人牙齦成纖維細胞在聚醚醚酮片和純鈦片表面的體外生物相容性比較*

于世德，黎日照，伍思俊，張 鵬，呂炳輝，喬建勛，顏 丹，羅湧彬

佛山科學技術學院附屬口腔醫院·佛山市口腔醫院，佛山 528000

聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）是一種由羰基和醚基連接芳香環組成新型的半結晶性的全芳香族高分子聚合物［1］。由于其耐高溫、耐腐蝕、耐磨、耐疲勞、阻燃以及絕緣等優異性能，同時還具有耐摩擦性、耐藥品性、耐水分解性以及優良的生物相容性，PEEK 材料獲得了廣泛的應用［2-4］。在口腔醫學領域，作為性能優異的骨替代材料，聚醚醚酮首先被應用在了顱面部骨缺損的修復上［5］。聚醚醚酮具有良好的生物相容性已經與骨具有相近的彈性模量，近年來在口腔領域引起了廣泛關注［5-6］。在口腔種植領域，相比傳統金屬材質的口腔種植愈合基臺，由聚醚醚酮材料制作的愈合基臺具有較好的生物相容性以及更大的可調改空間，更有利于種植體后期的美學修復。

相比于傳統的金屬及合金生物材料，PEEK 在骨科領域具有更加巨大的臨床應用前景［6］。 然而，關于PEEK 材料對于軟組織修復應用的相關報道較少。因此，對于PEEK 材料在軟組織修復方面的研究能夠為日后其臨床廣泛應用，提供實驗依據。本研究擬采用牙齦成纖維細胞與PEEK 以及Ti 片共培養后，比較兩種材料對于牙齦成纖維細胞的黏附、增殖能力進行探究，為日后PEEK 材料應用于種植體基臺材料對于軟組織修復能力提供實驗基礎和理論依據。拓展了聚醚醚酮材料在口腔種植領域的應用范圍，還為種植修復技術提供了新的方向和選擇，對于口腔種植學和口腔材料學提供重要的參考價值。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

聚醚醚酮（廣東粵誠牙科技術開發有限公司），鈦（廣東粵誠牙科技術開發有限公司），掃描電子顯微鏡S-3000N（Hitachi，日本），CCK-8(東仁，日本)，全自動酶標儀Infinite200（Tecan 公司，瑞士），細胞死活染色試劑盒（碧云天，中國），羅丹明鬼筆環肽（索萊寶，中國）。

1.2 細胞培養

牙齦成纖維細胞取自南方醫科大學南方醫院口腔頜面外科門診18～25 周歲阻生牙拔除患者正常牙齦組織。使用組織塊培養法原代培養牙齦成纖維細胞，10%胎牛血清的高糖DMEM 完全培養基培養，待細胞長至覆蓋瓶底的80%時，細胞接種于各個試件表面接種密度為1 × 105個/mL。

1.3 試件制備

將直徑為10.0 mm的PEEK和Ti制備成厚度為1.0 mm、直徑為10 mm 的圓片狀PEEK 試件和Ti 試件，用400#、500#、600#、1000#、2000#的碳化硅砂紙逐級打磨拋光。依次用丙酮、無水乙醇、超純水超聲清洗10 min，60 ℃水浴酸蝕30 min，乙醇浸泡紫外照射消毒滅菌后干燥備用，見圖1。

圖1 PEEK試件和Ti試件實物圖

1.4 掃描電鏡觀察細胞的黏附形態

PEEK 組和Ti 組各組內隨機選取試件，每個時間點每組設置3 個重復試件。將牙齦成纖維細胞按照相同密度（1 × 105 個/mL）， 接種于各試件表面， 分別于24 h 終止培養， 掃描電鏡觀察試件表面細胞形態。

1.5 死活細胞染色法檢測細胞死亡

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數生長期的牙齦成纖維細胞以1×105 個/mL 的密度接種于試件表面牙齦成纖維細胞，細胞培養箱中分別孵育6 h，12 h，24 h 后，吸除培養基，PBS 緩沖液清洗3 次，每孔加入250 μL細胞死活染色工作液，細胞培養箱避光孵育30 min，正置熒光顯微鏡下進行觀察。

