白細胞介素22 對結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化的影響及作用機制

江旭林，范星，湯俊，陳校力，嚴偉，羅慶偉，李志紅

作者單位：鄂州市中心醫院胃腸外科，湖北 鄂州436000

近年來，結直腸癌發病率呈逐漸增高、年輕化趨勢。肝轉移是其治療難點及死亡的主要原因之一，減少轉移的發生，有利于提高病人的生活質量和生存率［1-2］。免疫治療是結直腸癌的一種治療方式，其主要是通過調節人免疫細胞來抑制或殺傷腫瘤細胞防止其復發和轉移，加快機體恢復［3］。白細胞介素 22（interleukin 22，IL-22）是由 Th1、Th17、Th22 等多種免疫細胞分泌的細胞因子，研究表明IL-22 在結腸癌組織及血清中呈現高表達，其介導的相關通路與結腸癌進展相關［4］。還有研究發現具核梭桿菌可以增高IL-22 的表達，它們可協同促進結直腸癌的進展［5］。有研究報道磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）參與調控結直腸癌的進展，Toll 樣受體2（TLR2）通過PI3K/AKT通路促進結腸癌的遷移、侵襲［6］。五味子乙素通過抑制PI3K/AKT 信號通路抑制大腸癌細胞增殖，誘導腫瘤細胞凋亡［7］。然而IL-22 對結腸癌細胞增殖、遷移、侵襲和上皮間質轉化（EMT）的影響及其機制尚不清楚，本實驗旨在研究IL-22 是否通過PI3K/AKT信號通路影響結腸癌的進展，為結直腸癌的免疫治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和組織來源 結腸癌SW480 細胞購于中國科學院上海細胞庫。結腸癌組織和正常癌旁組織：收集鄂州市中心醫院2017年1月至2019年1月接收的經病理診斷為結腸癌的病人67例，經手術獲取結腸癌組織和正常癌旁組織，組織標本切除后經10%甲醛固定，石蠟包埋。所有病人術前均未接受放化療，均知情且同意。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.1.2 主要試劑 RPMI-1640培養基（美國Gibco公司，貨號23400-021）；重組人IL-22（南京賽泓瑞生物科技有限公司，貨號SHR-328）；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒（美國 ScienCell 公司，貨號8028）；BCA 試劑盒（上海吉至生化科技有限公司，貨號PC0020）；蛋白提取試劑盒（貨號P0033）與SDSPAGE 試劑盒（貨號P0690）均購于碧云天生物技術研究所；Transwell 小室（貨號354480）與Matrigel（貨號354234）均購于美國BD公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與分組 結腸癌SW480 細胞用10%胎牛血清的RPMI-1640 培養基培養；用濃度分別為10 μg/L、20 μg/L、40 μg/L 的重組人IL-22 處理SW480細胞，以未經任何處理的SW480細胞作為對照組；40 μg/L 的重組人IL-22 處理SW480 細胞后再用PI3K/AKT通路抑制劑LY294002處理作為IL-22+LY294002組。

1.2.2 免疫組織化學染色檢測 取正常癌旁組織、結腸癌組織石蠟切片分別進行脫蠟水化、抗原修復，滅活過氧化物酶，然后用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）洗滌；胎牛血清封閉，加入兔抗人IL-22一抗孵育2 h，加入山羊抗兔二抗孵育30 min；3，3′-二氨基聯苯胺四鹽酸鹽（DAB）染色，蘇木素復染，脫水，透明、封片，熒光顯微鏡觀察拍照。IL-22 陽性表達判定以細胞膜呈棕黃色和棕褐色、細胞質呈紅色為準。在光學顯微鏡下計算陽性細胞數占總細胞數的百分比。

1.2.3 蛋白質印跡法（Western Blot）檢測蛋白表達 提取各組細胞總蛋白，用BCA試劑盒定量后進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），然后轉移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF 膜）上，經過脫脂牛奶封閉后加入一抗4 ℃孵育過夜，后加入二抗室溫孵育2 h；暗室中曝光顯影，定影；用Quantity One凝膠軟件檢測蛋白條帶吸光度（OD），以β-肌動蛋白（β-actin）為內參計算目的蛋白表達水平。

