微柱凝膠技術(shù)在新生兒溶血病檢測(cè)中的應(yīng)用

曾 志 方 樂(lè) 賴(lài)婷婷 郭 梅 涂彩瓊

1.福建省龍巖人民醫(yī)院輸血科，福建龍巖 364000；2.兵器工業(yè)五二一醫(yī)院，陜西西安 710065

新生兒溶血病（hemolytic disease of the newborn，HDN）作為新生兒常見(jiàn)疾病之一，對(duì)于嬰兒的健康具有重要的影響，若不能及時(shí)進(jìn)行有效干預(yù)，則有可能導(dǎo)致新生兒神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)損傷，從而誘發(fā)膽紅素腦病，最終造成新生兒生活質(zhì)量的顯著降低，不利于我國(guó)人民群眾健康水平的有效控制。醫(yī)務(wù)人員應(yīng)提升血液檢測(cè)技術(shù)水平，從而確保HDN的及時(shí)發(fā)現(xiàn)與治療[1]。HDN傳統(tǒng)的檢測(cè)方法是采用試管檢測(cè)法對(duì)新生兒血液進(jìn)行檢驗(yàn)，然而該方法檢測(cè)步驟相對(duì)繁瑣，檢測(cè)流程耗時(shí)較長(zhǎng)。同時(shí)，此方法在檢測(cè)過(guò)程中受到的影響因素相對(duì)較多，無(wú)法保障檢測(cè)工作的準(zhǔn)確性。為了解決這一問(wèn)題，本研究擬應(yīng)用微柱凝膠技術(shù)對(duì)HDN患兒血液標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)，與傳統(tǒng)檢測(cè)法比較分析微柱凝膠技術(shù)在HDN檢測(cè)中的應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1～12月龍巖人民醫(yī)院收治的1766例HDN患兒作為研究對(duì)象，所有患兒均存在不同程度高膽紅素血癥，間接膽紅素（IBILI）水平208～250μmol/L，平 均（229.37±18.35）μmol/L；血清總膽紅素（TBILI）水平250～291μmol/L，平均（269.21±16.74）μmol/L；其中男984例，女782例；患兒年齡7h～5d，平均（2.1±0.1）d。本研究獲醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有入選患兒均符合《新生兒高膽紅素血癥診斷和治療專(zhuān)家共識(shí)》中的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]；（2）所有患兒生命體征平穩(wěn)，意識(shí)清醒；（3）患兒家屬知曉本研究?jī)?nèi)容，并簽署知情同意書(shū)者。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并先天性疾病者；（2）具有嚴(yán)重心、肝、腎等重要器官功能不全者；（3）合并感染性疾病者。

1.3 儀器與試劑

戴安娜全自動(dòng)血型儀，大容量低速離心機(jī)KDC-1044L（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司），新生兒ABO凝膠卡（戴安娜公司生產(chǎn)，DG GEL Newborn凝膠卡），抗人球蛋白卡（戴安娜公司生產(chǎn)，DG Gel Coombs卡），標(biāo)準(zhǔn)A、B、O型紅細(xì)胞試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限公司），抗人球蛋白試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限公司）。

1.4 方法

1.4.1 微柱凝膠技術(shù) 主要檢測(cè)步驟如下。采集患兒靜脈EDTA抗凝血樣2mL，3500rpm離心5min，分離血漿，將紅細(xì)胞通過(guò)三洗紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞懸液的制備，制備完成后，將其加入DG GEL Newborn凝膠卡（DIANA）中并進(jìn)行離心，同時(shí)對(duì)患兒樣本中血型及直接抗人球蛋白試驗(yàn)進(jìn)行觀察與記錄。檢測(cè)完畢后，將患兒血清與紅細(xì)胞放散液分別加入標(biāo)注A、B、O孔的抗人球凝膠卡（DIANA）中，隨后將標(biāo)準(zhǔn)A、B、O型紅細(xì)胞試劑對(duì)應(yīng)滴入抗人球凝膠卡中（紅細(xì)胞濃度用生理鹽水稀釋至1%左右），從而對(duì)患兒抗體放散與抗體游離情況進(jìn)行分析與記錄。

