水稻東野型不育系異交不親和性的鑒定和遺傳分析

熊濤 聶元元 毛方明 雷建國 毛凌華 朱珊 黃仁良 沈顯華,* 嚴松,,*

（1 江西省農業科學院 江西省超級水稻研究發展中心 南昌 330200；2 江西省農業科學院 科技管理處 南昌 330200；3 江西省農業科學院 水稻研究所 南昌 330200；#共同第一作者；*通信聯系人，E-mail: yans11@163.com；shen_xh20000913@126.com）

在自然界中，自交不親和性廣泛存在，超過60%的被子植物具有這種特征，它有利于異花傳粉，從而促進遺傳多樣性。與自交不親和對應的異交不親和，其存在更為廣泛。異交不親和性主要存在于異種、異屬間，親緣關系越遠，不親和性越高，即異交不親和是物種穩定的重要保障[1]。植物異交不親和一般發生在遠緣種間，種內異交不親和則比較罕見。從應用角度來看，發掘種內異交不親和資源并闡明其遺傳機制，頗具應用前景。將異交不親和基因導入自然品種中，可作為不含該基因的品種（包括轉基因）生產繁殖的隔離材料使用；將不親和基因和親和基因分別導入不育系和恢復系，而周邊種植不含親和基因的材料，則可實現雜交種制種的生物學隔離。然而在雜交稻育種中，種內的異交不親和卻是影響繁種、制種產量以及生產成本最大的因素之一。

目前，在植物自交不親和性研究方面已取得一系列重要進展[2-4]，而對于異交不親和性的研究還比較薄弱，主要因為異交不親和性的遺傳研究相對較難。如果不親和在兩個親本中是雙向的，就不能產生后代進行遺傳研究，只有單向方可進行[5]。

在禾本科作物中，已在玉米和水稻上發現有單向異交不親和現象。玉米上發現異交不親和可以追溯到一百多年前，1902 年科學家Correns 發現第一個異交不親和基因Ga1[6]，1936 年Burnham 報道了Ga2[7]，之后Ga3～Ga10及Tcb1等多個單向異交不親和位點陸續被發現[5,8]，目前僅Ga1被克隆報道。Zhang等對Ga1位點中的雄性控制基因ZmGa1P進行克隆和功能驗證，發現ZmGa1P編碼一個在Ga1-S和Ga1-M型玉米自交系花藥中特異表達的果膠甲酯酶，ZmGa1P位于花粉管頂端，與另一個花粉管特異表達的 PME 蛋白互作，共同維持花粉管正常的甲酯化修飾程度，以保障花粉管在Ga1-S型花絲中的正常伸長，最終受精結實[9]。

作為自花授粉的水稻，異交不親和主要發生在遠緣野生種和栽培種以及不同染色體組的野生種之間，這也是生殖隔離的一種表現。2003 年Matsubara 等[10]報道了野生稻和栽培稻異交不親和的遺傳現象，通過正反交試驗發現單向異交不親和由來自母本 W593A 的Cif基因和來自父本 T65wx的cim互作產生，與玉米相似，Cif花粉能給隱性純合的cim母本授粉結實，而cim花粉不能給顯性純合的Cif母本授粉結實，兩者都被定位在第6 染色體上，分別位于短臂和著絲粒附近。2008 年，他們進一步研究發現Cif其實存在兩個不連鎖的位點Cif1和Cif2，都在第6 染色體上，Cif1被定位在標記R2291 和 RM204 之間 0.67 Mb 的區段上，Cif2定位在RG264 和RM3498 之間，兩標記相距約18 cM，涵蓋著絲粒區域，與Cim位置相近[11]。可能因分解難度大，之后未有新進展報道。

我們在東鄉野生稻利用過程中，也發現了異交不親和現象。20 世紀80 年代，江西省農業科學院水稻研究所以東鄉野生稻為細胞質源，采用野栽交和核置換的方法，培育出具有全新恢保關系的東野型雄性不育系[12]，之后通過多年大量測交試驗，直至近年實現三系配套[13]。然而，在東野型不育系培育過程中，發現部分保持系品種與不育系存在異交不親和現象，這些品種在雜交或回交時，不育株系的異交結實率很低，甚至為零而不能繼續轉育。針對該現象開展了初步研究，通過構建不同核質背景的材料，探索東野型不育系異交不親和性的形成原因，進而對該性狀進行遺傳分析和基因初步定位。

1 材料與方法

1.1 材料

以東野型不育系DY1A及其保持系早秈稻中早35[13]為主要材料。其余水稻材料有粳稻品種02428、秀水 123，秈稻野敗型保持系Ⅱ-32B、金 23B、五豐B，恢復系華占、R668、廣恢308 和93-11。

利用染色體單片段代換系研究異交不親和性，該單片段代換系由 Ando 等[14]構建，以粳稻品種Sasanishiki 為輪回受體、秈稻品種Habataki 為供體，共有 39 個系[14]。