1.2.4 MTT 法測定細胞增殖率 取各組培養48 h的細胞，按MTT 試劑盒說明操作，在酶標儀測定490 nm 處 OD 值。細胞增殖率（%）＝OD實驗組值/OD對照組值×100%。

1.2.5 Transwell 檢測細胞遷移和侵襲 細胞遷移實驗各組細胞無血清培養后接種于Transwell 小室上室（3×103個/孔），下室加入含血清培養基，培養24 h后進行固定、染色，顯微鏡下拍照并計算遷移細胞數量。細胞侵襲實驗：用Matrigel 包被Transwell小室上室，之后同細胞遷移操作。

1.3 統計學方法 采用SPSS 20.00 進行統計學分析。計量資料以表示，兩組比較進行兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 結腸癌組織中IL-22的表達 與正常癌旁組織IL-22 陽性細胞表達率（28.35±4.21）%相比，結腸癌組織中IL-22陽性細胞表達率（76.12±8.47）%呈高表達（t＝41.340，P＜0.001）。

2.2 不同濃度IL-22 對結腸癌SW480 細胞增殖的影響 與對照組相比，不同濃度IL-22 組結腸癌SW480細胞中細胞增殖核抗原Ki67表達水平升高，細胞增殖率升高（P＜0.05）（圖1、表1）。可見，IL-22促進結腸癌SW480細胞增殖。

圖1 不同濃度白細胞介素22（IL-22）對結腸癌SW480細胞細胞增殖核抗原Ki67蛋白表達的影響

表1 不同濃度白細胞介素22（IL-22）對結腸癌SW480細胞增殖的影響/

表1 不同濃度白細胞介素22（IL-22）對結腸癌SW480細胞增殖的影響/

注：Ki67屬細胞增殖核抗原。與對照組比較，aP＜0.05

組別對照組10 μg/L IL-22 組20 μg/L IL-22 組40 μg/L IL-22 組F 值P 值重復次數9999細胞增殖率/%0.00±2.06 36.72±5.47a 115.67±10.48a 166.42±11.81a 720.225＜0.001 Ki67 0.42±0.05 0.77±0.08a 0.84±0.11a 0.98±0.12a 57.720＜0.001

2.3 IL-22 對結腸癌SW480 細胞遷移、侵襲的影響 與對照組相比，10 μg/L、20 μg/L、40μg/L 三種不同濃度IL-22處理的結腸癌SW480細胞中MMP-2表達水平升高，細胞遷移和侵襲數升高（P＜0.05）（圖2、表2）。可見，IL-22促進結腸癌SW480細胞遷移和侵襲。

圖2 白細胞介素22（IL-22）對各組結腸癌SW480細胞基質金屬蛋白酶2（MMP-2）蛋白表達的影響

2.4 IL-22對結腸癌SW480細胞EMT 的影響 與對照組相比，不同濃度IL-22 組結腸癌SW480 細胞中E-cadherin表達水平降低，Vimentin、N-cadherin表達水平升高（P＜0.05）（圖3、表3）。可見，IL-22 促進結腸癌SW480細胞EMT。

2.5 IL-22 對結腸癌 SW480 細胞 PI3K/AKT 通路的影響 與對照組相比，不同濃度IL-22 組結腸癌SW480 細胞中p-AKT、total-AKT 表達水平升高（P＜0.05）（圖4、表4）。可見，IL-22可激活結腸癌SW480細胞PI3K/AKT信號通路。

