正交試驗優化參白散結顆粒的水提工藝

吳靜鳴，黃曉青，曹陽，黃順旺

作者單位：1安徽天星醫藥集團有限公司，安徽 合肥230601；2合肥創新醫藥技術有限公司，安徽 合肥230088

在婦科領域，中醫藥在長期的臨床治療實踐中積累了豐富的經驗，有較為獨特的治療優勢。子宮肌瘤是育齡婦女生殖系統中的最常見的良性腫瘤，發病率高達20%～30%，中醫藥通過辨證論治對機體內環境進行整體調節，有效抑制子宮肌瘤的形成和發展，可以更好地滿足臨床治療需求。參白散結顆粒來源于醫院臨床驗方，臨床應用多年，數萬病例，療效確切，安全可靠，處方由黨參、白芍、益母草、白術、茯苓、炙甘草等九味藥材組成，具有疏肝理氣，活血散結的功效，主治氣滯血瘀型子宮肌瘤、卵巢囊腫。

原方用以湯劑，使用不便，為此，我們將湯劑改為顆粒劑，為了保證與原湯劑物質基準的一致性，提取工藝仍采用水提，根據處方中黨參、炒白芍、益母草、白炒術、茯苓、炙甘草等九味藥材所含成分的理化性質［1-6］，本研究自2018年1月至2019年6月采用正交試驗設計優選參白散結顆粒中黨參、炒白芍等九味藥材的最佳水提工藝。以處方中臣藥炒白芍中主要有效成分芍藥苷為指標［7］，結合提取得膏率優選該顆粒劑的水提工藝，為該顆粒劑生產工藝提供試驗依據。

1 試藥與儀器

1.1 實驗試藥 黨參（批號180412）、白芍（批號180603）、益母草（批號180505）等九味藥材均購自安徽普仁中藥飲片有限公司，經鑒定符合《中國藥典》2015年版一部相關項下規定。芍藥苷對照品（批號110736-201713，含量測定用）購自中國食品藥品檢定研究院，乙腈、甲醇為色譜純，水為重蒸餾水，磷酸等試劑均為分析純。

1.2 儀器設備 微壓循環中藥煎藥機（北京東華原醫療設備有限公司）；HL-SHZ-95 循環水式真空泵（河南鞏義市英峪儀器廠）；RE-200E旋轉蒸發儀（上海東璽制冷儀器設備有限公司）；HH-2K4一列回孔智能水浴鍋（鞏義市予華儀器責任有限公司）；湘儀L-550 型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司）；Waters高效液相色譜儀；Waters-2998紫外檢測器；Waters Empower 色譜工作站；6010 紫外-可見分光光度計（安捷倫科技上海有限公司）；AR1140 型電子天平（上海加惠儀器儀表有限公司）；CQF-I-6超聲波清洗機（天津奧特賽恩斯儀器公司）；真空干燥箱（上海躍進醫療器械廠）。

2 水提取工藝

2.1 藥材吸水率試驗 為了提高正交試驗加水量的準確度，對藥材的吸水率進行考察。按處方配比稱取黨參、白芍等九味藥材，加入10倍量水，密閉浸泡12 h，濾過，量取濾液，計算吸水率（%），實驗結果見表1。由表1可見，藥材的吸水率約為自身重量的1.9 倍，因此，在正交試驗第一次提取時，需多加1.9倍量的水煎煮。

表1 吸水率測定表

2.2 正交試驗設計［8-15］以浸膏得率、芍藥苷含量為指標，選擇加水量、煎煮時間、煎煮次數三個因素，每個因素選擇3 個水平，選用L9（34）正交設計，因素水平見表2。

表2 水提取因素水平表

2.3 藥材的提取及浸膏得率的測定［7］按表2設計9 組試驗，按處方配比稱取黨參、白芍等九味藥材9份，每份382 g，根據正交試驗設計的條件進行提取，為提高煎煮效果，將藥材加水浸泡1 h使其浸透后，煎煮，合并提取液，濾過，濾液濃縮，置已恒重的蒸發皿中，水浴蒸干，70 ℃減壓干燥至恒重后，稱重，計算浸膏得率。

2.4 浸膏中芍藥苷含量測定［8-13］

圖1 高效液相色譜圖：A為對照品，B為供試品，C為陰性對照

2.4.1 色譜條件與系統適用性試驗 色譜條件：COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；柱溫為25 ℃；流動相為乙腈：0.1%磷酸（14∶86）；檢測波長為230 nm；流速為1.0 mL/min；進樣量為10μL；理論板數按芍藥苷峰計算應不低于2 000。

2.4.2 對照品溶液的制備 取芍藥苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含60μg，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取樣品研細，取約0.3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加稀乙醇35 mL，密塞，精密稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率25 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45 μm）濾過，取續濾液，即得。

