聯合檢測尿液微小核糖核酸375 和微小核糖核酸145-5p 水平在膀胱癌診斷和預后的臨床價值

張菊根，吳振啟

作者單位：復旦大學附屬中山醫院青浦分院泌尿科，上海201799

膀胱癌是泌尿科的常見惡性腫瘤，多數為上皮細胞癌，由于起病較為隱匿，早期診斷仍較為困難。微小核糖核酸（miRNAs）是一類具有重要生物學功能的內源性非編碼單鏈RNA，具有癌基因和抑癌基因的類似作用，參與了腫瘤的發生發展過程，在腫瘤的診斷，預后判斷和靶向治療具有重要意義［1-2］。目前miRNAs在膀胱癌的研究主要集中在組織標本或者血液標本，而對尿液的研究較少。有研究表明尿液中的miR-375 可作為膀胱癌的診斷和監測復發［3］，而尿液miR-145 表達也可以作為膀胱癌的診斷和預后判斷的指標［4］，但尿液聯合檢測miR-375和miR-145-5p 是否能夠提高膀胱癌診斷和預后的效能，未見報道。本組研究通過采集膀胱癌病人的尿液檢測miRNA-375和miR-145-5p水平，觀察其在膀胱癌發生發展，診斷和預后中的臨床價值，現報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2016年1月在復旦大學附屬中山醫院青浦分院就診確診為膀胱癌的病人112 例，為膀胱癌組。其中男64 例，女48例，年齡（63.24±10.61）歲，年齡范圍為37～79 歲，腫瘤部位：膀胱底51 例，膀胱體37 例和三角區24 例；腫瘤分期：Ta-T139 例，T2-T473 例。選擇同期在我院行健康體檢者45 例，為健康對照組，男24 例，女21例，年齡（62.92±9.16）歲，年齡范圍為38～79 歲。納入標準：所有病人均經病理學確診為膀胱癌；所有病人或其近親屬均簽署知情同意書。排除標準：嚴重的心肝腎等重要臟器功能障礙；其他惡性腫瘤，免疫性疾病和血液性疾病；精神性和智力性疾病影響隨訪；術前右化療，放療和靶向治療；有泌尿系統其它疾病如結石，感染等；病人資料不完整。兩組在年齡和性別等一般資料無明顯差別，具有可比性。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 方法

1.2.1 尿液標本的保存 病人入院時，禁飲食12 h后收集中后段尿液100 mL，放置在低溫冰箱中保存，并在2 h內予以離心，離心速度3 000 r/min，時間30 min，并分裝在RNA 酶處理過的Eppendorf 管中，保存在-80 ℃的冰箱中。

1.2.2 實時定量PCR 根據Trizol 說明書，取尿液上清液用紫外光光度計分別檢測在230 nm，260 nm和280 nm 處的吸收值。實驗采用Primer Premier 5.0 軟件涉及引物。miRNA-375 引物序列，正向5′-TTTGTTCGTTCGGCTCGC-3′，反向 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-145-5p 的引物序列，正向 5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATC-3′，反向 5′-AGAACAGTATTTCCAGGAAT-3′；U6 引物序列，正向 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用 20 μL 的 cDNA的合成反應體系，使用PCR 擴增儀，分別在26 ℃，42 ℃和85 ℃的溫度下，分別反應30 min，30 min 和10 min。最后將引物，定量PCR Master Mix，Taq DNA 聚合酶和 cDNA 模板加入 ddH2O 中形成 20μL的反應體系。反應過程：分別在95 ℃，95 ℃和60 ℃，分別反應時間3 min，12 s和40 s，總共40個循環。以 U6 為內參，測定 CT 值。采用 2-△△CT表示miRNA-375和miR-145-5p相對表達量，其中△△CT＝膀胱癌組（CT目的基因-CTU6）-健康對照組（CT目的基因-CTU6）。每個樣本重復3次。

1.2.3 觀察指標 觀察膀胱癌組和健康對照組尿液miRNA-375和miR-145-5p水平的差異，膀胱癌病人尿液miRNA-375 和miR-145-5p 表達水平術前術后變化，與臨床指標和預后的關系，及其在診斷膀胱癌和判斷其預后的靈敏度和特異度。

1.3 統計學方法 使用SPSS 21.0 進行數據分析。計量資料采用表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q比較，兩組比較采用t檢驗。計數資料采用率表示，率的比較采用χ2檢驗。采用logistic二元回歸分析得出尿液miRNA-375和miR-145-5p水平聯合變量檢測膀胱癌和預后發生情況。用MedCalc 軟件包繪制出受試者曲線（ROC）評價診斷和預后的靈敏度和特異度。P＜0.05 視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組尿液miRNA-375和miR-145-5p表達的比較 從表1 和圖1 可知，膀胱癌組尿液miRNA-375表達明顯高于健康對照組（P＜0.01），術后較術前明顯降低（P＜0.01），而miR-145-5p的表達明顯低于健康對照組（P＜0.01），術后較術前明顯升高（P＜0.01）。

