無核葡萄離體胚珠發育影響因子及其生理變化

李桂榮，全冉，程珊珊，侯小進，樊秀彩，扈惠靈

（1河南科技學院園藝園林學院，河南新鄉 453003；2河南省園藝植物資源利用與種質創新工程研究中心，河南新鄉 453003；3中國農業科學院鄭州果樹研究所，鄭州 450009）

0 引言

【研究意義】種子敗育型無核葡萄獲得種胚后代的最有效方式是采用離體胚挽救技術[1]。無核葡萄胚挽救技術包括胚珠離體培養、胚萌發和成苗3個階段[2-8]，其中在第一個階段獲得大量的發育胚珠是基礎，但前期的研究實踐發現胚珠離體培養階段的發育率低，一般都低于30%[9-15]，這是目前無核葡萄胚挽救育種過程中的一個瓶頸問題。因此，摸索無核葡萄離體胚珠發育的最佳培養條件，探究培養條件與離體胚珠發育生理變化的關系，減少胚敗育，有助于提高胚珠發育率，對于今后無核葡萄胚挽救育種效率的提高至關重要。【前人研究進展】1982年，RAMMING等[9]首次報道利用改良的 White培養基培養無核葡萄胚珠，獲得兩株實生苗。此后，很多研究者繼續深入研究親本基因型、取樣時期、培養基及其相互作用等對無核葡萄胚挽救育種的影響[16-21]。親本基因型的篩選與胚挽救技術是提高育種效率的重要因素[1]。‘紅寶石’無核葡萄（Ruby seedless grape）屬無核晚熟紅色葡萄品種。選用‘紅寶石’無核葡萄作為無核葡萄胚挽救雜交親本易獲得雜交后代[22-24]，目前以‘紅寶石’無核葡萄為親本，通過胚挽救技術已獲得了‘紫豐’[25]和‘秦紅1號’[26]無核葡萄新品種。因此，‘紅寶石’無核葡萄是適宜開展無核葡萄胚挽救育種的主

要品種之一。而以‘紅寶石’無核葡萄作母本進行胚珠離體培養時，胚珠發育率也很低，僅為 2%—28.3%[4,15,18,21,27-29]。前人在無核葡萄胚珠離體培養階段，多數是從抑制幼胚早期萌發、防止幼胚夭亡或者畸形胚萌發的角度出發，采用各種培養方式抑制離體胚珠內胚的早期萌發，如采用低溫處理胚珠、培養基附加 60 g·L-1蔗糖等手段離體培養胚珠，而且培養時間較長，最少8周，有的甚至達到9—10周[16-21]。這個培養方式已經采用了很多年，但這是否為無核葡萄胚挽救育種過程中胚珠發育率低的限制因素，目前尚未進行深入研究。【本研究切入點】無核葡萄早期胚珠離體培養的研究報道中優選或采用的基本培養基有多種類型，其中MM3、改良MM3以及固液雙層培養基（改良MM3固體培養基+少量ER液體培養基）都表現出較好的使用效果[4,12,18]，附加60 g·L-1的蔗糖含量最為常見，沒有更多的比較研究[1]，而這個階段離體培養時間最少都是 8周，胚珠發育率一直都低于30%[9-15]。據此，本研究以無核葡萄胚挽救育種中常用母本品種‘紅寶石’無核為試材，比較研究基本培養基、蔗糖濃度、培養時間等關鍵因子在不同處理組合下對早期離體培養胚珠發育的影響，并探究培養條件與胚珠發育生理狀態間的關系。【擬解決的關鍵問題】確定提高胚珠發育率的離體培養條件；明確不同培養條件與離體胚珠生理活性間的相關程度，為進一步優化培養條件，減少葡萄胚敗育發生奠定基礎。

1 材料與方法

試驗于 2018—2019年在河南科技學院和中國農業科學院鄭州果樹研究所進行。

1.1 試驗材料

選擇種子敗育型、品質優良的歐亞種（VitisViniferaL.）無核葡萄品種‘紅寶石’無核（Ruby seedless grape）為試驗材料，于自然授粉65 d后摘取葡萄幼果（圖1-A），4℃冷藏備用。

