肝靶向羥基喜樹堿PLGA納米微球的藥動學與組織分布研究

吳小祥 朱 娜 邢亞群▲

1.蚌埠醫學院第二附屬醫院藥劑科，安徽蚌埠 233030；2.中國醫學科學院北京協和醫學院生物醫學工程研究所，天津 300192

羥基喜樹堿（hydroxycamptothecin，HCPT）是從中國珙桐科植物喜樹中提取的一種吲哚類生物堿，能選擇性作用于拓撲異構酶Ⅰ發揮抗腫瘤作用，廣泛應用于肝癌、肺癌、宮頸癌、白血病等多種惡性腫瘤的治療[1-2]。然而羥基喜樹堿在水及有機溶劑中溶解性差，且內酯環結構不穩定降低了其的抗腫瘤活性。目前，現有的HCPT注射液在體內半衰期極短，需要頻繁給藥，故在臨床應用中受到了較大的限制[3-4]。因此，尋求一種能提高生物利用度、降低毒副作用的新制劑對腫瘤患者的治療有重要的現實意義。

聚乳酸/羥基乙酸共聚物[poly（lactic-coglycolic acid），PLGA]是一類具有良好生物相容性，無毒且無免疫原性的高分子材料；因其具有良好的成囊和成膜性能，可在體內生物降解為CO2和水，已被FDA批準用于醫用注射用微球、微囊、植入劑等制劑的輔料[5-7]。

本課題組探索了基于PLGA負載羥基喜樹堿的納米微球，考察體外釋放行為在大鼠體內的藥代動力學和組織分布特征，旨在制備出具有長效緩釋、生物利用度高、副作用低的新型制劑，為HCPTPLGA納米微球應用于臨床腫瘤靶向治療提供新的實驗參考和理論依據。

1 實驗材料

1.1 儀器

Alliance高效液相色譜系統，包括2695型高效液相色譜儀、2998型二極管陣列檢測器和Empower3工作站等（美國Waters公司）；掃描電鏡（JSM-T330A，日本）；激光粒度分析儀（Zetasizer，英國Malvern公司）；G285型電子分析天平（瑞士梅特勒托利多公司）；Thermo ST16R（美國賽默飛世爾科技有限公司）；KQ2200DE型數控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

HCPT（純度＞98%，上海摩楷生物科技有限公司）；HCPT對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100532-200401，純度＞98%）；HCPT-PLGA（自制，生產批號：190405）；聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA，MW=50 000，LA∶GA=50∶50，濟南岱罡）；聚乙烯醇（PVA，分子量30 000～70 000，Sigma公司）；吐溫80（國藥集團）；乙腈為色譜純；水為Millipore超純水；其余試劑均為分析純。

1.3 動物

健康SD雄性大鼠，體重200～240g，由蚌埠醫學院實驗動物中心提供。

2 方法與結果

2.1 HCPT-PLGA納米微球的制備

W1/O/W2型乳化-溶劑揮發法制備HPTCPLGA納米微球。首先在一定量的PLGA二氯甲烷溶液（O）中加入規定量的HCPT溶液（W1），冰浴下超聲乳化制得初乳；將初乳液迅速滴加入10mL 3%的PVA溶液（W2）中，1000rpm，磁力攪拌2min成復乳；復乳液加入去離子水30mL，500rpm磁力攪拌過夜，使二氯甲烷完全揮發；將混合液于10 000r/min轉速下冷凍離心5min，除去未包裹的HCPT等雜質，去離子水洗滌3次，冷凍干燥后4℃保存。

采用激光粒度儀測定HCPT-PLGA納米微球的粒徑分布和Zeta電位。取適量HCPT-PLGA用蒸餾水分散均勻，在石英皿中加入20μL溶液，并用蒸餾水滴加至標記線，結果見圖1A。可見，HCPT-PLGA的粒徑分布較為均勻，平均粒徑為（237.2±2.15）nm，分散指數（PDI）為0.29，Zeta電位為-（34.0±1.1）mV，表明納米粒具有良好的分散性和穩定性。在掃描電鏡下觀察形態，可見粒子均勻性較好，呈較規則的球形，見圖1B。