表1 膀胱癌112例與健康體檢者45例尿液miRNA-375和miR-145-5p表達的比較/

表1 膀胱癌112例與健康體檢者45例尿液miRNA-375和miR-145-5p表達的比較/

組別健康對照組膀胱癌組術前術后例數45 miRNA-375/（2-ΔΔCT）2.30±0.54 miR-145-5p/（2-ΔΔCT）2.68±0.61 112 112 3.95±1.26 2.43±1.08 1.48±0.75 2.56±0.67

圖1 各組尿液miRNA-375和miR-145-5p表達的比較

2.2 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達在診斷膀胱癌的效能 從表2 和圖2 可知，尿液miRNA-375和miR-145-5p 表達在診斷膀胱癌具有較高的靈敏度和特異度，將尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平進行回歸的方程2.678XmiRNA-375-2.617XmiR-145-5p-0.996，聯合檢測的靈敏度87.5%，特異度93.3%，其曲線下面積明顯高于 miRNA-375（z＝2.316，P＝0.021）和 miR-145-5p（z＝2.727，P＝0.006）單獨檢測，而miRNA-375 和miR-145-5p 之間差異無統計學意義（z＝0.921，P＞0.05）。

2.3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平與臨床指標的關系 從表3可知尿液miRNA-375和miR-145-5p 表達水平與性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤分級無明顯相關性（P＞0.05），而與腫瘤分期、淋巴結轉移和腫瘤數目具有明顯相關性（P＜0.01）。

表2 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達在診斷膀胱癌的效能

圖2 聯合檢測曲線下面積在診斷膀胱癌的效能

2.4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平與膀胱癌預后的關系 膀胱癌病人隨訪3年，出現23例死亡，89 例存活，死亡組的miRNA-375 表達水平明顯高于存活組（P＜0.01），而miR-145-5p表達水平明顯低于存活組（P＜0.01）。見表4。

表4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平與膀胱癌預后的關系/

表4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平與膀胱癌預后的關系/

miR-145-5p 0.78±0.36 1.66±0.72 5.668 0.000例數23 89組別死亡組存活組t 值P 值miRNA-375 5.49±1.42 3.55±0.84 8.431 0.000

2.5 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平在預測3年內出現死亡的效能 從表5和圖3可知，尿液miRNA-375表達水平在預測膀胱癌3年內出現死亡的靈敏度為78.3%，特異度95.5%，其曲線下面積為0.891；而尿液miR-145-5p 表達水平在預測膀胱癌3年內出現死亡的靈敏度為95.7%，特異度為70.8%，曲線下面積為0.856。兩者聯合檢測并不能提高預測3年內出現死亡的診斷效能。

3 討論

MicroRNAs 是20 個核苷酸左右的非編碼單鏈RNA，至今至少發現超過1 000 種以上的miRNA 參與了30%以上的基因調控，并在轉錄和翻譯水平進行調控。現有的研究證實miRNA 具有很強的組織和細胞特異度，一旦出現異常，對疾病的診斷和預后的判斷具有重要價值［5］。檢測miRNA 的標本可以是組織，血液和尿液，而尿路上皮癌選擇尿液具有明顯的優勢［6］，由于尿液與腫瘤組織直接接觸，腫瘤細胞和及其釋放細胞因子在尿液中有著不同程度表達，并且標本易得，miRNA 在尿液中的穩定性高于血液和組織標本；尿液的pH 值對miRNA 影響很小，其室溫下放置72 h甚至反復凍融7次，尿液的miRNA變化依然不大［7］，故運用于臨床miRNA的檢測具有較高的臨床檢測價值。

表3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平與臨床指標的關系/

表3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平與臨床指標的關系/

例數miRNA-375/（2-ΔΔCT）miR-145-5p/（2-ΔΔCT）臨床指標性別t（F）值0.083男女年齡64 48 3.96±1.30 3.94±1.21 P值0.934 t（F）值1.476 P值0.143 1.39±0.71 1.60±0.79 1.503＜65 歲≥65 歲腫瘤部位膀胱底膀胱體三角區腫瘤分級高級別低級別腫瘤分期Ta～T1 T2～T4淋巴結轉移47 65 4.16±1.21 3.80±1.28 0.1360.7660.445 1.42±0.69 1.53±0.79（1.734）51 37 24 4.06±1.22 3.64±1.11 4.19±1.50 0.170（0.287）0.752 1.45±0.70 1.46±0.76 1.58±0.85 0.418 55 57 4.00±1.21 3.90±1.32 0.6770.9840.327 1.41±0.70 1.55±0.80 9.777 39 73 2.78±0.57 4.58±1.07 0.00014.6170.000 2.31±0.37 1.04±0.47 11.975是 否51 61 4.98±1.03 3.09±0.62腫瘤數目單發多發0.00016.2030.000 0.80±0.34 2.06±0.46 12.071 62 50 3.10±0.62 5.00±1.03 0.00016.4070.000 2.05±0.46 0.78±0.33

