不同臨床病理特征非小細胞肺癌中miR-1269 的表達及其對細胞周期的靶向調控作用

詹莉瓊，盧晏民，崔杰

作者單位：商丘市第一人民醫院，a呼吸與危重癥醫學科，b腫瘤三科，河南 商丘476000

肺癌的發病率和死亡率在世界范圍內位居首位，其中非小細胞肺癌（NSCLC）是肺癌最常見的病理類型，我國NSCLC 的發病率也呈成年升高的趨勢，但早期診斷率并不高、多數病人就診時已達中晚期并錯過了最佳治療時機［1-2］。雖然近年來分子靶向藥物的不斷問世使NSCLC 病人的生存情況得到改善，但病人的長期生存率仍較低，亟需探尋新的治療靶點。miR-1269 是具有促癌特性的miR，已經在肝癌細胞和肺癌細胞中被證實能夠靶向抑癌基因FOXO1的表達，進而促進癌細胞的增殖、遷移、侵襲［3-4］。FOXO1在NSCLC 的發生發展過程中起到抑癌作用，能夠靶向抑制細胞周期蛋白（Cyclin）D1的表達、增加細胞周期負性調控分子p21Cip1、p27Kip1的表達，進而使細胞周期發生停滯［5-7］。但是，miR-1269 在NSCLC 病灶內的變化及其與細胞周期的調控作用均未明確。為此，本研究具體分析了不同病理特征非小細胞肺癌中miR-1269 的表達及其對細胞周期的靶向調控作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2015年3月至2018年12月商丘市第一人民醫院手術切除的NSCLC 病灶和對應的癌旁病灶 58 例，其中男性 32 例、女性 26 例，年齡（51.31±8.42）歲，年齡范圍為41～64 歲。入組標準：（1）經術后病理診斷為NSCLC；（2）臨床資料完整；（3）術前未接受過放化療。本研究符合《世界醫學協會赫爾辛基宣言》相關要求。病人或近親屬對研究方案簽署知情同意書。

1.2 細胞及試劑 miRNA 提取試劑盒、miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒、miRNA 熒光定量PCR 檢測試劑盒購自北京天根公司，肺癌A549細胞株購自中科院上海細胞資源中心，miR-1269的模擬物和抑制物購自上海吉瑪公司，蛋白裂解液及BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司，CyclinD1、CDK4、CDK6、p21Cip1、p27Kip1的單克隆抗體購自Abcam公司。

1.3 儀器 光定量PCR 儀購自Bio-rad 公司，細胞培養箱和高速離心機購自Thermo公司，倒置顯微鏡購自Nikon公司，凝膠成像儀購自上海天能公司。

1.4 miR-1269表達量的檢測 取NSCLC病灶和癌旁病灶，采用miRNA 提取試劑盒進行操作、提取組織中的miRNA，采用miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒進行操作、將miRNA反轉錄為cDNA；采用miRNA熒光定量PCR 檢測試劑盒配置應該定量PCR 反應體系，對 cDNA 中的 miR-1269 及 U6 進行擴增，根據擴增循環曲線及循環閾值、以U6為內參、計算miR-1269的表達量。

1.5 細胞培養及分組 A549細胞用含有10%胎牛血清的DMEM在培養瓶中貼壁培養，細胞鋪滿底面90%后用0.125%的胰蛋白酶進行消化傳代，得到足夠數量的細胞后接種在培養板中并進行分組處理。空白對照組用DMEM 處理，NC 模擬物組轉染NC 模擬物、miR-1269模擬物組轉染miR-1269模擬物、NC抑制物組轉染NC 抑制物、miR-1269 抑制物組轉染miR-1269抑制物。

1.6 細胞周期蛋白表達的檢測 采用蛋白裂解液提取NSCLC病灶、癌旁病灶、轉染后A549細胞中的蛋白，經BCA試劑盒測定總蛋白含量后取30～50μg總蛋白進行檢測，將蛋白樣本加入預先配置好的聚丙烯酰胺凝膠中，電泳后將凝膠中的蛋白樣本電轉移至NC 膜，用5%脫脂牛奶在室溫封閉NC 膜2 h，洗膜3 遍后用 CyclinD1、CDK4、CDK6、p21Cip1、p27Kip1的單克隆抗體在4 ℃孵育NC膜過夜；第二天，洗膜3遍后用第二抗體在室溫孵育NC 膜2 h，最后在凝膠成像儀中曝光得到蛋白條帶，根據條帶灰度值計算蛋白表達量