1.2 田間試驗

2014?2019 年，在江西省農業科學院的江西南昌和海南三亞兩處試驗基地種植，每個材料種植 6行，每行8 株，株間距為15 cm×20 cm，田間常規水肥管理。

在不育系盛花期，傍晚將不育系穎殼剪去 1/3至 1/2，保留完整雌蕊，次日取父本花粉對它充分授粉，套袋防止串粉。對同一組雜交，每個父本做3 個套袋，每個雜交套袋用2~3 穗不育系。

1.3 性狀考查

授粉后15~25 d，考查結實率。結實率(%)=實粒數/總粒數×100，取各穗結實率的平均值，利用Excel 2016 進行數據處理與分析。

1.4 基因定位分析

根據代換系群體遺傳圖譜，結合表型數據對基因進行定位，遺傳距離用centiMorgan（cM）表示。

2 結果與分析

2.1 東野型不育系異交不親和性的產生

我們通過分別構建同質異核系和同核異質系，初步探討東野型不育系異交不親和性形成的原因。

首先，我們進行了同質異核系雜交試驗，發現所使用的東野型不育系DY1A，在與保持系中早35回交轉育過程中未發現不親和性。以DY1A 為胞質供體，利用 3 個粳稻(Sasanishiki、02428 和秀水 123)以及 8 個秈稻(Habataki、廣恢 308、R668、93-11、華占、II-32B、金23B、五豐B)為輪回父本進行不育系轉育。在雜交當代，Sasanishiki 對DY1A 表現顯著的不親和性，F0結實率僅1.5%，其余10 份材料與 DY1A 雜交結實正常（>75%）。值得一提的是，東野型敗育胞質具有廣保性，所有F1植株的花粉育性和結實率均為0。接下來，在回交第1 代，02428、秀水123、華占、93-11、廣恢308、金23B和五豐B 這7 份材料對DY1A 的雜交結實率顯著下降（回交時對每個父本只做了3 個套袋的回交，所選擇的回交單株數不大于 3，各回交世代僅計算平均結實率，未能統計分離比）；回交第2 代時，它們的雜交結實率繼續下降。只有Habataki、R668 和Ⅱ-32B 這3 份材料能夠正常轉育，各回交世代結實正常（表1）。由此得知：1）東野型不育系存在異交不親和現象；2）東野型不育系的異交親和性受核遺傳背景影響。

我們也進行了同核異質系雜交試驗。在上述回交轉育過程中，金23B 和五豐B 與DY1A 在BC2F0的結實率分別為5.3%和17.7%，進一步回交，BC3F0的結實率分別為4.5%和2.2%（表1），表現典型的異交不親和性。而含有野敗型敗育胞質的同核異質系金23A 和五豐A 與各自保持系雜交結實正常，表明東野型不育系的異交不親和性存在細胞質效應。

此外，針對上述Sasanishiki 與DY1A 在雜交當代不親和，也進行了同核異質雜交試驗，仍以Sasanishiki 為父本，DY1A 的異質保持系中早35 作母本，結果它們雜交結實正常，可見兩者的細胞核是親和的，進一步說明東野型不育系的細胞質影響了異交親和性。

綜合以上結果，明確了東野型不育系的異交不親和性由核質互作產生。

2.2 東野型不育系雜交不親和類型

根據上述雜交試驗發現，東野型不育系的異交不親和性存在兩種類型，第一種類型（Ⅰ）發生在雜交當代，以Sasanishiki 為代表。第二種類型（Ⅱ）發生在回交世代，代表品種有 02428、華占等，在BC1F0時它們就表現出部分不親和，且觀察到結實率有分離，隨著回交世代增加，不親和性逐漸凸顯。

2.3 利用單片段代換系研究異交不親和性Ⅰ

將 Sasanishiki 和 Habataki 與 DY1A 雜交，兩者的親和性截然相反，前者不親和，后者親和。進而將它們衍生的一套染色體單片段代換系SL401-SL439 分別與DY1A 雜交，統計結實率。結果，篩選到2 個雜交親和的代換系(SL426 和SL427)，雜交結實率均在80%以上，完全正常（圖1）。其余代換系與DY1A 雜交結實率均不足10%，大部分代換系雜交幾乎不結實。表明Habataki 與DY1A 雜交的親和性有主效因子作用，且位于 SL426 和SL427 所攜帶的代換片段上。

2.4 異交不親和性Ⅰ的遺傳方式

利用親和代換系 SL426 與 Sasanishiki 的 F1及與Sasanishiki 回交的BC1F1分別與DY1A 雜交來分析異交不親和性Ⅰ的遺傳行為，結果，F1與DY1A雜交結實率為35.9%，表現中間型。BC1F1共35 株與DY1A 雜交，結實率表現為差（<5%）和中間型（30%~40%）兩種情況，差和中間型兩種表型株數分別是17 和18 株，符合1∶1 分離，初步推測該類型的異交不親和性Ⅰ在細胞核內受單隱性基因控制，暫命名為CI1(t)。F1與 DY1A 雜交的結實率為中間型，說明CI1(t)的作用可能存在劑量效應。

表1 東野型不育系DY1A與11個品種雜交/回交的結實情況Table 1. Seed setting rates of the DW-type CMS DY1A crossing/backcrossing with 11 varieties.