圖1 HCPT-PLGA納米微球的粒徑分布及掃描電鏡圖

2.2 色譜條件

采用HPLC法測定HCPT含量，色譜條件為Kromasil C18柱（5μm，4.6mm×250mm）；流動相:乙腈-水（含0.05%甲酸）=25∶75；流速：1.0mL/min；紫外檢測器，檢測波長：254nm；柱溫：30℃；進樣量為20μL。

2.3 體外釋放動力學

采用動態透析袋法（MWCO=8000）考察載藥HCPT-PLGA在含1%吐溫80生理鹽水中的釋藥情況。分別精密吸取2.0mL HCPT-PLGA溶液以及等量濃度的HCPT溶液，置于透析袋內，每組平行3份，將袋口扎緊后浸入釋放介質中。在37℃，100r/min條件下攪拌，且隔一定時間取樣1.0mL，并補充等量新鮮介質。樣品經0.45μm微孔濾膜后高效液相進樣，得藥物濃度。由圖2可知，游離HCPT在開始階段迅速釋放進入介質中，8h時累積釋放率接近80%，此后藥物的釋放趨于平緩，至12h時幾乎釋放完全；而載HCPT的PLGA納米微球的釋放明顯緩慢，前12h內藥物累積釋放率為55%，12h后載藥納米微球中HCPT的釋放呈現緩慢上升，72h時累積釋放率為79%。

圖2 HCPT與HCPT-PLGA體外釋藥曲線

2.4 樣品處理方法

血樣：大鼠眼眥靜脈叢采血0.5mL，置于含有肝素的離心管中，10 000r/min離心15min，精密吸取血漿100μL，渦旋混合均勻，精密吸取200μL乙腈沉淀蛋白，充分渦旋混合，于10 000r/min離心15min，取上清液進樣分析（或4℃冰箱備用）。

組織樣品：分別取大鼠心、肝、脾、肺、腎、直腸組織，稱重后按照1∶3的比例加入生理鹽水，于高速勻漿器上制成組織勻漿，10 000r/min離心15min。取上清200μL，以400μL的乙腈沉淀蛋白，10 000r/min再次離心15min，取勻漿上清液進樣分析（或4℃冰箱備用）。

2.5 方法學考察

2.5.1 系統適用性實驗 在選定的色譜條件下，HCPT-PLGA中的其他成分和血漿組織樣品中的內源性成分不干擾HCPT的測定，具體見圖3，其中HCPT出峰時間在10.5min左右。

圖3 高效液相色譜圖（A為HCPT溶液；B為空白血漿；C為血漿樣品+HCPT）

2.5.2 線性關系考察 精密稱取HCPT對照品2.4mg，置于25mL量瓶中，加甲醇溶解定容，得到HCPT儲備液。分別取空白血漿或空白組織勻漿100μL，加入適量HCPT溶液，得質量濃度分別為0.075、0.15、0.75、1.50、6.00、24.00、48.00μg/mL的HCPT標準液。以峰面積（A）為縱坐標（Y），HCPT濃度（C）為橫坐標（X）進行回歸，HCPT標準溶液在0.075～48.000μg/mL范圍內線性良好，標準曲線為：Y=43.02X-0.8741，r=0.9996。結果表明，血漿樣品及各組織樣品在0.075～48.00μg/mL濃度范圍內呈良好的線性關系，定量限為0.075μg/mL。

2.5.3 提取回收率與精密度測定 精密量取HCPT質量濃度分別為0.15、1.5、24.0μg/mL的溶液，20μL進樣后記錄峰面積為A1。另取空白血漿或空白組織勻漿100μL，加入上述不同濃度的HCPT，按“2.4”項下方法進行處理，20μL進樣后記錄峰面積為A2，每個質量濃度測定3次。以A2/A1計算回收率。精密量取空白血漿100μL共3份，分別精密加入低（0.15μg/mL）、中（1.50μg/mL）、高（24.00μg/mL）3種濃度的藥物標準溶液20μL，按照樣品處理方法進行處理，每天分別進樣5次，考察日內精密度。1周內連續測定3d，考察日間精密度，記錄色譜圖及峰面積。結果顯示，各濃度樣品的平均回收率為（76.39±0.39）%～（89.75±0.272）%，RSD為0.89%～7.63%。日內、日間RSD均＜10%。