1.7 統計學方法 采用SPSS20.0 軟件錄入數據。兩組間計量資料的比較采用t檢驗，配對組間比較行配對t檢驗，多組間比較行單因素方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 不同病理特征非小細胞肺癌中miR-1269表達的變化 SCLC病灶中miR-1269的表達量明顯高于癌旁病灶（P＜0.05）；低未分化NSCLC 病灶中miR-1269 的表達量明顯高于高中分化NSCLC 病灶（P＜0.05）；有淋巴結轉移的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達量明顯高于無淋巴結轉移的NSCLC 病灶（P＜0.05）；有脈管浸潤的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達量明顯高于無脈管浸潤的NSCLC 病灶（P＜0.05）；有胸膜侵犯的 NSCLC 病灶中 miR-1269 的表達量明顯高于無胸膜侵犯的NSCLC 病灶（P＜0.05）。見表1。

表1 不同病理特征非小細胞肺癌（NSCLC）中miR-1269表達的變化

2.2 肺癌中細胞周期蛋白表達的變化及其與miR-1269 的相關性 NSCLC 病灶中 CyclinD1、CDK4、CDK6的表達量明顯高于癌旁病灶，p21Cip1、p27Kip1的表達量明顯低于癌旁病灶（P＜0.05）；NSCLC病灶中miR-1269 的表達量與 CyclinD1、CDK4、CDK6 的表達量呈正相關，與p21Cip1、p27Kip1的表達量呈負相關。見圖1、表2。

表2 非小細胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶內細胞周期蛋白表達的比較/

表2 非小細胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶內細胞周期蛋白表達的比較/

注：配對t檢驗，CyclinD1為細胞周期蛋白D1

p21Cip1p27Kip1例數58 58組織來源癌旁NSCLC t 值P 值CyclinD1 0.58±0.10 0.31±0.07 15.527 0.000 CDK4 1.09±0.22 0.52±0.07 17.037 0.000 CDK6 0.73±0.16 0.25±0.05 22.318 0.000 0.52±0.08 0.70±0.13 8.282 0.000 0.58±0.09 0.85±0.15 6.895 0.000

圖1 非小細胞肺癌（NSCLC）病灶及癌旁病灶內細胞周期蛋白的條帶圖 圖2 空白對照組、NC模擬物、miR-1269模擬物組細胞周期蛋白的條帶圖 圖3 空白對照組、NC抑制物組、miR-1269抑制物細胞周期蛋白的條帶圖

2.3 miR-1269 模擬物和抑制物對A549 細胞中細胞周期蛋白表達的調節 miR1269 模擬物組A549細胞中CyclinD1、CDK4、CDK6的表達量明顯高于空白對照組、NC 模擬物組，p21Cip1、p27Kip1的表達量明顯低于空白對照組、NC 模擬物組（P＜0.05）；miR1269 抑制物組 A549 細胞中 CyclinD1、CDK4、CDK6 的表達量明顯低于空白對照組、NC 抑制物組，p21Cip1、p27Kip1的表達量明顯高于空白對照組、NC抑制物組（P＜0.05）。見圖2，3；表3，4。

3 討論

miR-1269是具有促癌特性的miR-1269，已經被證實在肝癌病人外周血及肝癌病灶內均呈高表達的趨勢［8-9］；另有細胞實驗證實，miR-1269對肺癌細胞的增殖、遷移、侵襲具有促進作用［4］。在本研究中，NSCLC 病灶內miR-1269 的表達量明顯升高，結合miR-1269在體外促進癌細胞增殖、遷移、侵襲的活性分析認為，miR-1269的高表達與NSCLC的發生有關且病灶內高表達的miR-1269 能夠通過改變癌細胞的生物學行為來促進腫瘤病理進程的發展。本研究進一步對不同病理特征NSCLC 病灶內miR-1269 表達量的變化進行了分析，低未分化、有淋巴結轉移、有脈管浸潤、有胸膜侵犯的NSCLC病灶中miR-1269的表達量明顯升高，說明NSCLC 病灶內高表達的miR-1269能夠使腫瘤病理特征發生惡化，分化程度明顯降低且發生淋巴結轉移、脈管浸潤、胸膜侵犯。

表3 miR-1269模擬物對A549細胞中細胞周期蛋白表達的調節（n=5，）

表3 miR-1269模擬物對A549細胞中細胞周期蛋白表達的調節（n=5，）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與NC模擬物組比較，bP＜0.05，CyclinD1為細胞周期蛋白D1