1.2 試驗方法

1.2.1 胚珠離體培養 在超凈工作臺上，將消過毒的無菌幼果粒剖開，選取大小一致的胚珠（圖 1-B）接種在附加不同蔗糖含量的不同培養基上培養，固體培養基添加7.0 g·L-1瓊脂和1.5 g·L-1活性炭，pH為6.0（表1）。每個培養基處理接種30瓶，每瓶10個胚珠。培養的環境條件為：溫度（25±2）℃，相對濕度50%—60%，暗培養。

表1 不同培養基處理Table 1 Different medium treatments

1.2.2 不同離體培養時間處理 不同培養基處理下接種胚珠后，分別培養42、49、56和63 d，研究不同離體培養時間對胚珠發育的影響。

1.2.3 胚珠發育率統計 統計不同處理下的發育胚珠數，胚珠里沒有胚視為未發育胚珠，含有1個胚視為發育胚珠（圖1-C）。每3瓶共計30個離體胚珠算1次重復，共3次重復。胚珠發育率（%）=發育胚珠個數/接種胚珠總數×100。

1.2.4 生理指標測定 淀粉含量、可溶性蛋白含量、總酚含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性、過氧化物酶（POD）活性和多酚氧化酶（PPO）活性的測定均采用北京索萊寶公司試劑盒進行測定，型號分別為BC0700、PR1400、BC1340、BC0170、BC0090、BC0195。每個指標類型重復測定3次。

1.2.5 胚萌發率統計 胚珠離體培養42、49、56和63 d后，分別將發育胚珠內的胚（分別標記為E1、E2、E3和 E4）剝出，統計總胚數，接種到胚萌發培養基上，離體培養30 d后，統計胚萌發總數（胚的子葉、胚根有伸長的視為萌發胚）。胚萌發率（%）=萌發胚個數/接種胚總數×100。胚萌發培養基為 WPM+IAA 1.0 mg·L-1+6-BA 0.5 mg·L-1+GA32.0 mg·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1+蔗糖 20 g·L-1+活性炭 1.5 g·L-1，添加 Put 2 mmol·L-1+ Spm 2 mmol·L-1+ Spd 2 mmol·L-1，pH 為 6.0。培養環境條件：溫度（25±2）℃，相對濕度50%—60%，光照強度 40 μmol·m-2·s-1，光周期為 16 h/8 h[18]。

1.2.6 成苗及馴化移栽 待胚萌發長成正常完整苗（苗高6—8 cm，6—8片真葉）時，剪成帶一個芽的莖段接種到培養基上繼代生根成苗，培養基為：1/2 MS+IBA 0.1 mg·L-1+瓊脂 7.0 g·L-1+蔗糖 20 g·L-1+活性炭 1.5 g·L-1，pH 6.0。培養室條件：溫度（25±2）℃，相對濕度 50%—60%，光照強度 40 μmol·m-2·s-1，光周期為16 h/8 h。成苗后的試管苗在煉苗室煉苗7 d后，移栽到營養缽中，繼續培養30 d；然后將營養缽轉移到溫室內馴化30 d，移植至大棚圃地，按照田間管理的程序管理。翌年3月定植到大田[18]。

1.2.7 數據分析 采用SPSS 22.0軟件進行方差分析及相關分析，相關系數為簡單相關系數。

2 結果

2.1 對離體培養胚珠發育率的影響

由表2可以看出，當M8培養基處理（基本培養基是固液雙層培養基、附加 45 g·L-1的蔗糖）、培養時間為49 d時，胚珠發育率最高，達到（42.23±6.93）%；其次是M12培養基處理（基本培養基是固液雙層培養基、附加60 g·L-1的蔗糖）、培養時間為49 d時，胚珠發育率較高，達到（40.00±3.30）%，發育胚珠即為離體胚珠培養后獲得至少1個活性胚的胚珠，見圖1-B—D。