2.6 大鼠體內藥代動力學實驗

取SD大鼠，在實驗前禁食12h，自由飲水。每只大鼠尾靜脈注射劑量8mg/kg，分別于給藥后5、15、30、45、60、90、120、240、360、480min自大鼠眼眥靜脈叢用毛細管穿刺取血0.5mL，按“2.4”項下樣品處理方法進行。

經DAS2.1.1藥代動力學軟件處理數據，分析均通過SPSS19.0統計學軟件完成，組間比較采用t檢驗，P＜0.05與P＜0.01為差異有統計學意義。主要藥代動力學參數見表1，血藥質量濃度-時間曲線圖見圖4。HCPT溶液在90min左右在體內基本代謝；HCPT-PLGA在480min左右基本代謝。由表1可知，大鼠靜脈注射HCPT溶液以及HCPTPLGA體內過程均符合二室模型，清除率CL減小至0.037μg/（mL·min），說明HCPT-PLGA具有更長的釋藥時間。HCPT-PLGA的曲線下面積AUC0-t約為HCPT的1.9倍，MRT0-∞約為HCPT的1.6倍，表明HCPT-PLGA在體內停留時間較長，半衰期較長，能有效改善藥物在體內迅速消除的缺點。

圖4 HCPT與HCPT-PLGA給藥后的血藥-時間曲線

表1 大鼠尾靜脈注射普通HCPT與HCPT-PLGA后的主要藥代動力學參數（±s，n=5）

表1 大鼠尾靜脈注射普通HCPT與HCPT-PLGA后的主要藥代動力學參數（±s，n=5）

注：與HCPT方案比較，*P＜0.05，**P＜0.01

參數 HCPT方案 HCPT-PLGA V（mL/μg） 0.33±0.04 0.39±0.02 AUC0-t[μg/（mL·min）] 206.39±12.37 397.02±16.76**AUC0-∞[μg/（mL·min）] 318.07±3.06 506.98±5.41*CL（mL） 0.045±0.003 0.037±0.002 K10（min） 0.147±0.051 0.083±0.006*K12（min） 0.069±0.008 0.051±0.024 K21（min） 0.075±0.013 0.071±0.040 MRT0-t（min） 9.66±0.89 31.12±1.57**

2.7 大鼠體內組織分布實驗

分別于給藥后5、15、30、45、60、90、120、240、360、480min時間點取心、肝、脾、肺、腎、直腸組織，在有冰塊的泡沫盒中勻漿，冷藏靜置0.5h，按“2.4”項下方法進行處理樣品與“2.2”項下色譜條件下方法進行分析。

圖5 HCPT溶液與HCPT-PLGA給藥后在心、肝、脾、肺、腎、直腸組織中的濃度（±s，n=5）

采用直方圖直觀的比較大鼠尾靜脈給藥后HCPT兩種制劑在不同時間點和不同組織中的動態分布情況，見圖5。結果表明，HCPT-PLGA在肝部濃集并滯留較長時間。在120min時，HCPT-PLGA藥物濃度的分布順序為肝＞肺＞直腸＞腎＞脾＞心，240min時肝臟中的藥物濃度有下降趨勢，但仍維持在較高濃度，說明藥物能快速到達肝臟并長時間保留。在15min時，HCPT溶液藥物濃度的分布順序為肺＞肝＞直腸＞腎＞脾＞心，雖然給藥可以迅速達到較高濃度，但45min后藥物濃度顯著下降，表明藥物雖能快速到達肺部和肝部，但保留時間較短。

