淫羊藿總黃酮清除DPPH自由基的紫外-可見吸收光譜研究

姚金龍

摘要：目的? 研究淫羊藿總黃酮的提取、分離及純化工藝，建立紫外-可見吸收光譜滴定法，評價淫羊藿總黃酮清除DPPH自由基的抗氧化活性。方法? 通過保持其它條件不變，分別考察浸提溫度、料液比和乙醇濃度對提取液中淫羊藿總黃酮含量的影響，設計三因素三水平的正交實驗，提取溫度60 ℃～80 ℃，乙醇濃度50%～70%，料液比1：35～1：15，做3次平行實驗，優化淫羊藿總黃酮的最佳提取工藝條件。結果? 溫度70 ℃、60%乙醇濃度和1：25料液比是最優提取工藝條件，淫羊藿精提液中總黃酮質量濃度為10.15 μg/ml，含量為31.72%。光譜滴定法結果表明，淫羊藿總黃酮的質量濃度≥0.002 mg/ml時，清除率達79.17%。結論? 淫羊藿總黃酮對DPPH自由基有很好的清除能力，抗氧化活性強。

關鍵詞：淫羊藿總黃酮;紫外-可見吸收光譜;DPPH自由基;抗氧化

中圖分類號：R285;TS201.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.20.053

文章編號：1006-1959（2020）20-0164-03

Study on the UV-Vis Absorption Spectra of Scavenging DPPH Free Radicals

by Total Flavonoids of Epimedium

YAO Jin-long

（Department of Pharmaceutical Engineering，Jiangxi Medical School，Nanchang 330200，Jiangxi，China）

Abstract：Objective? To study the extraction， separation and purification process of total flavonoids of epimedium， and establish a UV-Vis absorption spectrometric titration method to evaluate the antioxidant activity of total flavonoids of epimedium in scavenging DPPH free radicals.Methods? By keeping other conditions unchanged， the effects of extraction temperature， material-to-liquid ratio and ethanol concentration on the total flavonoids content of epimedium in the extract were investigated respectively. An orthogonal experiment with three factors and three levels was designed， and the extraction temperature was 60 ℃～80 ℃，the ethanol concentration is 50%～70%， the material-liquid ratio is 1：35～1：15， three parallel experiments are performed to optimize the optimal extraction process conditions of the total flavonoids of epimedium.Results? Temperature 70 ℃， 60% ethanol concentration and 1：25 solid-liquid ratio were the optimal extraction conditions. The mass concentration of total flavonoids of epimedium extract was 10.15 μg/ml and the content was 31.72%. The results of spectrometric titration showed that when the mass concentration of total flavonoids of epimedium ≥ 0.002 mg/ml， the clearance rate reached 79.17%.Conclusion? The total flavonoids of epimedium had good scavenging ability to DPPH free radicals and strong antioxidant activity.

Key words：Total flavonoids of epimedium;UV-Vis absorption spectroscopy;DPPH free radical; Antioxidant

現代醫學研究表明，自由基氧化損傷是引起多種疾病的根源[1]，自由基的進攻會使生命機體內的生物大分子如核酸（DNA、RNA）、酶、蛋白質、糖等發生氧化損傷，并導致生物膜的脂質過氧化，對內臟器官、免疫系統的形態功能產生影響[2]。目前，已有研究證實羥基自由基OH·能與DNA堿基發生加成反應造成DNA鏈的斷裂和堿基對的損傷[3];超氧自由基O2-·與生物膜中的磷脂發生過氧化連鎖反應，破壞膜的穩定性和完整性，甚至造成細胞的壞死;過剩的O2-·還會引起炎癥和腫瘤等[4]。因此，清除自由基[5]的研究已經成為了當今藥學學科領域的一大熱點，研究發現，淫羊藿總黃酮[6]具有優越的抗氧化性能，該類化合物可以與自由基發生氧化還原反應，從而調節細胞處于還原狀態，抵抗機體損傷，減少疾病的產生[7]，具有較好的研究前景。但目前淫羊藿總黃酮的提取工藝較多，提取質量不一，為其在臨床的進一步應用造成了困難。為此，本文以淫羊藿總黃酮為研究對象，采用控制溫度、乙醇濃度和料液比正交實驗方法來優化淫羊藿總黃酮的最佳提取工藝條件，旨在為淫羊藿總黃酮的進一步研究提供幫助。