2.2 對離體培養胚珠生理指標的影響

2.2.1 對胚珠淀粉含量的影響 由表3可以看出，當培養時間相同、培養基不同時，胚珠淀粉含量變化差異不顯著（P＞0.05）。當培養基處理相同時，隨著離體培養時間的延長，胚珠淀粉含量出現逐漸下降的趨勢，其中，離體胚珠在處理M12上培養42 d時，淀粉含量最高，達到（10.21±0.02）%；而當培養時間為63 d時，胚珠淀粉含量僅為（5.11±0.02）%。其他培養基處理變化趨勢與M12處理一致，均為逐漸下降趨勢。

2.2.2 對可溶性蛋白含量的影響 由表4可以看出，當培養時間相同、基本培養基為固液雙層培養基時，可溶性蛋白含量均增加，與其他基本培養基相比，可溶性蛋白含量差異顯著（P＜0.05），其中M8培養效果最好，可溶性蛋白含量最高，達到（0.49±0.03）mg·g-1。隨著附加蔗糖含量的增加，可溶性蛋白含量出現先增加后下降的趨勢，如當基本培養基為固液雙層培養基，培養42 d時，附加蔗糖含量為30 g·L-1，可溶性蛋白含量為（0.36±0.01）mg·g-1；附加蔗糖含量為 45 g·L-1時，可溶性蛋白含量增加，達到（0.46±0.03）mg·g-1；而當附加蔗糖含量為 75 g·L-1時，可溶性蛋白含量降低，僅為（0.16±0.03）mg·g-1。當培養基處理相同時，隨著離體培養時間的延長，可溶性蛋白含量出現先增加后下降的趨勢。說明胚珠離體培養階段，附加蔗糖含量不宜過高，培養時間也不宜過長，以防止可溶性蛋白含量的降低。

表3 不同培養基和不同離體培養時間對離體培養胚珠淀粉含量的影響Table 3 Effects of different medium and culture time on starch content of ovule in vitro (%)

表4 不同培養基和離體培養時間對離體培養胚珠可溶性蛋白含量的影響Table 4 Effects of different medium and culture time on soluble protein content of ovule in vitro (mg·g-1)

2.2.3 對總酚含量的影響 由表5可以看出，當培養時間相同、基本培養基為固液雙層培養基時，總酚含量均增加，與其他基本培養基相比，總酚含量差異顯著（P＜0.05），其中 M12培養效果較好，總酚含量最高，達到（3.37±0.04）mg·g-1；隨著附加蔗糖含量的增加，總酚含量出現先增加后下降的趨勢，如當基本培養基為固液雙層培養基，培養42 d時，附加蔗糖質量為 30 g·L-1，總酚含量為（1.36±0.03）mg·g-1，附加蔗糖含量為 60 g·L-1時，總酚含量升高，達到（3.37±0.04） mg·g-1，而當附加蔗糖含量為 75 g·L-1時，總酚含量降低，為（2.19±0.03）mg·g-1。當培養基處理相同時，隨著離體培養時間的延長，總酚含量出現先增加后下降的趨勢。

表5 不同培養基和不同離體培養時間對離體培養胚珠總酚含量的影響Table 5 Effects of different medium and culture time on phenolics content of ovule in vitro (mg·g-1)

2.2.4 對離體培養胚珠 SOD酶活性的影響 由表 6可以看出，當培養時間相同、基本培養基為固液雙層培養基時，SOD酶活性均增加，與其他基本培養基相比，SOD酶活性差異顯著（P＜0.05），其中M12培養效果較好，SOD酶活性最高，達到（32.4±0.35）U·g-1FW；隨著附加蔗糖含量的增加，SOD酶活性出現先升高后下降的趨勢，如當基本培養基為固液雙層培養基，培養42 d時，附加蔗糖含量為30 g·L-1，SOD酶活性為（21.27±0.32）U·g-1FW，附加蔗糖含量為 60 g·L-1時，SOD 酶活性升高，達到（32.4±0.35）U·g-1FW，而當附加蔗糖含量為75 g·L-1時，SOD酶活性降低，為（22.9 ± 0.3）U·g-1FW。當培養基處理相同時，隨著離體培養時間的延長，SOD酶活性出現先升高后下降的趨勢，說明胚珠離體培養階段，附加蔗糖含量不宜過高，培養時間也不宜過長，有利于SOD酶清除活性氧，防止胚敗育。