2.8 靶向性評價

本實驗以相對攝取率（Re）及峰濃度比（Ce）作為評價參數考察普通HCPT和HCPT-PLGA的靶 向 性。其 中Re=AUCHCPT-PLGA/AUCHCPT；Ce=CmaxHCPT-PLGA/CmaxHCPT。結果由表2可知，HCPT-PLGA在肝內的Ce及Re值分別為HCPT的2.94倍及5.51倍。HCPT-PLGA延長了HCPT在肝部的滯留時間，提高了靶向療效。HCPT-PLGA在肝臟表現出明顯的靶向性（Ce和Re分別為27.45和23.40）。

表2 HCPT與HCPT-PLGA在體內的靶向性評價結果

3 討論

采用改良的W1/O/W2復乳法[8]制備得HPTCPLGA納米微球的粒徑為（237.2±2.15）nm，分散指數為0.29，其粒徑大小符合2015版《中華人民共和國藥典》靜脈注射制劑的要求。Zeta電位的絕對值大于30mV，表明粒子間存在較大的排斥力，有利于納米溶液的穩定性并促使粒徑大小均一[9]。HPTCPLGA納米微球較大的電位絕對值預示其具備較好的物理穩定性。

參考相關文獻[10]，采用動態透析袋法考察HCPT-PLGA納米微球的體外釋藥特性，結果表明HCPT-PLGA納米微球能延緩HCPT的釋放，具有長效緩釋作用。由于HCPT不溶于水，在體外釋放實驗中選用生理鹽水作為溶出介質時，幾乎檢測不到藥物。另外，如果選擇40%乙醇作為釋放介質時，溶解迅速但制劑極不穩定。通過查詢文獻[11]，當選用含0.02%（w/v）吐溫80的PBS（pH 7.4）作為HCPT制劑的體外釋放介質時，HCPT溶解性及穩定性都會相應提高。綜合以上特征，本研究選用了含1%吐溫80的生理鹽水為HCPT-PLGA納米微球的釋放介質，結果證實此條件既能達到滿足漏槽條件，又有效提高了藥物的穩定性。

目前，臨床對腫瘤的治療多以羥基喜樹堿鈉鹽注射液進行靜脈注射給藥，藥物分布半衰期為4.23min，消除半衰期小于30min。相關動物實驗研究結果表明，羥基喜樹堿鈉鹽注射液在體內快速分布及消除，大鼠尾靜脈注射2h后即檢測不到血藥濃度[12]。本研究中，普通HCPT溶液在給藥后迅速進入體循環，90min基本代謝完全，與文獻報道相符[13-15]。HCPT-PLGA納米微球在血漿中藥物濃度可維持8h以上，顯著延長了藥物在體內的作用時間。通過Ce和Re指標的靶向評價結果看出，HCPT-PLGA與普通HCPT溶液對各組織均有一定的靶向性，但是HCPT-PLGA在心、肝、脾、肺、腎、直腸中的質量濃度均顯著高于普通HCPT溶液，HCPT-PLGA在大鼠肝與肺的Ce和Re值最大，在肝臟中停留時間最長。血藥質量濃度-時間曲線和主要藥代動力學參數均表明，HCPT-PLGA可明顯提高HCPT在體內的生物利用度，表現出的緩釋長效作用與體外釋放動力學考察結果一致。針對HCPT-PLGA納米微球明顯的肝靶向性，猜測原因可能與肝臟中富含單核巨噬細胞吞噬系統（mononuclear phygocyte system，MPS），使納米粒易被其捕獲所致有關[16-18]。

近年來對HCPT新劑型的研究仍然處于實驗階段，研究者試圖通過各種方法提高HCPT給藥后的生物利用度[12,19-21]。本課題組提供的載HCPT的PLGA納米微球可增加藥物的體外釋藥量，改善體外釋放行為，在體外環境下表現出良好的藥物緩釋性能以及肝靶向特征，可以明顯提高HCPT的生物利用度。大鼠體內實驗證明HCPT-PLGA納米微球的肝靶向作用增強，為提高臨床肝靶向治療效果提供了另一種可能。在后續實驗中將繼續優化制備工藝，提高HCPT的包封率和載藥量，并進行腫瘤細胞實驗的考察，探索其抗腫瘤作用，以期為臨床HCPT新劑型的引入及應用提供新的理論基礎。