氮添加對不同林齡楊樹人工林叢枝菌根真菌群落的影響

胡家欣，彭思利，張棟，葛之葳，楊楠

南方現代林業協同創新中心/南京林業大學生物與環境學院，江蘇 南京 210037

氮沉降增加會導致陸地生態系統發生一系列的變化，如土壤酸化、生物多樣性（Stevens et al.，2004；Bobbink et al.，2010）和微生物群落結構改變（Mohan et al.，2014），進而影響陸地生態系統生物地球化學循環過程（Matulich et al.，2015）。它是人類面臨的全球性問題之一，其引發的一系列環境問題已成為當前國際生態學研究的熱點（Janssens et al.，2010）。叢枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）能與大部分高等植物的根系形成共生關系（Brundrett，2009；宋培玲等，2013），進行重要的物質和能量交換。植物將光合產物以碳源形式傳輸給AMF，AMF通過其強大的菌絲網絡為植物吸收更多的營養物質和水分，參與土壤碳、氮、磷等多種元素的生物地球化學循環（王浩等，2018）。當土壤中氮素含量較低時，植物往往依賴菌根吸收氮素；而當土壤氮素含量增加后，植物自身吸收氮素的成本降低，提供給AMF碳水化合物的成本高于自身吸收氮素消耗的成本，對菌根的依賴性就會減弱，根系侵染受到影響（Carbonnel et al.，2014）。當土壤氮含量改變時，植物與AMF間的博弈關系發生改變，不同類群AMF可能會被選擇性地保留或抑制，最終AMF群落結構組成改變，如巨孢囊霉屬AMF形成巨大的孢子，孢子萌發需要大量的碳水化合物，其發育易受到抑制；而球囊霉屬AMF產生的孢子較小，對光合產物的需求較少（藺吉祥等，2015），可能會被選擇性地保留下來。土壤氮素含量變化對AMF的影響還與土壤養分狀況、氮沉降濃度和宿主植物或生態系統類型等因素有關（Treseder，2004；Mohan et al.，2014）。

楊樹是典型的叢枝菌根植物（Neville et al.，2002），江蘇省是中國楊樹人工林分布的主要區域之一。本研究以江蘇省東臺試驗林場楊樹人工林為研究對象，基于野外長期模擬氮沉降樣地，利用傳統染色和高通量測序技術，分析不同氮沉降處理對楊樹-AMF共生關系、分泌物和AMF群落結構組成差異及其與環境因子的關系，揭示氮沉降對楊樹人工林叢枝菌根真菌群落的影響，為氮沉降增加背景下楊樹人工林養分循環等生態過程研究提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗樣地位于江蘇省鹽城市東臺林場（120°07′—120°53′E，32°33′—32°57′N），楊樹人工林占地面積達 2000 hm2，屬北亞熱帶季風氣候，年均氣溫14.6 ℃，相對濕度為88.3%，無霜期為220 d，平均日照時數為2169.6 h，年太陽輻射總量為493.5 J·cm-2，年均降水量 1059.8 mm。地處長江中下游沖積平原，土質為砂質壤土，弱堿性。

1.2 試驗設計與樣品采集

試驗樣地設立于2012年5月，采用人工施氮模擬大氣氮沉降。選擇2007年（11 a）和2003年（15 a）營造的楊樹（黑楊派無性系 I35，Populus deltoidesCL‘35’）人工林，設置3個重復樣地（樣地大小為20 m×90 m）。采用隨機區組設計，每個樣地設置5個氮水平樣方（樣方大小為10 m×20 m），每個樣方之間設置10 m的緩沖帶。參照該地區大氣氮沉降量 6.3—12.6 kg·hm-2·a-1（鄭丹楠等，2014），設置5個施氮水平，分別為0、5、10、15、30 g·m-2·a-1（以 N 計），即為對照（N0）、低氮（N1）、中氮（N2）、高氮（N3）和超高氮（N4）。2個齡級和5個施氮水平共計30個樣方。在樣地設立后，每年于楊樹的生長季（5—10月）進行5個水平的氮添加處理：將每個處理樣方所需的NH4NO3溶解在20 L水中（相當于0.027 mm降水），人工均勻灑入，對照處理噴灑等量的水。

2018年10月，在每個樣方中隨機選擇生長一致的楊樹5棵，分別從東南西北4個方向采集根系（選取直徑＜2 mm細根）和土壤樣品（根際土壤為根系抖落后的土壤，在野外迅速過2 mm篩）。將5棵樹的根系和根際土壤分別混合均勻再取樣，放入自封袋中，保溫箱冷藏帶回實驗室備用。3次重復，共獲得 2(齡級)×5(氮水平)×3(重復)=30 個樣品。

