懷菊花及其莖葉脂溶性成分GC-MS分析及其抗氧化活性研究

李 孟 張靖柯 石靜亞 湯迎迎 孫彥君

1.河南中醫(yī)藥大學藥學院，河南鄭州 450046；2.呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協同創(chuàng)新中心，河南鄭州 450046

菊花（Chrysanthemum morifolium Ramat.）為菊科植物菊的干燥頭狀花序，始載于《神農本草經》，列為上品。其味甘、苦，性微寒，主歸肺、肝經，具有疏散風熱、平肝明目、清熱解毒的功效[1-2]。菊花作為我國傳統(tǒng)的一味中藥材，種類繁多，分布廣泛，具有很高的藥用價值。菊花在藥用和保健方面都有很好的效果，是我國衛(wèi)生部發(fā)布的第一批藥食兩用藥材。目前國內對菊花的應用研究較多，對菊花莖葉的綜合利用研究相關報道較少，大量菊花莖葉因其藥用保健價值未能充分開發(fā)利用而遭丟棄。

2015版《中華人民共和國藥典》新增“懷菊花”這一品種，與“亳菊”“滁菊”“貢菊”“杭菊”共同作為“菊花”入藥，肯定了懷菊的藥用地位。文獻研究表明，懷菊花及其莖葉均含有以單萜類和倍半萜類及其含氧衍生物為主的揮發(fā)油類成分、黃酮類成分等[3-4]。為了全面探究懷菊花及其莖葉的化學成分，本研究采用索氏提取法提取其脂溶性成分，并運用氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）法對其脂溶性成分組成進行鑒定分析，同時采用清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基能力的方法測定其脂溶性成分的抗氧化活性，以期為懷菊花整株資源的綜合有效利用提供科學依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent7890/7000B三重串聯四級桿氣質聯用儀（美國安捷倫公司）；BT-25S型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；AB204-N型萬分之一電子天平（德國梅特勒公司）；索氏提取器（南京金正玻璃儀器廠）；調溫試電熱套（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；N1100VWD型旋轉蒸發(fā)器（上海愛朗儀器有限公司）。分析純石油醚（沸程60～90℃）、甲醇、正己烷無水硫酸鈉、三氟化硼均為分析純。

1.2 材料

菊花及其莖葉采自河南焦作，經河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的花和莖葉，晾干，待用。

2 方法

2.1 樣品制備

取1.2項下的樣品，粉碎成粗粉備用。稱取各樣品10g，以石油醚為溶劑，80℃索氏提取6h，提取液減壓濃縮，得提取物，菊花為淺黃色油狀物，菊花莖葉為淺綠色油狀提取物。加入0.5mol/L氫氧化鉀甲醇溶液，60℃恒溫水浴30min，冷卻后加入三氟化硼甲醇溶液5mL，于60℃水浴，加熱回流5min，冷卻，加正己烷和飽和氯化鈉水溶液各2mL，取上清液加無水Na2SO4干燥，取樣分析。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 氣相色譜條件 色譜柱為HP-FFAP型石英毛細管柱（30mm×0.25mm，0.25μm），載氣為高純氦氣（99.999%），氦氣流速1.0mL/min；進樣口溫度為240℃；分流；升溫程序為80℃保持2min，按10℃/min升溫至190℃，保持2min，以2℃/min升溫至230℃，保持15min，氣化室溫度為280℃，接口溫度為240℃。

2.2.2 質譜條件 離子源：電子轟擊源，電子能量70eV；掃描范圍m/z30～600AMU，離子源溫度230℃，溶劑延遲：4.5min，GC-MS接口溫度240℃。

2.3 數據處理

用NIST98系統(tǒng)譜庫自動檢索組分的質譜，結合有關文獻，分別與八峰索引、EPA/NIH相對照，匹配度均在80%以上。化合物的定量使用HewlettPackard軟件按峰面積歸一化法計算相對含量[5]。

2.4 DPPH法測定抗氧化能力

采用清除自由基的方法測定脂溶性成分的抗氧化能力[6]：DPPH自由基清除活性測定采用96孔板法，不同濃度的樣品液及維生素C各取100μL放置于96孔板中，再添加100μL DPPH自由基溶液，在室溫中反應30min后采用酶標儀測定其在517nm處的吸光度值。清除率的計算公式為：

清除率=[（A0-Ai）/A0]×100%

其中，A0表示空白組吸光度，Ai為樣品組的吸光度，所有測定操作重復3次，取平均值。

3 結果

3.1 懷菊花及其莖葉脂溶性成分種類比較分析

依照上述條件對懷菊花及其莖葉的脂溶性成分進行分析，得出的總離子流圖見圖1，其脂溶性成分分析結果見表1。從懷菊花和懷菊莖葉中共鑒定出69個脂溶性成分，其中懷菊花鑒定出56個成分，檢出成分相對含量占91.19%；懷菊莖葉鑒定出37個成分，檢出成分相對含量占85.10%。

