肝癌手術患者DYRK2表達水平對臨床預后的預測價值研究

程偉華 盧振華 趙利鋒 呂高波

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)主要采取手術切除、射頻消融、化療和靶向治療等，但復發率高、遠期生存期低[1]。因此尋找HCC的預后標志物對制定治療方案、降低復發風險、提高遠期生存率具有重要的臨床價值。雙特異性酪氨酸磷酸化調節激酶-2(dual-speci city tyrosine-(Y)-phosphorylation-regulated kinase-2，DYRK2)是DYRK家族成員之一。與多種實體瘤的腫瘤生物學行為和預后密切相關[2]。但DYRK2對HCC患者臨床預后的影響目前尚未報道。本研究主要探討DYRK2蛋白在預測HCC患者術后生存期的臨床價值。

資料與方法

一、研究對象

本研究納入了2010年1月至2015年12月期間在我院接受根治性手術的158例HCC患者。納入標準：(1)原發性HCC，并經病理確診；(2)接受根治性手術切除；(3)術前未接受化療或靶向治療。排除標準：(1)轉移性HCC；(2)HCC復發；(3)術前接受其他治療。158例患者的平均年齡為(58.3±12.4)歲，男性103例、女性55例。本研究經本院倫理委員會討論通過，并經患者簽署知情同意書。

二、免疫組化染色

將HCC患者的癌組織及癌旁組織的石蠟包埋樣本進行4 μm連續切片，經二甲苯、酒精梯度洗脫，切片脫蠟至水化，加入3%過氧化氫孵育5 min。自來水沖洗后，PBS浸泡3 min，加入含5%的山羊血清封閉，室溫孵育10 min，加入1∶100稀釋的抗DYRK2多克隆抗體(貨號：ab37912，Abcam公司，美國)，4℃孵育過夜。PBS沖洗3次，再加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG二抗，37℃孵育30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，自來水充分沖洗、復染、封片。

三、免疫組化分析

由2名病理科醫師獨立進行，評估內容包括陽性率評分和染色強度評分，病理科醫師對患者臨床資料和預后情況均不知情。陽性率評分：每個樣本隨機選擇5個視野，在200倍視野下測定陽性(棕色)細胞占總細胞百分比為陽性率并取平均值，以<10%陽性率為0分、10%～30%陽性率為1分、30%～50%陽性率為2分、50%～70%陽性率為3分、>70%陽性率為4分。染色強度評分：根據陽性細胞的棕色染色強度，分為0分(無染色)、1分(弱染色)、2分(中等染色)、3分(強染色)。DYRK2的最終評分為陽性率評分與染色強度評分的乘積，范圍為0～12分，其中0～4分定義為低表達、5～12分定義為高表達。

四、術后隨訪

所有HCC患者出院通過門診隨訪，隨訪內容包括病史、體格檢查、CT或MRI等腹部影像學檢查，術后1年內每3個月一次，術后1年后每6個月一次。以手術日期至確診復發日期為無進展生存期(progress-free survival，PFS)，以手術日期至死亡日期為總生存期(overall survival，OS)。最后一次隨訪時間為2018年9月30日。

五、統計學分析

結 果

一、DYRK2染色情況

見圖1。158例HCC患者的癌組織中DYRK2的組化評分顯著低于癌旁組織[(4.8±1.3)分 vs (9.6±2.2)分]，P<0.001。

圖1 3例HCC患者癌與癌旁DYRK2染色的典型圖片。

二、DYRK2低表達與高表達患者的臨床資料比較

見表1。根據DYRK2染色評分，將158例HCC患者分為低表達組(≤4分，95例)和高表達組(≥5分，63例)。與DYRK2高表達組相比，DYRK2低表達患者中AFP>20 ng/mL、腫瘤直徑>5 cm、TNM III-IV期、復發患者比例更高(P<0.05)；但兩組患者的年齡、性別、HBsAg陽性率、肝硬化比例和組織學分級等均無統計學差異。

表1 不同DYRK2表達水平患者的臨床及病理資料比較

三、DYRK2低表達與高表達患者的生存期比較

見圖2。與DYRK2高表達組患者相比，DYRK2低表達組患者的PFS和OS均明顯縮短(均P<0.001)。

圖2 不同DYRK2表達水平患者的PFS和OS生存曲線

四、影響HCC患者OS的獨立危險因素分析

見表2。單因素及多因素Cox回歸分析顯示，DYRK2低表達(HR=1.874，95%CI：1.521～2.339，P<0.001)和TNM III-IV期(HR=1.455，95%CI：1.210～1.782，P<0.001)是預測HCC患者OS縮短的獨立危險因素。

表2 影響HCC患者OS的單因素及多因素Cox回歸分析

討 論

DYRK2是DYRK家族的主要成員之一，該激酶家族對酪氨酸和絲氨酸/蘇氨酸位點均有磷酸化酶的活性[3]。DYRK2能夠與含有EDD、DDB1和VPRBP結構域(即EDVP復合物)的E3連接酶結合，從而直接磷酸化目標蛋白，在調控細胞凋亡、DNA損傷修復和細胞周期中起到重要的作用[4]。如DYRK2可直接磷酸化p53蛋白的第46位絲氨酸而增強p53的促凋亡活性，從而誘導腫瘤細胞凋亡[5]。細胞周期過程中G1/S期轉換的失調將導致腫瘤的發生發展，而c-Jun/c-Myc蛋白的降解是G1/S期轉換的關鍵過程。有研究發現DYRK2能磷酸化c-Jun和c-Myc蛋白，從而加速c-Jun/c-Myc蛋白由泛素化介導的蛋白酶體降解過程，從而延長G1期而抑制腫瘤細胞增殖[6]，提示DYRK2在腫瘤中起到抑制腫瘤增殖的作用。此外，DYRK2還能夠通過磷酸化Snail蛋白促進其降解而抑制乳腺癌和卵巢癌細胞的上皮間質轉化[7]，而上皮間質轉化是腫瘤細胞惡性侵襲轉移的驅動步驟，這提示了DYRK2在腫瘤中可抑制轉移侵襲的發生。

在本研究中，我們發現DYRK2在HCC癌組織中呈現低表達狀態，其表達水平顯著低于癌旁正常組織，這提示在HCC中DYRK2的表達水平受到抑制。同時我們還發現HCC患者的DYRK2表達降低與AFP水平、腫瘤直徑、TNM分期和術后復發相關。通過生存曲線分析發現，DYRK2表達降低與HCC患者的PFS縮短和OS縮短密切相關，進一步通過單因素和多因素Cox回歸分析證實DYRK2低表達是HCC患者總體預后不良的獨立危險因素，提示DYRK2的表達水平可作為預測HCC患者預后的良好指標。