2.4.4 陰性樣品溶液的制備 按處方組成，取除白芍外其余藥材，按制劑工藝制成陰性樣品，按“2.4.3”項下方法，制成陰性對照溶液。

2.4.5 干擾試驗 按照“2.4.1”項色譜條件，將對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各10μL 分別進樣測定，結果：供試品中芍藥苷的色譜峰與相鄰色譜峰達到基線分離，陰性對照無干擾，見圖1。

2.4.6 標準曲線的制備 精密稱取芍藥苷對照品7.5 mg，置25 mL 容量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取0.5、1、2、4、6、8 mL，分別置10 mL量瓶中，用甲醇釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，分別進樣量10 μL，按照“2.4.1”項色譜條件測定，量取峰面積，以對照品濃度（μg/mL）為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，得回歸方程Y＝13 128X-1 893.9，r＝1，結果表明：芍藥苷在15～240μg/mL范圍內線性關系良好。

2.4.7 精密度試驗 精密吸取“2.4.2”項下的芍藥苷對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，在“2.4.1”項色譜條件下重復進樣6 次，測得峰面積，計算得其RSD為0.12%，表明本法測定精密度良好。

2.4.8 重復性試驗 取同一批號樣品共6 份，按“2.4.3”項下方法分別制備6份供試品溶液，在“2.4.1”項色譜條件下測定，芍藥苷的平均含量為1.12 mg/g，RSD為0.16%，本法重復性良好。

2.4.9 穩定性試驗 取同一供試品溶液分別于0、2、4、6、8、10 h進樣10 μL，測定芍藥苷的峰面積，計算得其RSD為1.5%，表明本品在10 h內穩定。

2.4.10 加樣回收率試驗 取已知含量為1.12 mg/g的同一批號的樣品細粉適量，精密稱定，共6 份，分別加入定量芍藥苷對照品，按“2.4.3”項下方法制備，在“2.4.1”項色譜條件下測定，并按外標法以芍藥苷峰面積計算，平均回收率為108.00%，RSD為0.98%。

2.4.11 測定方法 分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖，代入線性方程，計算芍藥苷（C23H28O11）的含量。

2.5 正交試驗方法與結果 由表3直觀分析可知，以浸膏得率為考察指標時，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工藝條件為A3B2C3。以芍藥苷含量為 考 察 指 標 時 ，A3＞A2＞A1，B2＞B3＞B1，C3＞C2＞C1，最佳工藝條件為A3B2C3。

表3 正交試驗設計及結果

由表4 方差分析可知，以浸膏得率為評價指標時，A因素、C因素均差異有統計學意義，B因素差異無統計學意義，且重要性依次為A＞C＞B；以芍藥苷含量為評價指標時，A 因素和B 因素差異無統計學意義，C 因素差異有統計學意義，重要性依次為C＞A＞B。

綜合考慮，水提最佳工藝為A3B2C3，即10 倍量（考慮藥材吸水率，第一次多加1.9 倍量）水，煎煮3次，每次2 h。合并煎液，濾過，濾液靜置，取上清液備用。

2.6 工藝驗證 取3份藥材（每份382 g），將A3B2C3組合平行試驗3 次，結果浸膏得率分別為37.59%，37.83%，38.35%，平均值為37.92%，RSD 為1.02%；芍藥苷的量分別為425.62 mg，430.37 mg，433.84 mg，平均值為429.94 mg，RSD為0.96%。

表4 方差分析

3 討論

3.1 多基原藥材的確定［7］本處方各味藥材中，黨參、炙甘草為多基原藥材，本試驗采用黨參藥材為桔梗科植物黨參Codonopsis pilosula（Franch.）Nannf.，炙甘草藥材為豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch。

3.2 含量測定指標的選擇及轉移率計算［1，3，7］本處方有由九味藥材組成，黨參為君藥，炒白芍、益母草為臣藥，炒白術、茯苓等為佐藥。其中黨參、白術、茯苓在中國藥典標準項下暫未收載含量測定指標；在此處方中，在HPLC-ELSD 條件下益母草中的鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿與其它峰未得到較好分離，暫不作為考核指標；因此，我們選擇炒白芍中的芍藥苷作為含量測定指標，所選方法簡便、準確、靈敏度高，可用于水提工藝的含量考察指標。投料藥材炒白芍中芍藥苷含量為1.24%，同時根據處方中炒白芍所占比例，計算出水提工藝得到的干膏中芍藥苷的含量，其轉移率穩定在75%左右，轉移率高。本研究優選出的水提工藝穩定，干膏得率適中，主要有效成分轉移率高，為參白散結顆粒的中試、大生產提供試驗依據。