懷菊花的脂溶性成分主要有脂肪酸類（45.70%）、烷烴類（24.10%）、萜類（15.41%）以及少量的醇類、醛類、酮類等，主要成分（相對含量＞5.00%）有棕櫚酸甲酯（10.41%）、肉豆蔻酸甲酯（7.85%）、二十一烷（9.32%）、二十五烷（6.66%）、亞油酸甲酯（6.57%）；懷菊莖葉的脂溶性成分主要是脂肪酸類成分（76.87%）以及少量的萜類等，其中不飽和脂肪酸占懷菊莖葉脂溶性成分的44.15%，飽和

脂肪酸占懷菊莖葉脂溶性成分的32.72%，主要成分（相對含量＞5%）為亞麻酸甲酯（29.16%）、棕櫚酸甲酯（18.47%）和亞油酸甲酯（11.68%）。由此看出，懷菊花和其莖葉的脂溶性成分差異較大。而懷菊花和莖葉的脂溶性成分，共有峰是24個，分別占其相對含量的50.56%和81.78%，說明其脂溶性成分同時也具有一定的相似性。

表1 懷菊花及其莖葉脂溶性成分GC-MS分析

續(xù)表

表2 懷菊花及其莖葉脂溶性成分對DPPH自由基清除能力（%）

3.2 懷菊花及其莖葉脂溶性成分抗氧化活性研究

清除DPPH自由基能力的試驗結果提示，懷菊花和莖葉脂溶性成分對DPPH有一定的清除作用，且隨著濃度的增加，清除率也隨之上升，有明顯的量效關系，見表2，其對DPPH自由基的半數清除率IC50分別為9.76mg/mL和7.96mg/mL。

從懷菊花和懷菊莖葉中，共鑒定出69個脂溶性成分，共有成分24種，懷菊花的脂溶性成分主要為脂肪酸類、烷烴類和萜類，懷菊莖葉主要是脂肪酸類。活性結果提示，其脂溶性成分具有一定的抗氧化活性。

4 討論

菊花始載于《神農本草經》，列為上品，具有疏散風熱、平肝明目、清熱解毒的功效。現代藥理學研究表明，菊花具有改善心肌營養(yǎng)、去除活性氧自由基、加強毛細血管的抵抗力、降低血液中脂肪和膽固醇的含量、抑制腫瘤、延緩衰老及增強人體免疫力等功效。懷菊花作為“四大懷藥”之一，主產于河南武陟、溫縣地區(qū)，種植的歷史較悠久，為河南道地藥材[7]。課題組前期對懷菊花的化學成分進行了研究，從中得到了一系列愈創(chuàng)木烷型倍半萜內酯類、黃酮類、糖苷類等化合物[8-10]，劉曉薇等[11]對懷菊花的揮發(fā)性成分進行研究，發(fā)現懷菊花中的揮發(fā)性成分主要為單萜類和倍半萜類及其含氧衍生物。目前對菊花莖葉化學成分的研究主要集中在揮發(fā)油[12]、黃酮類、酚酸類及多糖類成分等方面，研究和開發(fā)利用相對較少，其資源的處置多為棄去或做飼料用，造成環(huán)境污染和資源浪費。

本研究采用GC-MS對懷菊花和其莖葉的脂溶性成分進行分析，從懷菊花和懷菊莖葉中共鑒定出69個脂溶性成分，懷菊花鑒定出56個，懷菊莖葉鑒定出37個，共有成分24個，分別占其相對含量的50.56%和81.78%。懷菊花的主要成分是棕櫚酸、肉豆蔻酸、二十一烷、二十五烷、亞油酸等；懷菊莖葉的主要成分是亞麻酸（29.16%）、棕櫚酸（18.47%）、亞油酸（11.68%）等。亞麻酸作為人體必需脂肪酸，只能通過食物攝取，是合成前列腺素的前體，參與脂肪代謝，與視力、腦發(fā)育和行為發(fā)育有關；棕櫚油酸對肥胖癥、糖尿病和脂肪肝等具有一定的療效，且對傷口發(fā)炎具有抑制效果以及改善皮膚光滑度等[13]；亞油酸是人體自身不能合成但必需的不飽和脂肪酸，具有降低血脂、防止動脈粥樣硬化及預防脂肪肝、抑制血栓形成的功效[14]。另外，懷菊花中鑒定出單萜和倍半萜類化合物20余種（15.41%）、烷烴類7個（24.1%），這是與懷菊莖葉的主要差異成分，說明兩者的脂溶性成分具有一定的差異性。

劉東順等[15]對菊花、葉、莖的水提物和醇提物抗氧化活性的研究表明，菊花、葉和莖提取物均有較強的抗氧化活性，菊葉抗氧化作用與菊花相當。本研究采用DPPH法測定懷菊花和莖葉脂溶性成分的抗氧化能力，結果提示，懷菊花和莖葉的脂溶性成分均具有抗氧化活性。本研究從化學成分的角度，進一步說明懷菊莖葉作為天然抗氧化劑有較好的開發(fā)利用價值，為懷菊資源的充分利用提供科學依據。