表5 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達水平在預測3年內出現死亡的效能

圖3 預測膀胱癌3年內出現死亡的ROC曲線下面積的比較

miRNA-375 最早發現在哺乳動物β 細胞中發現，作用于胰腺小島，通過血糖激素水平的變化來調整胰島素的分泌［8］。隨后發現miRNA-375在各種器官和組織均有表達，是一種多功能的miRNA，與胰島細胞，肺表面活性物質分泌，黏膜免疫和腫瘤的發生發展均具有重要意義。miRNA-375 在不同的腫瘤表達不同，在胃癌的研究中發現，胃癌組織miRNA-375 表達明顯低于胃正常組織，并對胃癌細胞的增殖和遷移具有明顯的抑制作用［9］。同樣在結腸癌的miRNA-375表達明顯低于結腸正常組織，并且發現轉染miRNA-375 基因到結腸癌細胞后能夠明顯抑制結腸癌細胞的增殖和遷移，具有明顯抑制癌作用［10］；在前列腺癌的研究中發現miRNA-375存高表達，明顯高于健康對照組，并且與前列腺癌臨床病理特征具有明顯的相關性，具有明顯促癌作用［11］。本組研究表明膀胱癌病人尿液中miRNA-375 表達明顯高于對照組，手術后病人尿液中的miRNA-375 水平出現明顯降低，并且發現與腫瘤分期、淋巴結轉移和腫瘤數目具有明顯相關性，說明miRNA-375 參與了膀胱癌的發生發展過程，并且發現miRNA-375 與膀胱癌的腫瘤分期具有明顯相關性。本組研究還發現在診斷膀胱癌方面具有較高的診斷效能，具有較高的靈敏度和特異度。并且隨訪3年發現存活組病人尿液miRNA-375表達水平明顯低于死亡組，并發現尿液miRNA-375表達在預測3年內出現死亡具有較高的特異度和靈敏度，故當尿液中miRNA-375表達＞4.829，其出現3年內死亡的可能性明顯增加，故這部分病人是否采取進一步的干預措施，以降低膀胱癌病人的3年內死亡率。

miR-145-5p 在多種腫瘤細胞中出現表達失調，并作為腫瘤的抑制基因調節腫瘤的增殖轉移和上皮間質轉化［12］。在非小細胞肺癌中的表達明顯低于正常肺組織，并且發現其具有抑制上皮間質轉化的作用［13］；在另一項研究中發現miR-145-5p具有明顯抑制食管癌細胞的侵襲和轉移，并發現與核因子和特異度蛋白1具有明顯關系［14］。在肝癌的研究中發現miR-145-5p對肝癌細胞的增殖，遷移和凋亡具有明顯抑制作用［15］，說明miR-145-5p具有明顯抑制癌細胞的作用。本組研究顯示膀胱癌病人尿液中miR-145-5p表達明顯低于健康對照組，手術后較術前比較出現明顯升高，并且與腫瘤分期、淋巴結轉移和腫瘤數目具有明顯相關性，說明miR-145-5p參與了膀胱癌的發生發展，具有明顯抑癌作用。現有的研究表明miR-145-5p 能夠明顯促進膀胱癌的增殖，遷移和轉移作用［16］。本組研究發現尿液中miR-145-5p表達在診斷膀胱癌具有較高的診斷效能，當尿液中miR-145-5p≤1.225，其診斷膀胱癌具有較高的靈敏度和特異度。膀胱癌死亡組尿液miR-145-5p 表達明顯低于存活組，并且在診斷3年內出現死亡具有較高特異度和靈敏度，但尿液中miR-145-5p表達≤1.225 具有3年內具有較高出現死亡的風險。本組研究發現miRNA-375 和miR-145-5p 分別類似促癌基因和抑癌基因的功能，兩者在膀胱癌中的表達存在某種平衡，并且發現兩者聯合檢測在診斷膀胱癌具有較單一指標檢測更高的靈敏度和特異度，其靈敏度87.5%，特異度93.3%，曲線下面積0.959，說明聯合miRNA-375 和miR-145-5p 指標在診斷miR-145-5p膀胱癌明顯提高診斷效能。在預測3年內出現死亡方面，尿液中miRNA-375和miR-145-5p表達具有較高的效能，聯合兩個指標并不能提高預測效能。本組通過尿液聯合檢測miRNA-375和miR-145-5p對膀胱癌診斷和預后具有一定的優勢：尿液標本容易獲得，并且能夠反復獲得，可用作對膀胱癌術后的動態監測；取標本為無創，病人依從性強；本組聯合檢測，較單個指標檢測比較明顯提高診斷效能。本研究采用qRT-PCR檢測，需要一定的實驗儀器，對基層醫院的推廣有一定的難度。

總之，miRNA-375和miR-145-5p參與了膀胱癌的發生發展，尿液中的miRNA-375和miR-145-5p檢測對于膀胱癌的診斷和預后判斷具有重要臨床價值。