1材料與儀器

主要儀器包括分光光度計、水浴鍋、天平、干燥箱、烘干器等，試劑包括DPPH、淫羊藿苷、乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）等，具體來源情況見表1。

2方法與結果

2.1淫羊藿總黃酮粗提液的制備? 取淫羊藿葉粉碎，過60目篩，準確稱取淫羊藿粉末5.0 g，置于250 ml圓底燒瓶中，加入60%乙醇45 ml室溫浸泡輔助浸提30 min，70 ℃回流2次，2 h/次，將提取液抽濾，得總黃酮粗提液。保持其它條件不變，分別考察浸提溫度、料液比和乙醇濃度3個單因素對提取液中淫羊藿總黃酮含量的影響，設計三因素三水平的正交實驗，優化得出淫羊藿總黃酮提取率最高的最佳條件，且每個單因素做三次平行實驗。以淫羊藿總黃酮提取率為標準，因素水平見表2，最后確定一種最優提取工藝，用于淫羊藿總黃酮的提取。

實驗結果顯示，影響淫羊藿總黃酮提取率的因素大小次序為：C>B>A，B和C因數的R較大，說明淫羊藿總黃酮提取率主要受乙醇濃度和料液比2個因素制約，而提取溫度影響不顯著。根據K值的大小可知，淫羊藿總黃酮提取的最優條件為A2B2C2，即微波功率為中低火-中火（300 W），提取溫度為70 ℃，乙醇濃度為60%，料液比為1：25，見表3。

2.2淫羊藿總黃酮的分離純化? 取淫羊藿粗提液，用乙酸乙酯萃取，萃取液旋轉蒸發濃縮，真空低溫干燥至恒重，得浸膏，稱取適量浸膏加入適量蒸餾水配制成一定濃度的淫羊藿總黃酮精提液備用。

2.3淫羊藿苷標準曲線的繪制? 準確稱取淫羊藿苷標準品1.0 mg，用無水乙醇溶液稀釋定容至10 ml，搖勻，得淫羊藿苷儲備液。分別精密吸取0、0.25、0.50、0.75、1.0、1.25 ml的淫羊藿苷儲備液于一系列25 ml的比色管中，用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。以試劑空白作參比，在λmax=260 nm處測量其吸光度A，以吸光度對藿苷溶液的濃度C作圖，繪制標準曲線，用最小二乘法進行回歸，得到吸光度A和淫羊藿苷標準溶液的濃度C的回歸方程：A=14.274C-0.0029（r=0.9989），見圖1。

2.4淫羊藿總黃酮含量的測定? 按照2.3中的方法定量測定淫羊藿精提液在不同條件下的吸光度值，對應淫羊藿苷標準曲線方程，查找得到測定液中的總黃酮含量。經測定，淫羊藿精提液中總黃酮質量濃度為10.15 μg/ml，含量達31.72%。

2.5 DPPH體系穩定性? 研究隨著時間的變化，DPPH自由基的醇溶液中吸光度值的變化。結果發現，在1 h內，A值保持穩定，見圖2，因此所有樣品應在1 h之內測定完畢。

2.6 DPPH反應體系的吸收光譜及測定波長的確定? 在DPPH自由基清除法中，有機溶劑中的DPPH可形成穩定的具有兩個典型的特征吸收峰的自由基，自由基顏色為紫紅色。當反應體系中存在抗氧化劑時，抗氧化劑能提供出相應個數的氫原子和電子給DPPH自由基，使其生成DPPH2，DPPH2可以改變溶液的吸光度值和特征吸收峰，峰值變弱，吸光度降低。在此反應中，被測物質的抗氧化能力可以有體系顏色的變化來表示，顏色褪色越多，說明抗氧化能力越強。實驗中用UV-Vis光譜對DPPH自由基溶液進行掃描。結果顯示，DPPH溶液在517 nm和328 nm處出現特征吸收峰，而淫羊藿總黃酮的吸收峰在260 nm，見圖3。說明淫羊藿總黃酮本身在517 nm處不會對DPPH測定造成光譜干擾，因此實驗以517 nm作為DPPH自由基清除實驗的檢測波長。