根系樣品置于0.25 mm的篩子上，自來水下沖洗干凈，剪成約1 cm的根段后混勻，取約1 g用于根系侵染率的測定。土壤樣品取約 50 g，放入-80 ℃冰箱，用于真菌群落結構的測定；另取約150 g風干，用于土壤基本理化性質的測定。

1.3 土壤理化性質和根系-AMF共生關系的測定

土壤含水率用鮮土烘干法測定；pH值采用玻璃電極法測定（1:5土水比）；土壤總碳（TC）、總氮（TN）使用元素分析儀（Elemental Analyzer，Perkin Elmer 2400 Ⅱ，USA）測定；土壤總磷（TP）和速效磷（AP）測定采用鉬銻抗比色法；硝態氮（NO3--N）和銨態氮（NH4+-N）采用紫外分光光度法和靛酚藍比色法測定（魯如坤，2000）。根系-AMF共生關系用根系侵染率和 AMF分泌物球囊霉素（Glomalin-related soil protein，GRSP）含量表示；根系侵染率采用網格交叉法測定（McGonigle et al.，1990）；總球囊霉素相關土壤蛋白（T-GRSP）和易提取球囊霉素相關土壤蛋白（EE-GRSP）依據Wright et al.（1998）的方法測定。

1.4 AMF群落結構和多樣性的測定

AMF群落結構組成采用Illimina Miseq高通量測序技術測定。稱取0.5 g冷凍土樣，用Fast DNA SPIN Kit for soil（MP，USA）試劑盒，按照說明書進行總DNA抽提，以Nano Drop 2000進行DNA濃度和純度的檢測；以AML1F/AML2R（Lee et al.，2008）和 AMV4-5NF/AMDGR（Van Geel et al.，2014）進行兩輪PCR擴增（ABI Gene Amp? 9700型）。擴增的 PCR產物以 Axy Prep DNA Gel Extraction Kit（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）純化后，利用 Quanti Fluor?-ST（Promega，USA）進行定量檢測；利用Illumina公司的Miseq PE250平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。將測序后的數據去除非目的序列，再以軟件Usearch歸類操作，依據序列相似性（相似性水平 97%）歸為不同的分類操作單元（OTU），計算AMF群落豐富度指數（Chao指數）和多樣性指數（Simpson指數），并根據silva庫中的參考序列對OTU進行種屬鑒定，在屬（genus）和種（species）分類水平統計各樣本的群落組成。

1.5 統計分析

運用SPSS 22.0對不同氮添加處理間的各項指標進行單因素方差分析（One-way ANOVA），用多重比較法（LSD）進行差異顯著性檢驗，顯著水平為0.05；用Pearson相關系數評價根系-AMF共生關系與土壤理化性質的相關關系；采用R語言vegan軟件包對 AMF群落結構進行非度量多維度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS），并采用 ANOSIM 進行差異顯著性分析；用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）分析AMF群落結構與環境因子的關系，并用Monte Carlo進行顯著性檢驗。最后用Origin 2019作圖。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質

不同氮添加水平下楊樹人工林土壤理化性質如表 1所示。不同氮添加對土壤 pH和硝態氮（NO3--N）質量分數有顯著影響（P＜0.05），而土壤全氮（TN）、全磷（TP）和速效磷（AP）在兩個齡級的楊樹人工林中均無顯著性變化。氮添加顯著增加了 NO3--N質量分數，但降低了土壤銨態氮（NH4+-N）質量分數。隨著氮添加水平的增加，土壤pH值呈現上升趨勢。兩種齡級人工林土壤總碳（TC）和碳氮比（C/N比）對氮添加的響應不一致：11 a楊樹人工林土壤TC質量分數無顯著變化，而15 a的在氮處理間差異性顯著，N2處理TC質量分數顯著低于其他4個處理；15 a楊樹人工林土壤C/N比無顯著差異，而11 a的N3處理C/N比比其他幾個處理高出3.4—11.9倍。

2.2 根系-AMF共生關系

不同氮添加水平對楊樹根系AMF侵染率、土壤總球囊霉素（T-GRSP）和易提取球囊霉素（EE-GRSP）質量分數的影響如圖 1所示。氮處理對15 a楊樹根系AMF侵染率有顯著影響，其中，N1處理根系AMF侵染率顯著增加（圖1A），表明低濃度氮添加促進了根系-AMF的共生關系。同時，氮處理對土壤球囊霉素質量分數有顯著影響（圖1B、C）：11 a楊樹人工林土壤T-GRSP和EE-GRSP質量分數均在N4處理下達到最大值，且N3與N4之間存在顯著性差異，說明超高氮（N4）處理促進了AMF生理代謝活動；在15 a楊樹人工林中，N3處理土壤T-GRSP質量分數顯著降低，而EE-GRSP質量分數無顯著性差異。