表2 白細胞介素22（IL-22）對結腸癌SW480細胞遷移、侵襲的影響/

表2 白細胞介素22（IL-22）對結腸癌SW480細胞遷移、侵襲的影響/

注：MMP-2為基質金屬蛋白酶2。與對照組比較，aP＜0.05

重復次數9999組別對照組10 μg/L IL-22 組20 μg/L IL-22 組40 μg/L IL-22 組F 值P 值遷移細胞數/個80.96±6.53 123.79±8.64a 163.79±11.85a 223.79±15.72a 263.230＜0.001侵襲細胞數/個57.35±7.83 94.65±11.13a 134.71±9.54a 154.27±12.78a 152.287＜0.001 MMP-2 0.46±0.03 0.71±0.06a 0.94±0.07a 1.25±0.08a 257.772＜0.001

圖3 各組結腸癌SW480細胞上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經鈣黏附蛋白（N-cadherin）的表達

表3 白細胞介素22（IL-22）對上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經鈣黏附蛋白（N-cadherin）表達的影響/

表3 白細胞介素22（IL-22）對上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經鈣黏附蛋白（N-cadherin）表達的影響/

注：與對照組比較，aP＜0.05

重復次數9999組別對照組10 μg/L IL-22 組20 μg/L IL-22 組40 μg/L IL-22 組F 值P 值E-cadherin 0.42±0.05 0.31±0.04a 0.19±0.03a 0.15±0.04a 81.591＜0.001 Vimentin 0.39±0.03 0.45±0.05a 0.61±0.05a 0.77±0.08a 85.366＜0.001 N-cadherin 0.45±0.03 0.51±0.06a 0.58±0.07a 0.71±0.08a 28.462＜0.001

圖4 各組結腸癌SW480細胞磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）和總蛋白激酶B（total-AKT）蛋白表達

2.6 LY294002 逆轉 IL-22（40 μg/L）對結腸癌SW480 細胞遷移、侵襲的影響 與對照組相比，IL-22 組結腸癌SW480 細胞中Ki67、MMP-2、Vimentin、N-cadherin 表達水平升高，E-cadherin 表達水平降低，細胞增殖率和遷移、侵襲細胞數升高（P＜0.05）；與 IL-22 組相比，IL-22+LY294002 組結腸癌 SW480細胞中Ki67、MMP-2、Vimentin、N-cadherin表達水平降低，E-cadherin 表達水平升高，細胞增殖率和遷移、侵襲細胞數降低（P＜0.05）（圖5、表5）。

表4 白細胞介素22（IL-22）對結腸癌SW480細胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路蛋白表達的影響/

表4 白細胞介素22（IL-22）對結腸癌SW480細胞磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）通路蛋白表達的影響/

注：p-AKT為磷酸化蛋白激酶B，total-AKT為總蛋白激酶B。與對照組比較，aP＜0.05

total-AKT蛋白0.56±0.05 0.63±0.04a 0.68±0.06a 0.72±0.05a 16.794＜0.001組別對照組10 μg/L IL-22 組20 μg/L IL-22 組40 μg/L IL-22 組F 值P 值重復次數9999 p-AKT蛋白0.28±0.03 0.42±0.05a 0.58±0.06a 0.66±0.08a 76.925＜0.001

圖5 各組結腸癌SW480細胞細胞增殖核抗原Ki67、基質金屬蛋白酶2（MMP-2）、上皮鈣黏附蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、神經鈣黏附蛋白（N-cadherin）的表達