1.6 CCK-8方法檢測細胞的增殖能力

PEEK 組和Ti 組各組內隨機選取試件，每個時間點每組設置3 個平行試件，且每個時間點設置空白孔和背景孔。將牙齦成纖維細胞按照1 × 105個/mL密度接種于各試件表面，分別于6 h、12 h、24 h 終止培養，吸除培養基，按每孔500 μL體積配置實驗所需CCK-8工作液，將各試件置于CCK-8 溶液中，避光孵育1 h～4 h，吸取100 μL混合液至96 孔板中，全自動酶標儀檢測450 nm 波長下檢測樣本的吸光度值。

1.7 羅丹明鬼筆環肽染色檢測細胞形態

取對數生長期的牙齦成纖維細胞按照1 × 105個/mL密度接種于各試件表面，培養6 h、12 h、24 h后，用4%多聚甲醛室溫固定15 min； PBS洗滌3次，每次5 min，5 μg/mL的羅丹明鬼筆環肽室溫避光染色40 min，PBS 漂洗3 次，DAPI復染。激光共聚焦熒光顯微鏡觀察細胞形態變化。

1.8 統計學方法

采用GraphPad Prism8 軟件對結果進行統計分析。計量資料用均數±標準差（±s）表示。對于兩組獨立樣本數據，數據滿足正態分布和方差齊性采用兩獨立樣本的t 檢驗進行統計推斷；數據滿足正態分布，但方差不齊，采用校正的t檢驗。檢驗水準α＝0.05。

2 結果

2.1 掃描電鏡觀察試件表面形貌

掃描電鏡觀察Ti 試件及PEEK 表面形貌，結果顯示試件經過打磨酸蝕后表面呈不規則形，試件表面不平整。PEEK 試件表面呈不規則片層狀結構，Ti 試件表面呈蜂窩狀孔隙結構，見圖2。

圖2 掃描電鏡觀察PEEK及Ti表面形貌

2.2 掃描電鏡觀察細胞黏附形態

掃描電鏡觀察牙齦成纖維細胞在Ti 試件及PEEK 表面黏附情況。分別將牙齦成纖維細胞接種于滅菌后的Ti試件及PEEK 試件表面24 h 后觀察細胞形態及黏附水平，結果顯示牙齦成纖維細胞在細胞在PEEK 試件表面的黏附數量要多于Ti 試件表面。觀察牙齦成纖維細胞黏附形態，結果顯示牙齦成纖維細胞在PEEK 試件表面及Ti 試件表面成長梭形，形態不規則，呈典型的成纖維細胞形態。細胞在PEEK 試件表面較Ti 試件表面伸出較多絲狀偽足及蛋白纖維絲，且在PEEK 試件表面鋪展更開。結果顯示牙齦成纖維細胞在PEEK 試件和Ti試件表面均可黏附與增殖，且在PEEK表面細胞黏附要優于Ti表面，見圖3。

圖3 牙齦成纖維細胞在PEEK及Ti試件表面黏附情況

2.3 細胞死活染色

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數生長期的牙齦成纖維細胞以1×105個/mL 的密度接種于試件表面，分別培養6 h，12 h，24 h 后進行Calcein-AM/PI免疫熒光染色。熒光正置顯微鏡觀察，結果顯示Ti試件表面較PEEK 試件表面在6 h，12 h，24 h均出現了較多PI染色的死細胞，而PEEK 試件表面未見明顯PI 染色的死細胞，且活細胞多于Ti試件組，見圖4。

圖4 齦成纖維細胞在PEEK及Ti試件表面培養不同時間細胞死活染色

2.4 CCK-8法檢測細胞增殖能力

將PEEK 試件，Ti 試件分別與牙齦成纖維細胞共培養6 h，12 h，24 h，CCK-8法檢測細胞增殖水平。結果顯示PEEK 試件，Ti 試件與牙齦成纖維細胞共培養6 h、12 h、24 h 后，PEEK 試件表面細胞增殖能力均優于Ti 試件組；隨著共培養時間增長，細胞增殖增加。即牙齦成纖維細胞在PEEK 試件表面培養6 h、12 h、24 h的活細胞數均高于Ti試件組，見圖5。

2.5 細胞黏附檢測

將打磨滅菌后的試件分別置于24孔板中，將處于對數生長期的牙齦成纖維細胞以1×105 個/mL 的密度接種于試件表面，分別培養6 h、12 h、24 h后進行羅丹明鬼筆環肽熒光染色，檢測細胞的形態以及黏附于材料表面情況。結果顯示細胞接種6 h、12 h、24 h，牙齦成纖維細胞均可黏附于試件表面，而在PEEK 試件表面細胞黏附效果更佳，細胞鋪展更開，伸出更多偽足。實驗結果表明PEEK 較Ti更有利于黏附細胞的伸展，見圖6。

