二酸加丙二醇潤濕攪勻，加聚氧乙烯蓖麻油EL、EDTA-2Na、純化水，水浴加熱至65℃，加入乙醇得B液；將B液加入A液中，邊加邊攪拌，加三乙醇胺中和調節pH=6，攪拌至冷凝，即得。

3 質量控制研究

3.1 鑒別

液相色譜法，結果顯示，供試品溶液與對照品溶液主峰的保留時間相符，見圖1。

3.2 檢查

3.2.1 粒度 參照《中華人民共和國藥典》2015年版四部粒度和粒度分布測定法（通則0982第一法）測定[12]，均不得檢出大于180μm的粒子。結果顯示，粒子粒度均小于150μm。

3.2.2 微生物限度方法學驗證與檢查

3.2.2.1 微生物限度檢查方法學驗證 壬二酸凝膠微生物限度檢查驗證方法參照《中華人民共和國藥典》2015版和本實驗室的適用性實驗方法[11-12]，各菌株回收率結果見表1，控制菌驗證結果見表2。

表1 各菌株不同驗證方法的回收率

由表1可見，取1∶20的供試液，用平皿法時，金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3個菌株3次試驗的回收率均在0.5～2.0范圍內，因此本品的需氧菌總數可用平皿法檢查（即1∶20的供試液，1mL/皿）。取1∶10的供試液，用平皿法時，白色念珠菌和黑曲霉2個菌株3次的回收率均在0.5～2.0，表明本品的霉菌和酵母菌總數可用平皿法檢查（即1∶10供試液，1mL/皿）。

表2 控制菌驗證結果

由表2可見，本品可用常規法檢查金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌。

3.2.2.2 微生物限度檢查 供試液制備：取本品10g，先加少量5%（g/mL）聚山梨酯80的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，置45℃水浴使溶散，再加45℃含5%（g/mL）聚山梨酯80 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100mL，邊加邊搖，靜置1min，取下層液作為1∶10的供試液。取1∶10的供試液適量，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液稀釋制成1∶20的供試液。

需氧菌總數取1∶20的供試液1mL，按平皿法檢查。

霉菌和酵母菌總數取1∶10的供試液1mL，按平皿法檢查。

金黃色葡萄球、菌銅綠假單胞菌取1∶10的供試液10mL，分別接種至不少于100mL胰酪大豆胨液體培養基中，按控制菌檢查法試驗。

3.2.2.3 微生物限度檢查結果 三批壬二酸凝膠（批號：20190320、20190324、20190326）需氧菌總數、霉菌和酵母菌總數為0，未檢出金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌。

3.3 壬二酸含量測定方法學驗證與結果

3.3.1 色譜條件 色譜柱：Thermo AQUASIL C18柱（250mm×4.6mm，5μm），以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；柱溫：40℃。流動相：甲醇-水-磷酸（40∶60∶0.1），流速：1.0mL/min；檢測波長：210nm；進樣量：20μL。

3.3.2 溶液的制備

3.3.2.1 對照品溶液的制備 取壬二酸對照品，精密稱定，加甲醇適量，超聲使溶解，制成0.6mL/min的壬二酸對照品溶液。

3.3.2.2 供試品溶液的制備 精密稱定壬二酸凝膠0.2g，加甲醇適量置50mL容量瓶中，超聲使溶解，用甲醇定容，搖勻，冰浴1h，過濾，取續濾液，即得。

3.3.2.3 陰性對照液的制備 精密稱定壬二酸凝膠的陰性樣品0.2g，同“3.3.2.2”項方法制備陰性對照溶液。

3.3.3 方法學驗證

3.3.3.1 專屬性實驗 取供試品溶液、對照品溶液及陰性對照溶液按“3.3.1”項色譜項條件項分別測定，記錄色譜圖，觀察主要成分色譜峰的保留時間是否一致，各成分是否相互干擾。結果表明陰性樣品無干擾，理論板數為10 885，分離度18.2，拖尾因子1.02，方法的專屬性較好，見圖1。

圖1 三種溶液的HPLC圖

3.3.3.2 回收率實驗 取壬二酸對照品0.3g，精密稱定，至50mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解制成濃度為6mL/min的對照品溶液，作為壬二酸對照品母液。取空白基質0.20g，精密稱定，平行9份，分別精密加入對照品母液4、5、6mL，置50mL量瓶中，每個濃度各配制3份，同“3.3.2.2”項供試品溶液的制備方法制備，即得相當于標示量80%、100%、120%的樣品，計算回收率，見表3。