2.2.5 對POD酶活性的影響 由表7可以看出，當培養時間相同、基本培養基為固液雙層培養基時，POD酶活性均較低；隨著附加蔗糖含量的增加，POD酶活性出現逐漸升高的趨勢，當附加蔗糖含量為 75 g·L-1時，POD酶活性均升高，其中M13處理下，POD酶活性最高，達到（22.17±10.00）U·g-1FW。當培養基處理相同時，隨著離體培養時間的延長，POD酶活性出現逐漸升高的趨勢，說明胚珠離體培養階段，適宜的蔗糖含量和培養時間控制POD酶活性的升高，有助于防止離體培養胚珠的老化。

表6 不同培養基和不同離體培養時間對離體培養胚珠SOD酶活性的影響Table 6 The effect of different medium and culture time on SOD activity (U·g-1 FW) of ovule in vitro

2.2.6 對離體培養胚珠PPO酶活性的影響 由表8可以看出，當培養時間相同、基本培養基為固液雙層培養基時，PPO酶活性均較低；隨著附加蔗糖含量的增加，PPO酶活性出現逐漸升高的趨勢，當附加蔗糖質量為75 g·L-1時，PPO酶活性均升高，其中M13處理下，PPO酶活性最高，達到（8.67±0.25）U·g-1FW。結合2.2.3，當蔗糖含量為75 g·L-1時，總酚含量較低，可能是由于此時離體胚珠內PPO酶活性偏高，造成離體培養胚珠總酚物質的減少，醌類化合物質的積累，胚珠組織出現褐變，造成離體胚珠褐化，加劇了離體胚珠內胚的敗育，從而影響了離體胚珠的發育率。當培養基處理相同時，隨著離體培養時間的延長，PPO酶活性出現逐漸升高的趨勢，說明胚珠離體培養階段控制PPO酶活性的升高，有助于防止離體培養胚珠的褐化。

表8 不同培養基和不同離體培養時間對離體培養胚珠PPO酶活性的影響Table 8 Effect of different medium and culture time on PPO activity of ovule in vitro (U·g-1 FW)

2.3 不同生理指標與胚珠發育率的相關性

從各個生理指標與胚珠發育率的相關性分析可以看出，胚珠發育率與離體培養胚珠的可溶性蛋白含量、總酚含量和SOD酶活性呈極顯著正相關，與POD酶活性和PPO酶活性呈極顯著負相關，與淀粉含量相關性不顯著（表9）。

表9 不同生理指標與胚珠發育率的相關系數Table 9 Correlation coefficient of different physiological indexes and ovule development rate

2.4 胚萌發成苗及移栽馴化

由表10可以看出，E2胚萌發率最高，達到88.2%，即在胚珠離體培養49 d時，總胚數、萌發胚總數、胚萌發率均達到最高；而胚珠離體培養63 d，總胚數、萌發胚總數、胚萌發率均為最低。成苗移栽馴化后獲得一批胚挽救苗（圖1-E—H）。

圖1 自然授粉的‘紅寶石’無核葡萄胚挽救過程中離體胚珠發育及胚萌發成苗Fig. 1 In vitro ovule development and embryo germination during embryo rescue of selfing ‘Ruby seedless’ grape