將根系AMF侵染率、土壤T-GRSP和EE-GRSP與土壤理化性質進行相關性分析（表2），結果表明：AMF侵染率與土壤速效磷、銨態氮和全氮有較高的相關性，T-GRSP和EE-GRSP均與硝態氮有顯著正相關關系（P＜0.05）。

2.3 AMF群落結構和多樣性

30個土樣經高通量測序，對原始序列進行過濾處理，濾掉低質量序列，共得到有效 AM 真菌序列624181條（10680—24129條，平均每個樣品20806條）。對每個樣品序列進行隨機抽樣做稀釋曲線（數據未列出），所有樣本的稀釋曲線在測序量為2000—4000條時已趨于平穩，表明本研究中的土壤樣品測序深度足夠反映土壤樣本中的 AMF群落結構。所有序列分屬127個OTU，根據OTU聚類分析的結果，計算AMF群落豐富度（Chao指數）和多樣性指數（Simpson指數）。如表3所示，氮處理對兩個齡級楊樹人工林土壤AMF群落Chao指數和Simpson指數均無顯著性影響。

表1 不同氮添加水平下楊樹人工林土壤理化性質Table 1 Chemical characteristics of the poplar plantations soils under different nitrogen additions

圖1 不同氮添加水平楊樹根系AMF侵染率、楊樹人工林土壤T-GRSP和EE-GRSP質量分數Fig.1 Root infection rate of AMF, mass fraction of T-GRSP and EE-GRSP in the poplar plantations soils under different nitrogen additions

表2 根系-AMF共生關系與土壤理化性質相關性分析Table 2 Correlation coefficients between root-AMF symbiosis characteristics and the environmental factors

表3 不同氮添加水平下AMF群落豐富度和多樣性指數變化Table 3 Variation of soil AMF community richness (Chao index) and diversity (Simpson index) indexes in the poplar plantations under different nitrogen additions

將以上各AMF OTUs序列在97%相似水平進行分類學分析，楊樹人工林AMF群落分屬8屬41種，以球囊霉屬（Glomus）為主。在屬水平統計不同氮添加水平下AMF群落組成如圖2所示。氮添加對15 a楊樹人工林土壤中球囊霉屬（Glomus）和多胞囊霉屬（Diversispora）的豐度有顯著影響（P＜0.05），具體表現為：N1處理球囊霉屬（Glomus）的相對豐度顯著低于其他4個處理（P＜0.05）；與對照組相比，氮添加顯著增加了15 a人工林中多胞囊霉屬（Diversispora）的相對豐度（P＜0.05），相對豐度比其他幾個處理高出2.2—3.8倍。而在11 a楊樹人工林中，8個屬的相對豐度與其他處理間均無顯著性差異。

圖2 不同氮添加水平楊樹人工林土壤AMF群落在屬水平的物種相對豐度Fig.2 Relative abundance of the AMF groups at genus level in the poplar plantations under different nitrogen additions

在種水平統計不同氮添加水平下AMF群落組成如圖3所示。氮添加對11 a和15 a楊樹人工林土壤中Glomus-group-B-Glomus-GlBb1.2-VTX00055的相對豐度均有顯著影響（P＜0.05），其中，15 a人工林中N2處理比其他幾個處理高出2—18倍，11 a的N1處理的豐度顯著高于其他4個處理。此外，氮添加對15a楊樹人工林土壤中Glomus-mosseae-VTX00067、Glomus-Wirsel-OTU14-VTX00137、Glomus-MO-G18-VTX00064、Glomus-group-B-Glomus-lamellosu-VTX00193和Diversispora-MO-GC1-VTX00060的相對豐度有顯著影響；對11 a的Glomus-viscosum-VTX00063、Glomus-Wirsel-OTU6- VTX00202和Glomus-sp.-VTX00330的相對豐度有顯著影響。N1處理顯著增加15 a人工林土壤中Diversispora-MOGC1-VTX00060的豐度（P＜0.05），N2處理顯著增加 11 a人工林土壤Glomus-viscosum-VTX00063（P＜0.05）的豐度。與對照相比，氮添加顯著降低了15 a人工林中Glomus-mosseae-VTX00067和Glomus-MO-G18- VTX00064的豐度（P＜0.01），但Glomus-group-B-Glomus-lamellosu-VTX00193的豐度在N3和N4處理下達到最大值（P＜0.05）。而在11 a楊樹人工林中，Glomus-Wirsel-OTU6-VTX00202豐度在N3處理達到最大值且與其他處理間存在顯著性差異。

