非編碼RNA IncWDR 26 對肝癌細胞的抑制作用

陳寶勝，劉雅剛，張吉水，宋哲，袁俊建，王連芬，張曉宇，孟高培

作者單位：滄州市中心醫院普通外二科，河北 滄州061000

肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是致死率相對較高的一種癌癥，調查研究結果顯示，全世界2016年死于HCC 的人數超過82 萬，而此類疾病在我國發生率也相對較高［1-2］。由于其早期診斷相對困難，且晚期治療存活率較低，研究表明，有效治療后的HCC病人5年生存率僅達到30%［3］。而近幾年國內外多項研究表明，非編碼RNA異常表達是誘發HCC癌變的主要原因之一，其主要通過小囊泡輸送信息，通過調節肝癌細胞的上皮間質轉化、腫瘤微環境及促進微小血管生成等作用，促進肝癌的發生、發展以及轉移［4］。而筆者前期研究中發現，肝癌病人中IncWDR 26段的表達量存在顯著升高，但是通過對比國內外研究發現，此段RNA的功能以及其對HCC 中癌細胞影響的研究相對較少［5］，故本研究自 2018年 1月至 2019年 1月針對其影響 HCC 的作用進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 細胞株 通過聯系中科院細胞庫獲取5 株HCC 細胞系（SMMC-7721，PLC/PRF/5，Huh7，SKHep-1及Hep3B）及1株正常肝細胞系（LO2）。

1.1.2 質粒 IncWDR 26 由本院自行制備。RNA由德國QIAGEN 公司提供，采用北京全式金生物技術有限公司提供的EasyScript One-Step 試劑盒進行PCR處理。

1.1.3 試劑及器材 DMEM 培養基，胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）由美國Gibco 公司提供；青霉素-鏈霉素雙抗液由美國Hyclone 公司提供；細胞裂解液，Cell Counting Kit-8 試劑盒由江蘇碧云天生物技術有限公司提供，pLKO.1載體由美國愛迪基因公司提供；ELx800吸收光酶標儀，美國Bio-Tek公司生產；原位細胞增殖試劑盒（FLUOS）由瑞士Roche 公司生產；細胞凋亡試劑盒由江蘇凱基生物技術股份有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 肝癌細胞株的培養 通過將SMMC-7721 及SK-Hep-1 肝癌細胞系置于加入10%胎牛血清、1×10 U/L青霉素-鏈霉素的DMEM培養基中，并放置于37 ℃、二氧化碳濃度為5%的溫箱中培養。

1.2.2 IncWDR 26轉染方法 通過RACE測定確定LncWDR26 轉錄物靶序列為：CCTGGAATGAGACTTGCAA。而后基于慢病毒的短發夾RNA（shRNA）表達構建體構建到pLKO.1載體中以敲低lncWDR26表達。用編碼特異性shRNA序列的慢病毒載體（OE組）和陰性對照載體（Con組）分別轉染細胞。隨后取對數培養的SMMC-7721及SK-Hep-1肝癌細胞，以每孔3×103量將細胞注入96孔板中培養，12 h后進行轉染，轉染48 h后使用嘌呤霉素選擇穩定的轉染細胞，時間為1周。

1.2.3 HCC 細胞及正常桿細胞株中IncWDR 26 表達的檢測 由通過美國ABI 公司提供Step-One Plus Detection 系統分別對5株HCC 細胞及1株正常肝細胞中的非編碼RNA 進行real-time PCR 反向轉錄到cDNA后，通過DNA去除和cDNA合成，將相對表達水平計算為與GAPDH 的比率歸一化的比，而后采用2-ΔΔCt法對比上述6組細胞株中IncWDR 26平均表達量的區別。而后對比轉染后Con 組及OE 組中SMMC-7721及SK-Hep-1與轉染前IncWDR 26表達量的區別。

1.2.4 IncWDR 26 對HCC 細胞增殖的影響的檢測方法 取穩定轉染且為對數培養的OE 組及Con 組的兩株細胞，每一株細胞均接種于96孔板，將CCK-8 試劑稀與細胞株培養基按照1∶10 稀釋后，分別于每孔加入50μL，并進行培養，并用酶標儀檢測其于波長450 nm處光密度，共計培養4 d，每日定時測定其吸光度。增殖率計算公式：（當日光密度-首日光密度）/首日光密度，而后計算平均增殖率。

1.2.5 IncWDR 26對HHC細胞周期的影響的檢測方法 細胞周期的檢測通過原位細胞增殖試劑盒進行，取穩定轉染的OE組及Con組的兩株細胞，每一株細胞均接種于96孔板，采用流式細胞術分析細胞周期分布，實驗數據由Tree Star FlowJo軟件進行分析。