3 討論

免疫治療能延緩結腸癌術后腫瘤的復發和轉移，可有效提高病人的免疫功能，是結腸癌新的輔助治療手段［8］。IL-22是近年來新發現的細胞因子，在惡性腫瘤中發揮重要作用，研究發現Th22細胞通過釋放IL-22 活化宮頸癌細胞內AKT 通路促使其增殖［9］。IL-22可通過促進神經膠質瘤細胞的增殖而促進小鼠神經膠質瘤的進展［10］。IL-22 還能促進乳頭狀甲狀腺癌細胞的遷移和侵襲［11］。IL-22 通過靶向人類結腸癌細胞中的己糖激酶-2來促進與腫瘤進展相關的需氧糖酵解［12］。本實驗結果顯示，結腸癌組織中IL-22表達顯著升高，提示IL-22可能參與了結腸癌的發生發展。本實驗進一步用不同濃度的IL-22處理結腸癌細胞SW480，結果顯示，細胞增殖率顯著升高，細胞遷移、侵襲數顯著升高。表明IL-22可促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Ki67是一種與細胞周期相關的細胞核增殖相關抗原，與腫瘤細胞的增殖相關［13］。Vimentin、E-cadherin、N-cadherin 均是EMT的標志物，Vimentin、N-cadherin表達上調，E-cadherin 表達下調可使細胞獲得遷移和侵襲能力［14-15］。MMP-2 是基質金屬蛋白酶家族成員之一，下調表達可抑制結腸癌細胞侵襲和遷移［16］。本實驗結果顯示IL-22處理的結腸癌細胞中Ki67、MMP-2、Vimentin、N-cadherin 表達水平顯著升高，E-cadherin表達水平顯著降低，進一步表明IL-22可促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。提示，IL-22 參與了結腸癌細胞惡性生物學行為，與結腸癌的進展有關。

表5 PI3K/AKT通路抑制劑逆轉白細胞介素22（IL-22）（40μg/L）對結腸癌SW480細胞遷移、侵襲的影響/

表5 PI3K/AKT通路抑制劑逆轉白細胞介素22（IL-22）（40μg/L）對結腸癌SW480細胞遷移、侵襲的影響/

注：MMP-2為基質金屬蛋白酶2，E-cadherin為上皮鈣黏附蛋白，Vimentin為波形蛋白，N-cadherin為神經鈣黏附蛋白。與對照組比較，aP＜0.05；與IL-22組比較，bP＜0.05

N-cadherin 0.42±0.05 0.68±0.07a 0.55±0.06b 41.482＜0.001組別對照組IL-22 組IL-22+LY294002 組F 值P 值重復次數999細胞增殖率/%0.00±4.68 216.64±17.36a 141.69±13.58b 643.739＜0.001遷移細胞數/個93.47±8.34 246.19±18.56a 147.64±12.52b 283.585＜0.001侵襲細胞數/個61.49±7.06 148.46±13.48a 97.45±11.68b 140.132＜0.001 Ki67 0.45±0.05 0.94±0.09a 0.68±0.07b 104.690＜0.001 MMP-2 0.49±0.05 1.13±0.11a 0.74±0.08b 133.757＜0.001 E-cadherin 0.53±0.05 0.19±0.03a 0.33±0.04b 157.680＜0.001 Vimentin 0.41±0.04 0.75±0.08a 0.54±0.08b 55.188＜0.001

IL-22 還可通過調控多種信號通路影響腫瘤進展。如IL-22 通過活化信號轉導和轉錄激活因子3（STAT3）信號通路促進結直腸癌細胞SW480 和SW620 的增殖［17］；IL-22 通過 STAT3 激活促進骨肉瘤細胞增殖和侵襲［18］。IL-22 通過 IL-22 受體 1（IL-22R1）/STAT3和IL-22R1/AKT信號通路促進肺癌細胞增殖和遷移［19］。本實驗結果顯示，IL-22處理的結腸癌細胞中p-AKT和total-AKT表達水平升高，說明IL-22可激活PI3K/AKT信號通路。本實驗進一步用PI3K/AKT 通路抑制劑 LY294002 和 IL-22 共同處理結腸癌SW480 細胞，結果顯示，細胞增殖率以及細胞遷移、侵襲數顯著降低，Ki67、MMP-2、Vimentin、N-cadherin表達水平顯著降低，E-cadherin表達水平顯著升高。說明抑制PI3K/AKT通路可逆轉IL-22對結腸癌SW480 細胞增殖、遷移、侵襲的促進作用。提示，IL-22 對結腸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響可能是通過PI3K/AKT信號通路實現的。

綜上所述，IL-22 可能通過PI3K/AKT 通路促進SW480細胞的增殖、遷移、侵襲和EMT。