組別空白對照組NC 模擬物組miR-1269 模擬物組F 值P 值p27Kip1 0.66±0.13 0.71±0.12 0.32±0.05ab 19.985 0.000 CyclinD1 0.48±0.06 0.51±0.07 0.77±0.15ab 12.306 0.001 CDK4 0.85±0.14 0.89±0.15 1.21±0.19ab 8.157 0.006 CDK6 0.50±0.07 0.48±0.05 0.71±0.09ab 15.710 0.001 p21Cip1 0.73±0.14 0.77±0.08 0.45±0.05ab 16.000 0.000

表4 miR-1269抑制物對A549細胞中細胞周期蛋白表達的調節（n=5，）

表4 miR-1269抑制物對A549細胞中細胞周期蛋白表達的調節（n=5，）

注：與空白對照組比較，aP＜0.05；與NC模擬物組比較，bP＜0.05，CyclinD1為細胞周期蛋白D1

組別空白對照組NC 抑制物組miR-1269 抑制物組F 值P 值p27Kip1 0.71±0.13 0.73±0.11 1.13±0.18ab 13.713 0.001 CyclinD1 0.71±0.12 0.77±0.11 0.32±0.05ab 30.879 0.000 CDK4 0.80±0.12 0.83±0.14 0.33±0.07ab 30.321 0.000 CDK6 0.73±0.12 0.79±0.13 0.41±0.08ab 16.605 0.000 p21Cip1 0.33±0.05 0.36±0.07 0.84±0.14ab 45.500 0.000

miRs 是一類不具備編碼蛋白質功能的小分子RNA，通過結合靶基因mRNA 來使mRNA 降解或阻礙mRNA 翻譯，進而改變靶基因表達水平并產生相應的生物學效應［10-11］。FOXO1 是 miR-1269 的靶基因之一，該基因參與細胞周期的調控，一方面通過抑制cyclinD1 的表達并阻礙cyclinD1 與CDK4、CDK6的結合來使細胞周期停滯［12-13］，另一方面增加p21Cip1、p27Kip1的表達并增強兩種分子對細胞周期的阻礙作用，兩方面共同起效并實現對細胞周期的抑制［14-15］。在本研究中，細胞周期正性調控分子cyclinD1、CDK4、CDK6在NSCLC病灶內表達增多且與miR-1269 呈負相關，而細胞周期負性調控分子p21Cip1、p27Kip1在 NSCLC 病灶內表達減少且與 miR-1269呈正相關，說明細胞周期蛋白在NSCLC病灶內發生顯著變化且這一變化可能受到miR-1269 的調控，miR-1269 通過靶向抑制FOXO1 的表達來削弱FOXO1對細胞周期蛋白的調控作用，進而使NSCLC病灶內細胞周期蛋白的表達發生變化。

為了進一步驗證miR-1269 在NSCLC 病灶內對cyclinD1、CDK4、CDK6 及 p21Cip1、p27Kip1等細胞周期蛋白的調控作用，本研究在以上臨床樣本研究的基礎上設計了細胞實驗，在培養肺癌細胞A549 后將miR-1269的模擬物和抑制物轉染進入細胞，分別實現miR-1269生物學效應的增強及抑制，通過分析模擬物和抑制物對細胞周期蛋白表達的影響來反應miR-1269對細胞周期表達的調控作用。在轉染miR-1269模擬物后，A549細胞中cyclinD1、CDK4、CDK6的表達明顯增多，而p21Cip1、p27Kip1的表達明顯減少；在轉染miR-1269 抑制物后，A549 細胞中cyclinD1、CDK4、CDK6的表達明顯減少，而p21Cip1、p27Kip1的表達明顯增多。以上細胞實驗的研究表明，miR-1269能夠靶向調控肺癌細胞中多種細胞周期蛋白的表達，使細胞周期正性調控分子cyclinD1、CDK4、CDK6 的表達增多，而細胞周期負性調控分子p21Cip1、p27Kip1的表達減少。

綜上所述，miR-1269在NSCLC中呈顯著高表達趨勢且高表達的miR-1269 與NSCLC 病理特征的變化、細胞周期蛋白表達的變化均密切相關；miR-1269 能夠在體外細胞中靶向調節多種細胞周期蛋白的表達。今后可進一步設計NSCLC荷瘤小鼠，抑制miR-1269表達后觀察腫瘤的生長情況，進而探究抑制miR-1269在NSCLC治療中的潛在價值。