1.2.6 IncWDR 26 對HHC 細胞凋亡的影響的檢測方法 細胞凋亡情況檢測通過凋亡試劑盒進行，根據制造商的說明取穩定轉染的OE 組及Con 組的兩株細胞，每一株細胞均接種于96 孔板后，用熒光素異硫氰酸酯偶聯的膜聯蛋白V 和7-AAD 對細胞染色后，采用流式細胞儀分析細胞凋亡情況，實驗數據由Tree Star FlowJo軟件進行分析。

1.2.7 IncWDR 26 對HHC 細胞侵襲和遷移能力的影響的檢測方法 將細胞接種在預涂有基質膠的膜的頂側用于侵襲測定，遷移測定則需要取出聚碳酸酯膜進行，二者細胞孵育時間均為24 h。用棉簽擦拭上室內的細胞，固定下室表面的細胞，并用0.5%結晶紫溶液染色15 min 后，均隨機抽取10 個不同視野測定平均下室表面細胞數。

1.3 統計學方法 采用SPSS 22.0 分析實驗數據，計量資料的兩組之間比較采用t檢驗，多組之間比較采用方差分析。

2 結果

2.1 HCC細胞株正常桿細胞株中IncWDR 26表達的檢測結果 與正常肝細胞LO2 相比，其余5 株HCC細胞IncWDR 26表達水平相對較低（P＜0.05），具體見表1。

表1 肝癌（HCC）細胞株正常肝細胞株中IncWDR 26表達的檢測結果

2.2 轉染后 Con 組及 OE 組中 SMMC-7721 及 SKHep-1 IncWDR 26 表達量的比較 OE 組中的兩株細胞IncWDR 26表達量顯著高于Con組（P＜0.05），具體見表2。

表2 轉染后Con組及OE組中SMMC-7721及SK-Hep-1與轉染前IncWDR 26表達量的比較/

表2 轉染后Con組及OE組中SMMC-7721及SK-Hep-1與轉染前IncWDR 26表達量的比較/

株數96 96組別Con 組OE 組t 值P 值SMMC-7721 1.42±0.38 23.04±4.28 49.299 0.000 SK-Hep-1 1.21±0.29 16.83±3.94 38.738 0.000

2.3 IncWDR 26 對HHC 細胞增殖的影響的檢測結果 OE組中SMMC-7721及SK-Hep-1兩株細胞培育1 d 后的平均增殖率均顯著低于Con 組中的兩組細胞（均P＜0.01），具體見表3。

表3 IncWDR 26對HHC細胞增殖的影響的檢測結果

2.4 IncWDR 26 對HHC 細胞周期的影響的檢測結果 兩組中SMMC-7721 及SK-Hep-1 兩株細胞周期位于G0/G1，S 及G2/M 期的細胞平均率差異無統計學意義（P＞0.05），具體見表4。

表4 IncWDR 26對HHC細胞周期的影響的檢測結果/（%，）

表4 IncWDR 26對HHC細胞周期的影響的檢測結果/（%，）

株數G0/G1期S期G2/M期組別Con 組SMMC-7721 SK-Hep-1 OE 組SMMC-7721 SK-Hep-1 96 96 62.43±3.97 65.94±4.02 36.87±2.29 22.13±2.34 5.92±1.89 4.38±0.83 96 96 61.52±3.29 66.13±4.28 37.01±2.38 21.03±2.98 6.34±1.76 4.57±0.87

2.5 IncWDR 26 對HHC 細胞凋亡的影響的檢測結果 OE 組中的兩株細胞中膜聯蛋白V 陽性細胞平均率顯著高于Con組中兩株細胞（P＜0.05），具體見表5。

表5 IncWDR 26對HHC細胞凋亡的影響的檢測結果（平均膜聯蛋白V陽性率）/（%，）

表5 IncWDR 26對HHC細胞凋亡的影響的檢測結果（平均膜聯蛋白V陽性率）/（%，）

株數96 96組別Con 組OE 組t 值P 值SMMC-7721 10.07±2.02 20.14±2.58 30.112 0.000 SK-Hep-1 13.67±2.38 27.45±4.34 20.277 0.000

2.6 IncWDR 26 對HHC 細胞侵襲和遷移能力的影響的檢測結果 OE組中兩株HCC細胞侵襲檢測和遷移檢測的平均視野內下室表面細胞數均顯著低于Con組（均P＜0.01），具體見表6。

表6 IncWDR 26對HHC細胞侵襲和遷移能力的影響的檢測結果（平均視野內下室表面細胞數）/

表6 IncWDR 26對HHC細胞侵襲和遷移能力的影響的檢測結果（平均視野內下室表面細胞數）/

株數 遷移檢測 侵襲檢測10 10 219.47±27.13 284.05±19.48組別Con 組SMMC-7721 SK-Hep-1 OE 組SMMC-7721 SK-Hep-1 Con 組與 OE 組 SMMC-7721株比較 t 值P 值Con 組與 OE 組 SK-Hep-1株比較 t 值P 值97.14±23.49 79.48±9.14 10 10 28.48±5.04 69.38±4.90 67.815 10.48±4.19 9.35±1.04 35.585 0.0000.000 104.711 0.000 74.696 0.000