圖5 材料與牙齦成纖維細胞共培養不同時間細胞增殖性能測定，*表示P＜0.05

圖6 牙齦成纖維細胞在PEEK及Ti試件表面培養不同時間細胞黏附形態檢測

3 討論

隨著口腔技術的不斷發展, 各種材料被應用于種植體穿齦部分的研發。PEEK 是一種具有良好生物性能的高分子材料，在骨修復中具有廣泛的應用，研究表明PEEK 的機械性能優于現有的牙科金屬材料，并且與骨具有相近的彈性模量［7］。在口腔醫學領域，作為性能優異的骨替代材料，聚醚醚酮首先被應用在了顱面部骨缺損的修復上。近年來在口腔種植領域也有廣泛的應用［6,8］。牙種植體材料是否具有良好的細胞黏附增殖性能，是評價其生物學性能的重要指標之一［9-10］。種植體植入種植窩內，種植窩周圍血液中蛋白能夠迅速吸附在種植體表面，誘導細胞黏附于種植體表面，為之后的愈合發揮重要作用［11］。越來越多的研究關注種植體表面軟組織的修復。但是其對于軟組織的修復能力的相關研究未見報道。本實驗對PEEK 及傳統種植基臺材料Ti 進行了體外細胞生物相容性的比較，通過牙齦成纖維細胞在PEEK 及Ti材料表面的黏附、增殖能力評價PEEK 的細胞生物相容性，探討PEEK 作為牙種植基臺新材料的可能性。

本實驗制備PEEK 和Ti 標準化試件，經過粗糙度不同的碳化硅砂紙打磨后，經過酸蝕，清洗，殺菌后，使用掃描電子顯微鏡觀察試件表面形貌。通過分別將牙齦成纖維細胞接種于PEEK 及Ti 試件表面共培養6 h、12 h、24h 后利用掃描電子顯微鏡，CCK-8及免疫熒光檢測細胞的增殖及黏附性能。實驗結果顯示，經過打磨酸蝕殺菌后的PEEK 表面呈片層狀，不規則粗糙的形貌，而Ti 試件表面表面呈蜂窩狀多孔粗糙形貌。將牙齦成纖維細胞接種于試件表面24 h 后，掃描電鏡觀察顯示，牙齦成纖維細胞在PEEK 表面和Ti 表面均可黏附生長，但在PEEK 試件表面較Ti試件表面細胞鋪展更開，伸出更多的纖毛和偽足。說明牙齦成纖維細胞在PEEK 表面黏附性更好。CCK-8 檢測，實驗結果顯示，將牙齦成纖維細胞接種于試件表面培養6 h、12 h、24 h 后，細胞在PEEK 表面細胞增殖能力更強，在6 h、12 h、24 h 細胞增殖能力均強于Ti 試件組。活細胞死細胞染色結果顯示，細胞接種于PEEK 表面6 h、12 h、24 h 后，試件表面均沒有出現明顯的PI染色的死細胞，而在Ti表面出現了少量PI染色的死細胞，且隨著培養時間的增長，死細胞染色增多。羅丹明鬼筆環肽染色結果同樣顯示，牙齦成纖維細胞在PEEK 試件表面較Ti 試件表面鋪展更開，細胞形態更長，伸出偽足更多。實驗結果與掃描電鏡結果一致。

理想的種植體材料應該具有良好的生物相容性，能夠促進促進細胞的增殖和黏附。PEEK 作為一種具有優良理化特性的生物醫學高分子材料，在臨床上具有良好的應用前景［12］。本實驗通過比較PEEK 及Ti對于牙齦成纖維細胞的增殖黏附能力，驗證PEEK 的體外生物相容性。實驗結果顯示PEEK和Ti相比具有更好的生物相容性，能夠在體外促進牙齦成纖維的黏附增殖。但是有實驗表明PEEK由于過于穩定的化學結構，使得其具有明顯的惰性及疏水性［4］，嚴重限制了其生物學應用。因此更多關于PEEK 及其改性的相關研究仍需進行，為下一步的臨床應用提供依據和參考。