將不同氮添加處理下楊樹人工林AMF群落組成（基于OTUs）進行NMDS排序分析，結果如圖4所示。ANOSIM相似性檢驗結果表明，兩個齡級間差異顯著（R=0.3073，P＜0.05），不同氮添加處理顯著影響AMF群落組成（R=0.2734，P＜0.05），其中，15 a人工林氮添加處理間差異顯著（R=0.3141，P＜0.05）。

2.4 AMF群落結構與環境因子相關性分析

圖3 不同氮添加水平楊樹人工林土壤AMF群落在種水平的物種相對豐度Fig.3 Relative abundance of the AMF groups at specie level in the poplar plantations under different nitrogen additions

圖4 不同氮添加水平下楊樹人工林土壤AMF群落組成（基于OTUs）NMDS排序圖Fig.4 Non-metric multidimensional scaling of soil AMF community compositions (based on OTUs) in the poplar plantations under different nitrogen additions

將不同氮添加處理下楊樹人工林土壤AMF群落結構組成（基于OTUs）與8個環境因子（pH、全氮、全磷、全碳、碳氮比、速效磷、銨態氮和硝態氮）進行RDA分析，結果如圖5所示。15 a人工林 8個環境因子的解釋量為 60.47%，土壤銨態氮、總磷、硝態氮、pH是影響AMF群落結構的主要驅動因素（P＜0.05），第一排序軸主要與土壤銨態氮、總磷有關，它解釋了群落變化的22.21%，第二排序軸與硝態氮、pH密切相關，它解釋了群落變化的17.26%（圖5A）；11 a人工林8個環境因子的解釋量為53.67%，土壤pH、硝態氮、銨態氮、C/N比是影響AMF群落結構的主要驅動因素（P＜0.05），第一排序軸主要與土壤pH、硝態氮、銨態氮有關，它解釋了群落變化的 24.83%，第二排序軸與 C/N比密切相關，它解釋了群落變化的20.06%（圖5B）。

3 討論

叢枝菌根真菌（AMF）與陸生植物形成共生體后，可影響氮素的生物吸收與同化、有機氮礦化、生物固氮、硝化和反硝化，以及氮素淋洗等諸多土壤氮素循環過程（Veresoglou et al.，2012）。氮沉降增加導致的土壤氮素含量變化，將對植物-AMF共生體產生一系列顯著影響（Treseder et al.，2007）。本研究中，N1處理顯著提高了15 a楊樹根系AMF侵染率，表明低濃度的氮沉降有利于AMF生長，促進楊樹-AMF共生體形成，這與前人研究結果一致；適度的氮沉降有利于植物-AMF的共生（楊劍宇等，2013），提高AMF侵染率。許多學者認為氮添加后，銨態氮在發生硝化作用過程中會釋放出H+致使土壤發生酸化（于天一等，2014），是氮沉降抑制AMF的主要原因。本試驗樣地土壤偏堿性，土壤中的鹽基離子等堿性物質對 H+離子有一定的緩沖作用（胡波等，2015），使土壤pH值保持在弱堿性范圍；且土壤pH屬于易變指標，溫度和降水的差異可能導致土壤中生物活性和土壤含水率的變化，從而導致土壤 pH發生變化（劉廣明等，2001），使得本研究中AMF侵染率與pH值沒有顯著相關關系。此外，楊樹能夠同時與AMF和外生菌根真菌（EMF）形成共生體，AMF與EMF共存時會發生拮抗作用，EMF的優先定殖會限制AMF的侵染（Duponnois et al.，2003）。因此，在后續研究中，將AMF和EMF侵染狀況進行綜合研究。

圖5 不同氮添加水平下楊樹人工林AMF群落組成（基于OTUs）與環境因子RDA分析Fig.5 RDA for soil AMF community compositions (based on OTUs) and environment factors in the poplar plantations under different nitrogen additions

球囊霉素相關土壤蛋白（GRSP）是由AMF產生的一種含金屬離子的糖蛋白（Wright et al.，1998；He et al.，2010），能促進土壤團聚體的水穩定性，還可通過刺激微生物的繁殖影響微生物量的變化（王建等，2016）。總球囊霉素（T-GRSP）指示土壤中全部的GRSP，而易提取球囊霉素（EE-GRSP）指示AMF新分泌的部分（黃彬彬等，2019）。GRSP難溶于水，在土壤中性質極為穩定，不易被蛋白酶水解，因此能夠在土壤中不斷累積（李濤等，2005；王建等，2016）。本研究中 11 a楊樹人工林土壤T-GRSP和EE-GRSP均在N4處理下達到最大值，表明GRSP的累積和分泌量都較大（圖1B和1C），這可能與這一處理中較高的球囊霉屬（Glomus）類群豐度有關。