圖 1 DY1A 分別與 Sasanishiki、SL426 和 SL427 雜交的結實情況Fig. 1. Seed setting performances of DY1A crossing with Sasanishiki, SL426 and SL427, respectively.

2.5 初步定位CI1(t)

根據染色體代換系的遺傳圖譜[14]，第8 染色體有4 個單片段代換系，依次為SL425、SL426、SL427和SL428，SL425 與后三者不重疊，SL427 與前后相鄰的代換系SL426和SL428均有重疊片段。其中，SL426 含從 RM6838 到 RM3395 的片段，SL427 覆蓋RM3395－RM5891，兩者在RM3395 所在位置重疊；SL428 覆蓋 RM5767－RM4997，與 SL427 除RM3395 以外的片段重疊。此外，在其他染色體上，SL426 還含有第 5 染色體 RM6517、SL427 含有第 6染色體RM5957、SL428 含有第2 染色體RM3316和第 3 染色體 RM5442 的小片段，這些片段來自Habataki。第 2、3、5 和 6 染色體的代換系以及 SL428與 DY1A 雜交，結實率表型都與輪回親本Sasanishiki 相似，幾乎不結實，僅 SL426、SL427及供體親本Habataki 三者與DY1A 雜交結實正常，因此，將CI1(t)初步定位在 SL426 和SL427 的重疊區域，位于RM6838 和RM5767 兩個標記之間，與RM3395 連鎖（圖2），前后兩標記相距18.3 cM，物理距離約12 Mb，為精細定位奠定了基礎。

圖2 CI1(t)在第8 染色體上的初步定位Fig. 2. Rough mapping of of CI1(t) on chromosome 8.

3 討論

Matsubara 等[10]報道的水稻單向異交不親和僅受核基因控制，授粉后種子發育退化或皺縮，本研究中的表型與它有所區別，東野型不育系的異交不親和表現為結實率低或不結實，而且是一種新類型——由核質基因互作產生。我們熟知的植物遠緣雜交不親和，可能有一些就是由核質互作產生的。

此前我們利用分子標記通過對東鄉野生稻居群檢測發現，只有部分株系含有東野型敗育細胞質[15]，因而推測東野型不育系存在的異交不親和性，可能是含此類細胞質的東鄉野生稻血緣的一種自我保護機制，即這些野生稻株系擁有特定的細胞質基因，其他資源與它們雜交，需要帶有與這類細胞質信號相匹配的親和核基因，才能實現基因交流。

相比秈稻，我們發現粳稻在與東野型不育系雜交/回交的較早世代就表現不親和性。在東野型三系雜交稻育種過程中，我們選用的粳稻品種（>50 份）轉育東野型不育系最終幾乎全部表現不親和，而秈稻卻有少數品種完全親和，表明東野型三系體系不適用于粳稻，而在秈稻上距離生產應用仍有很長的路要走，當務之急是解決東野型不育系異交不親和性的瓶頸問題。

本研究發現的兩種不親和性發生在不同雜交世代，說明它們各自的控制基因可能不同。第一種類型在雜交當代出現，受單隱性基因控制，并利用單片段代換系群體將其定位在第8 染色體SSR 標記RM6838 和RM5767 之間，覆蓋著絲粒區域，對后續精細定位有一定難度。第二種類型的不親和性在回交一代時初步體現，回交至第二或第三代時徹底顯現，推測它的遺傳方式也不復雜，在育種應用中對它們進行遺傳改良應是可行的。

目前對水稻異交不親和性的研究比較滯后，主要有兩方面原因。一是主觀因素，科研人員對這類性狀認識不足，即便遇到也可能誤以為雜交沒有做好而忽視，因此相關研究報道非常少。眾所周知，手工雜交的結實率比不上自交。本研究中，DY1A與不同品種雜交、回交的結實率變幅很大（0%~88.6%），其中不乏手工雜交沒有做好的情況。實際上，影響雜交結實率的因素較多，比如授粉時的花粉數量和質量等，所以在后續基因定位過程中，將雜交做好從而準確鑒定表型十分關鍵。另一方面是客觀原因，異交不親和不同于其他農藝性狀，它需要通過雜交試驗來判斷表型，比對一般農藝性狀的觀測多一道程序，若當代雜交失敗就意味著要多一個世代來確定表型，而且對于純合與雜合表型區分不開的情況還需要利用后代家系去鑒定。不管怎樣，挖掘異交不親和材料加以研究，無論對理論還是應用研究都很有價值。