2.7 DPPH穩定性實驗? 新鮮配制的DPPH溶液在波長為328 nm和517 nm處有很強的特征吸收峰，見圖4。DPPH溶液在≤1 h時，穩定性好，但若長時間放置在室溫下，并且在光照氧化條件下，放置時間越長，DPPH溶液顏色會由紫紅色變淺，吸光度值在波長為517 nm處降低明顯。結果表明，DPPH溶液的光吸收值會受到光照強度和溫度高低的影響。因此，為了得到準確的測試結果，DPPH溶液保存環境必須是低溫，反應也應在避光低溫條件下完成。

2.8 DPPH自由基清除實驗? 避光精密稱定一定量的DPPH，用乙醇作溶劑，配制成5.0 mmol/L的儲備液，-20 ℃存放，現用現配。準確移取4.5 ml DPPH標準液于10 ml比色管中，分別加入不同體積相同濃度的樣品，構成濃度梯度，其中一支管中不加樣品溶液（空白），用無水乙醇做溶劑，稀釋定容至刻度線5.0 ml處，搖勻，避光靜置，室溫下反應0.5 h，測定溶液的A517 nm值。計算其清除率，清除率按下式計算：

清除率（%）=×100%

式中A0為空白管的吸光度;A樣為樣品管的吸光度。

淫羊藿總黃酮提取液對DPPH·的清除作用見圖5。在一定的濃度范圍內，DPPH·的清除率隨淫羊藿總黃酮濃度的增加而增大，當淫羊藿總黃酮濃度的增加到一定濃度時，清除率穩定在一定范圍內。當清除率達50%時，淫羊藿總黃酮的質量濃度為：IC50=0.00092 mg/ml。淫羊藿總黃酮的質量濃度≥0.002 mg/ml時，清除率達最大，最大清除率為79.17%。這說明淫羊藿總黃酮對DPPH·有較強的清除作用。

3 討論

現代醫學研究表明，自由基氧化損傷[8]是能夠誘發多種疾病，因此，清除自由基的研究已經成為了當今藥學學科領域的一大熱點，研究也已發現，淫羊藿[9]總黃酮具有良好的抗氧化性能，該類化合物可以與自由基發生氧化還原反應，從而調節細胞處于還原狀態，抵抗機體損傷，減少疾病的產生，本論文通過正交實驗，得出了在溫度70 ℃、60%乙醇濃度和1∶25料液比的最優提取工藝條件下，淫羊藿精提液中總黃酮質量濃度為10.15 μg/ml，含量達31.72%。通過光譜滴定法結果表明，淫羊藿總黃酮的質量濃度≥0.002 mg/ml時，清除率達79.17%。表明淫羊藿總黃酮對DPPH自由基有很好的清除能力，抗氧化活性強。

參考文獻：

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[6]羅則華，杜倩，奚鑫，等.基于網絡藥理學的淫羊藿抗疲勞作用機制研究[J].中草藥，2020，51（11）：2997-3003.

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[8]王衛東，王裕祥，王永虎，等.西寧地區自由基與膝關節骨性關節炎分級的相關性研究[J].青海醫藥雜志，2020，50（1）：1-5.

[9]羅則華，杜倩，奚鑫，等.基于網絡藥理學的淫羊藿抗疲勞作用機制研究[J].中草藥，2020，51（11）：2997-3003.

收稿日期：2020-06-11;修回日期：2020-06-26

編輯/成森