結果顯示，壬二酸平均回收率為99.4%，RSD為0.55%，說明該方法的準確度較好，符合定量測定要求。

3.3.3.3 定量限 精密稱定壬二酸對照品0.02g，置20mL容量瓶中，加流動相溶解并定容（濃度為1.000mL/min）。取上述溶液加甲醇逐級稀釋，測得壬二酸的定量限為0.525μg/mL（信噪比為10∶1）。

表3 回收率試驗結果（n=9）

3.3.3.4 線性關系考察 取壬二酸對照品0.2g，精密稱定，至20mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解成10.00mg/mL的對照品溶液，作為對照品母液。分別 精 密 量 取 對 照 品 母 液0.1、0.2、1.6、3.2、6.4mL至10mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成0.100、0.200、1.600、3.200、6.400mg/mL壬 二 酸 對 照 品 溶液，按“3.3.1”項色譜條件測定，以峰面積為縱坐標Y，以濃度為橫坐標X，進行線性回歸，得線性方程：Y=556 068.6X-24 893.91，r=0.9999，壬二酸在0.100～6.400mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

3.3.3.5 精密度實驗 精密吸取對照品溶液20μL，注入液相色譜儀，連續測定6次，記錄壬二酸的峰面積，結果峰面積積分值的RSD為0.39%，表明精密度良好。

3.3.3.6 重復性實驗 取壬二酸凝膠（批號：20180310）0.2g，精密稱定，平行6份，按“3.3.2.2”供試品溶液制備項的方法制備，按照“3.3.1”項色譜條件進樣，以峰面積計算壬二酸的含量，結果含量的平均值為15.4%（g/g），RSD為0.56%，表明本含量測定方法重復性良好。

3.3.3.7 穩定性實驗 按照“3.3.2”溶液制備項制備供試品溶液和對照品溶液，按照“3.3.1”項色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24h進樣，測定峰面積，計算含量，結果RSD為0.56%，表明供試品溶液在24h內穩定。

3.3.3.8 樣品含量測定 取3批壬二酸凝膠（批號：20190320、20190324、20190326）各3份，每 批 平行測定3次，測定峰面積，按外標法計算壬二酸的含量，結果3批樣品的含量分別為標示量的99.3%（RSD=0.48%）、100.2%（RSD=0.35%）、100.8%（RSD=0.52%）。

4 穩定性考察

4.1 離心試驗[13]

取樣品適量，裝入離心管中，以4000r/min轉速離心30min，結果顯示壬二酸凝膠無破乳、無分層現象。

4.2 耐寒耐熱試驗[13]

取樣品適量，分裝于包裝盒內加蓋，分別置-15℃冰箱24h，置55℃干燥箱恒溫6h，結果顯示壬二酸凝膠無破乳、無分層現象。

4.3 加速試驗

取3個批次樣品，在溫度為（30±2）℃，相對濕度為（65±5）%的條件下進行試驗，放置6個月。于試驗的第0、3、6個月末取樣一次，考察壬二酸凝膠的性狀、鑒別、檢查、含量，結果顯示樣品的各項質量指標均符合質量標準。

4.4 長期試驗

取3個批次樣品，在溫度為（25±2）℃，相對濕度為（60±10）%的條件下，放置12個月。于試驗的第0、3、6、9、12個月末取樣一次，考察壬二酸凝膠的性狀、鑒別、檢查、含量，結果顯示樣品的各項質量指標均符合質量標準。

5 討論

由于壬二酸在水中的溶解度低，熔點高以及起效劑量大，易變色，使其在應用時受到很大限制。增溶劑聚氧乙烯蓖麻油EL，穩定性好，安全[14]。所以，選用聚氧乙烯蓖麻油EL作為增溶劑。考察并篩選出了溶解壬二酸的最佳溫度65℃。壬二酸凝膠制備方法可行，穩定性良好。

壬二酸為直鏈二羧酸，臧亞茹[15]采用酸堿滴定法測定復方壬二酸乳膏中壬二酸的含量，有文獻報道[16-17]采用HPLC法檢測脂質體中壬二酸雜質，采用衍生化后HPLC法測定壬二酸的含量。本研究通過加VIPER柱前管路HPLC法直接測定壬二酸的含量，比較了不加柱前管路使用流動相甲醇-水-0.01mol/mL乙酸銨，甲醇-水-0.1%磷酸，色譜峰均前延，峰形不對稱，加VIPER柱前管路，峰型對稱，分離度＞1.5，所以通過加VIPER柱前管路測定含量。進一步比較不同流動相的理論塔板數，甲醇-水-0.1%磷酸的理論塔板數高于甲醇-水-0.01mol/mL乙酸銨。因此，確定流動相為甲醇-水-0.1%磷酸。

新劑型壬二酸凝膠質量穩定可控，制備和質量控制方法可行，重復性好，為開發壬二酸凝膠新制劑提供理論基礎。