1.4.2 傳統(tǒng)試管檢測(cè)技術(shù) 主要檢測(cè)方法如下。采用離心設(shè)備對(duì)患兒血液樣本進(jìn)行離心處理，同時(shí)通過(guò)0.85/0.9%氯化鈉溶液對(duì)患兒血液樣本中紅細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)的清洗，以便實(shí)現(xiàn)懸液的有效配制。將制得的紅細(xì)胞懸液與抗人球蛋白試劑加入到同一支試管中，兩者的用量分別為1滴和2滴，隨后對(duì)試管內(nèi)試劑進(jìn)行離心處理，記錄抗人球蛋白的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。對(duì)相關(guān)試管進(jìn)行標(biāo)記，隨后向試管中加入紅細(xì)胞試劑，然后加入上述離心處理后得到的患兒血清，完成后將試管在37℃的環(huán)境下進(jìn)行靜置孵育，孵育時(shí)間為1h。培養(yǎng)完畢后，使用氯化鈉溶液對(duì)試管進(jìn)行清洗處理，清洗完畢后加入抗人球蛋白試劑并進(jìn)行離心，離心結(jié)束后，由檢測(cè)人員對(duì)患兒抗體游離與抗體放散結(jié)果進(jìn)行分析與記錄。

1.5 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

本研究中，研究人員將患兒血液樣本中抗體游離、抗體放散及直接抗人球蛋白的陽(yáng)性檢出率作為主要觀察指標(biāo)。新生兒溶血診斷標(biāo)準(zhǔn)：3項(xiàng)試驗(yàn)同為陽(yáng)性可確診，不同時(shí)為陽(yáng)性時(shí)，以放散試驗(yàn)陽(yáng)性為診斷標(biāo)準(zhǔn)，抗體游離和直接抗人球蛋白同時(shí)為陽(yáng)性時(shí)可確診，抗體游離或直接抗人球蛋白單項(xiàng)為陽(yáng)性時(shí)為疑似。在微柱凝膠中，患兒紅細(xì)胞抗原和抗體生產(chǎn)的復(fù)合物若分布在凝膠中或浮于凝膠表層，則判定其為陽(yáng)性，若紅細(xì)胞在凝膠管底部沉積或無(wú)特異性復(fù)合物生成則判定其為陰性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS23.0對(duì)相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血型血清學(xué)檢測(cè)

1766例疑似新生兒溶血患兒中，母親血型均為O型RhD陽(yáng)性，疑似患兒A型血有891例，確診178例，B型疑似患兒803例，確診151例，O型血疑似患兒62例，確診0例，AB型疑似患兒10例，確診0例，總共確診病例329例，見(jiàn)表1。

表1 1766例疑似新生兒溶血患兒血型血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

2.2 三項(xiàng)試驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果

直接抗人球蛋白、抗體游離試驗(yàn)和抗體放散試驗(yàn)對(duì)1766例疑似新生兒溶血患兒標(biāo)本檢驗(yàn)結(jié)果的分布及對(duì)結(jié)果的判斷，見(jiàn)表2。

2.3 兩種檢測(cè)方法比較

微柱凝膠技術(shù)抗體游離、抗體放散及直接抗人球蛋白的陽(yáng)性檢出率均高于傳統(tǒng)試管技術(shù)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

3 討論

新生兒溶血病（HDN）主要是由于胎兒在遺傳過(guò)程中從父親的基因中繼承了部分母親體內(nèi)不具有的紅細(xì)胞抗原，或母親與嬰兒血型不合所導(dǎo)致[3]。當(dāng)胎兒紅細(xì)胞通過(guò)臍帶進(jìn)入母親體內(nèi)后，母體中出現(xiàn)相應(yīng)的免疫性抗體，此類(lèi)抗體可經(jīng)過(guò)臍帶或胎盤(pán)對(duì)胎兒紅細(xì)胞造成影響，從而導(dǎo)致胎兒出現(xiàn)水腫、黃疽、肝臟腫大以及貧血等不良情況，甚至可導(dǎo)致胎兒死亡，嚴(yán)重威脅新生兒健康[4]。為了保障胎兒健康，醫(yī)務(wù)人員應(yīng)積極做好新生兒溶血病的早期診斷工作，確保新生兒?jiǎn)栴}的及時(shí)發(fā)現(xiàn)與合理干預(yù)，從而降低患兒后遺癥與不良情況的發(fā)生[5]。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，現(xiàn)階段在已知的血型系統(tǒng)中，最常見(jiàn)的HDN為ABO血型不合，多見(jiàn)于母體血液為O型，而新生兒血型為A型或B型[6]。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，由于ABO血型不合而造成的新生兒溶血病患兒約占該病患兒總數(shù)的50%以上[7]。