3 討論

非編碼RNA 是細胞內不參與蛋白質編碼的一組RNA，以往研究將之視為轉錄“噪音”［6］，但是近幾年研究結果卻顯示其在針對癌細胞的增殖、周期以及侵襲等功能起到決定性的作用［7-8］。而HCC 是目前我國發病率相對較高的癌癥，且病情隱蔽性相對較高，發現使一般為晚期，治療效果較差。而在一些研究中，HCC 病人癌細胞中HOTAIR，IncRNAATB，UFC1 以及 MALAT1 等非編碼 RNA 存在過度表達的情況，但織IncRNA MEG3 和GAS5 等調控作用相對減弱［9-10］，而根據我們之前的研究發現［11］，IncWDR 26 作為非編碼 RNA 的一種，在 HCC 組織內作用減弱，故開展本次研究，旨在為HCC 診斷和治療提供新的方向。

研究結果顯示，與正常肝細胞LO2相比，其余6株HCC細胞IncWDR 26表達水平相對較低，這一結果與之前研究相似，說明了IncWDR 26調控減弱可能是誘發HCC的關鍵因素。與此同時針對轉染Inc-WDR 26后的HCC細胞比較結果顯示，人工轉染IncWDR 26 可以有效增加 HCC 細胞內 IncWDR 26 的調控功能。而之后針對增殖情況的研究結果顯示，Con組HCC細胞增殖率顯著低于OE組，IncWDR 26的表達能有效抑制HCC 細胞增殖。根據我們之前的研究結果，IncWDR 26 主要是通過與轉錄因子SIX3 相互作用來影響HCC 細胞。而有研究顯示［12-13］，SIX3能有效下調AURKA/B，S100P，TGFB3，GINS3 和BAG1 等參與增殖和轉移的基因表達，而IncWDR 26 能有效激活SIX3 從而達到抑制HCC 增殖的效果。

膜聯蛋白V 陽性細胞數是反映HCC 細胞凋亡的指標，而單位面積下下室表面細胞數則是反應HCC細胞的遷移和侵襲性，針對上述兩組指標的研究結果顯示Con 組HCC 的細胞凋亡情況明顯較多，而遷移和侵襲性則顯著下降。癌癥病人病情的發展與上述幾個指標有顯著關聯，此結果顯示，IncWDR 26 能有效促進HCC 細胞減少的同時，還能減少其對周圍健康組織的影響并降低遠處轉移的能力。根據之前的研究顯示，IncWDR 26 與細胞內另一組WDR26 的調控作用是呈負相關，而WDR26 是WD重復蛋白家族的成員，該家族的記憶涉及多種細胞過程，包括細胞周期進程，信號轉導，細胞凋亡和基因調控［14］。其被認為是誘導HCC 發生的原因可能有三點：（1）激活絲裂原活化蛋白激酶信號通路［15］；（2）WDR26 與 Gβ-γ 復合物結合并控制細胞遷移［16-17］；（3）影響β-連環蛋白水平［18］，但具體作用方式尚不清楚。雖然細胞周期檢測結果顯示，兩組HCC 細胞間各細胞周期構成比比較結果卻無顯著差異，但是提升HCC 細胞內IncWDR 26 能使得WDR26 調控作用減弱，從而誘導HCC 細胞凋亡并降低其遷移和侵襲能力，同樣能達到抑制HCC發展的功能。

本研究中選擇HCC 細胞株是SMMC-7721 及SK-Hep-1，考慮到原有細胞中IncWDR 26的影響，故選擇兩株IncWDR 26表達量最低的HCC細胞。值得注意的是，通過對比臨床手術病人癌組織中IncWDR 26表達量與組織大小、病人預后等相關性，能更加有效地證明此RNA對HCC的影響，故在今后的研究中可以進行完善，同時還應該開展針對性的靶向治療方式研究，力求尋找一個行之有效的診斷及治療方法。

綜上所述，HCC 細胞內IncWDR 26 的高表達能有效抑制癌細胞的增殖，并降低其侵襲及轉移能力，同時還能促進其凋亡，從而有效抑制腫瘤的發展，對延緩HCC 病情發展有較好的作用，為針對HCC的lncRNA定向診斷和治療提供了新的方向。