氮沉降在影響植物-叢枝菌根共生體的同時，還會影響AMF群落多樣性和群落組成。一些研究表明（Morrison et al.，2016；Zhang et al.，2018），大氣氮沉降對AMF多樣性有負面影響，并隨著氮沉降速率和持續時間的增加呈現下降趨勢。如Santos et al.（2006）在瑞典草地生態系統中的研究發現，施氮降低了AMF多樣性。本研究中，氮添加處理對楊樹人工林土壤AMF豐富度和多樣性指數均未產生顯著性影響，這可能與氮添加的年限有關。有研究認為，短期（＜5 a）氮沉降試驗對土壤 AMF多樣性沒有顯著性影響（雷學明等，2018），只有長期氮添加使土壤氮累積超過一個臨界點時才呈現負面效應（Egerton-Warburton et al.，2001）。本研究是在氮添加6年后進行的，土壤氮累積可能并未達到產生負面效應的臨界點。

盡管氮添加對楊樹人工林AMF多樣性未產生顯著影響，但是AMF群落結構組成卻有明顯的差異（R=0.2734，P＜0.05，圖4），這與Jumpponen et al.（2005）對高原草地生態系統的研究結果一致。不同菌根真菌在形態、生活習性和對宿主植物的效益等方面有著較大的差異，對氮添加的響應也會表現出不同（喬楓等，2018）。當宿主植物處于土壤氮素富集狀態時，會把更多的光合產物分配到植物的地上部分，由于AMF的生長發育離不開植物為之提供碳源，在氮沉降增加的條件下，對光合產物需求上的較大差異導致不同的AMF類群對氮添加產生不同響應（藺吉祥等，2015）。本研究中，氮添加顯著影響了 15 a楊樹人工林土壤中的球囊霉屬（Glomus）和多胞囊霉屬（Diversispora）AMF的相對豐度，低濃度的氮添加使得球囊霉屬相對豐度降低，多胞囊霉屬相對豐度增加，AMF群落在種水平的相對豐度也發生明顯改變，表明氮添加條件下，AMF群落結構會發生一定的改變。不過，在楊樹人工林土壤中，AMF群落結構的改變并沒有顯示很明確的方向性，這可能與宿主植物和氮添加年限有關，還需深入研究。

氮添加對AMF群落結構的影響主要是間接地通過改變土壤理化性質來實現的。AMF群落結構與環境因子的RDA分析得出，土壤銨態氮、硝態氮、pH、總磷、C/N比顯著影響著AMF群落結構組成（P＜0.05，圖 5），這與前人的研究結果一致（林昕等，2020）。但是，兩種齡級的主要驅動因子不盡相同，土壤銨態氮、硝態氮、pH均顯著影響15 a和11 a楊樹人工林AMF群落結構，此外，15 a還顯受總磷影響，11 a還受C/N比影響，表明不同齡級楊樹人工林AMF群落結構對氮添加導致的土壤理化性質改變的響應不同。AMF能幫助植物吸收水分和營養，隨著養分供應量的增加，效益與成本的平衡就發生變化，宿主植物對菌根真菌的投資會下降（Johnson et al.，1997；Konvalinková et al.，2017；王慶峰等，2018），進而表現為AMF群落結構的變化。氮添加后，土壤中的養分有效性，特別是氮磷養分狀況的變化，是影響楊樹人工林 AMF群落結構的重要因素。

4 結論

（1）氮添加對楊樹人工林根系 AMF侵染率、總球囊霉素（T-GRSP）和易提取球囊霉素（EE-GRSP）有顯著影響（P＜0.05），低氮處理促進了根系-AMF共生關系的形成，而超高水平氮處理促進了AMF生理代謝活動。氮添加處理直接改變了土壤理化性質，其對根系-AMF共生關系的影響主要是間接地通過改變土壤理化性質來實現的。

（2）氮添加對楊樹人工林土壤 AMF群落多樣性影響不顯著，但對AMF群落結構組成有顯著影響，15 a和11 a楊樹人工林AMF群落結構有顯著差異。土壤銨態氮、硝態氮、pH、總磷、ω(C)/ω(N)比是影響楊樹人工林AMF群落結構的主要因素。