表2 對(duì)1766標(biāo)本三項(xiàng)試驗(yàn)檢驗(yàn)結(jié)果分布及結(jié)果判斷

表3 患兒陽(yáng)性檢出率情況[n（%）]

臨床上長(zhǎng)期以來(lái)主要采用試管檢測(cè)的方式對(duì)新生兒溶血病進(jìn)行檢測(cè)，然而該方法在檢測(cè)過(guò)程中需要對(duì)患兒血液樣本中紅細(xì)胞進(jìn)行反復(fù)清洗，且涉及的檢測(cè)步驟較為繁瑣，檢測(cè)過(guò)程中容易受到人為因素的影響，降低檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性[8]。近年來(lái)，隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷提升，我國(guó)臨床醫(yī)療檢測(cè)技術(shù)得到了有效的發(fā)展與優(yōu)化。隨著微柱凝膠技術(shù)的出現(xiàn)與應(yīng)用，有效解決了新生兒溶血病的檢測(cè)效率與準(zhǔn)確性的問(wèn)題[9-10]。從檢測(cè)原理上分析，該方法主要通過(guò)稀釋液的應(yīng)用，有效開(kāi)展凝膠的配置工作，在配置過(guò)程中，當(dāng)紅細(xì)胞與抗體發(fā)生反應(yīng)后，其反應(yīng)所得到的復(fù)合物會(huì)在凝膠中聚集或漂浮于凝膠表面，便于檢測(cè)人員肉眼觀察檢測(cè)結(jié)果[11-12]。若紅細(xì)胞與抗體之間無(wú)結(jié)合，紅細(xì)胞則會(huì)沉積在凝膠底部，即可判定患兒檢測(cè)結(jié)果為陰性。同時(shí)，在微柱凝膠技術(shù)中通過(guò)抗人球蛋白試劑的合理應(yīng)用，有利于進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)試驗(yàn)敏感度的提升。相關(guān)研究表明，在抗體放散實(shí)驗(yàn)中，該檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的敏感性[13]。然而，由于新生兒體內(nèi)所具有的ABO抗原未實(shí)現(xiàn)完全發(fā)育，導(dǎo)致血液樣本中抗原位點(diǎn)相對(duì)較少，難以有效實(shí)現(xiàn)凝集反應(yīng)，從而導(dǎo)致檢測(cè)過(guò)程中在直接抗人球蛋白中所表現(xiàn)出的陽(yáng)性率相對(duì)低于其他兩項(xiàng)試驗(yàn)的陽(yáng)性指標(biāo)[14]。因此，為了避免漏診情況的出現(xiàn)，醫(yī)務(wù)人員在進(jìn)行診斷的過(guò)程中應(yīng)合理對(duì)患兒血液樣本的三項(xiàng)檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)[15]。此外，為了避免由于樣本抗凝效果不佳產(chǎn)生纖維蛋白干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果而出現(xiàn)假陽(yáng)性的問(wèn)題，檢驗(yàn)人員應(yīng)在檢測(cè)前對(duì)標(biāo)本質(zhì)量嚴(yán)格把關(guān)。

本研究結(jié)果表明，在新生兒溶血病檢測(cè)過(guò)程中，與傳統(tǒng)試管檢測(cè)方法比較，通過(guò)微柱凝膠技術(shù)的應(yīng)用，可以提升患兒抗體游離、抗體放散以及直接抗人球蛋白的檢測(cè)效率，從而在縮短了檢測(cè)用時(shí)的同時(shí)實(shí)現(xiàn)了患者檢測(cè)質(zhì)量的提升與發(fā)展，這與Chen等[16]學(xué)者的研究結(jié)果相似。

綜上所述，在臨床過(guò)程中，通過(guò)微柱凝膠技術(shù)的應(yīng)用，醫(yī)務(wù)人員可以更為有效地對(duì)新生兒身體情況進(jìn)行合理檢測(cè)，從而對(duì)患兒是否患有新生兒溶血病進(jìn)行準(zhǔn)確的判定，對(duì)于新生兒健康的保障具有積極意義，值得在臨床過(guò)程中進(jìn)行大力推廣與普及應(yīng)用。