表10 胚萌發率Table 10 Embryo germination rate

3 討論

影響無核葡萄離體胚珠發育的主要因素包括親本基因型、基本培養基、附加成分、培養時期等[1]。在胚珠離體培養階段，為胚珠發育提供營養物質最主要的成分是培養基。本試驗選擇基本培養基為固液雙層基本培養基時，胚珠發育率最高，說明在胚珠離體培養階段，固液雙層基本培養基有利于胚珠發育率的提高，且胚珠發育率均高于前人研究結果，唐冬梅等[28]采用MM3基本培養基時，‘紅寶石’無核葡萄×新郁雜交胚珠發育率為 28.3%；LI等[7]采用改良 MM3基本培養基時，‘紅寶石’無核葡萄×北醇雜交胚珠發育率為28.3%。在基本培養基中添加一定量的蔗糖，既為胚珠發育提供了能源，也起到調節培養基滲透壓的作用。本試驗發現在基本培養基中添加不同含量的蔗糖時，隨著蔗糖含量的升高，胚珠發育率出現先升高后下降的趨勢。與前人[7,22,28,30]研究結果相比，減少基本培養基中的蔗糖含量，有助于胚珠發育率的提高，因此胚珠離體培養階段，蔗糖含量不能過高，建議在前人一直沿用的60 g·L-1蔗糖的基礎上，進行下調。

胚珠離體培養時間的長短也會影響胚珠發育率。本試驗發現隨著離體培養時間的延長，胚珠發育率呈先增高后下降的趨勢，離體培養49 d（7周）胚珠發育率較高，最高達到（42.23 ± 6.93）%，離體培養63 d（9周）胚珠發育率均降低。前人以‘紅寶石’無核葡萄作母本，獲得雜種胚珠進行離體培養時，離體培養胚珠時間不同，胚珠發育率不同，王飛等[31]離體培養雜種胚珠40 d時，胚珠發育率為56.5%；LI等[7]離體培養雜種胚珠56 d時，胚珠發育率為28.3%；唐冬梅等[28]離體培養雜種胚珠 60 d時，胚珠發育率為27.8%；羅堯幸[29]離體培養雜種胚珠9周，即63 d時，胚珠發育率分別為 13.7%和 13.8%；李志瑛等[15]離體培養雜種胚珠10周，即70 d時，胚珠發育率為13.81%，前人研究結果均表明隨著離體培養時間的延長，從40 d至70 d，胚珠發育率越來越低，和本研究結果一致。因此胚珠離體培養階段，縮短培養時間，有利于胚珠的發育；及時取出幼胚，進行第二階段胚萌發的培養，有助于提高無核葡萄育種效率。

無核葡萄胚敗育是一種細胞程序性死亡現象，種子敗育型無核葡萄胚珠可能由于胚乳提前降解，導致胚營養缺乏而敗育。在胚胎發育過程中，可溶性糖、可溶性蛋白、淀粉、多酚物質、酶活性及內源激素等的變化與細胞的生物功能和生理活動密切相關[32-35]。本研究關于無核葡萄胚挽救過程中胚珠離體培養階段，發育胚珠生理代謝物質的變化目前尚未有人開展研究。前人[36-41]對相關生理指標測定研究主要是從不同品種、幼果不同取材時期等方面開展，本研究結果是對前人研究的一個補充。研究離體胚珠內生理指標的變化在一定程度上可以反映幼胚敗育進程，說明在胚珠離體培養階段，當胚珠生理活性較高時，應該及時取出幼胚，可以防止胚敗育，提高胚珠發育率，進而提高胚萌發率和成苗率。如何進一步提高該階段發育胚珠的生理活性，需要不斷改良胚珠離體培養方法；提高胚珠發育率，是今后開展無核葡萄胚挽救育種工作需要考慮的一個重要研究內容。

4 結論

本研究在胚珠離體培養階段，培養自然授粉65 d的‘紅寶石’無核葡萄胚珠，采用固液雙層基本培養基（改良MM3固體培養基+8 mg·L-1ER液體培養基），附加45 g·L-1蔗糖，培養時間49 d時，胚珠發育率最高，達到（42.23±6.93）%，胚珠生理活性也較強。通過相關性分析發現，胚珠發育率與離體培養胚珠的可溶性蛋白含量、總酚含量和SOD酶活性呈極顯著正相關，與POD酶活性和PPO酶活性呈極顯著負相關，與淀粉含量相關性不顯著。胚珠發育率的提高是無核葡萄胚挽救育種效率提高的前提。