水果酵素發酵過程γ-氨基丁酸含量變化的研究

朱會霞, 孫金旭, 高 越, 王 茜 ,姜艷超

(衡水學院,河北 衡水 053000)

1 前言

在辭海中，酵素是酶的舊稱[1]。但近年來，酵素的概念又有了新的變化[2]。根據中國生物發酵產業協會發布的《酵素分類導則》規定，酵素是由各種植物(包括各種果蔬、植物根和葉)、菌菇及動物組織等為原料，經乳酸桿菌、德巴利酵母、醋酸菌和芽孢桿菌等多種微生物復合發酵而成的制品[3]。酵素發酵過程中還會產生多種功能性成分[4]，如γ-氨基丁酸、β-胡蘿卜素、氨基酸、功能性低聚糖等成分，進入人體后各自發揮相應的生理功能。特別是γ-氨基丁酸作為有特殊生理功效的非蛋白質氨基酸對人體尤為重要，根據中國生物發酵產業協會發布的《食用植物酵素》規定，酵素中γ-氨基丁酸的含量已經成為酵素行業的一個評價標準[5]。因此本研究對于提高酵素的品質是非常必要的，具有重要的意義。

日本、美國都將γ-氨基丁酸列入食品序列并確認其為安全物質，2009年我國衛生部允許γ-氨基丁酸在食品生產加工中適量添加使用，γ-氨基丁酸是許多降血壓食品的主成分之一[10]。哺乳動物體內含有的γ-氨基丁酸能夠促進血管擴張，降低血壓，對心血管疾病的治療有著重要功效[11]。研究發現γ-氨基丁酸能夠緩解焦慮、抑郁并且還能舒緩心情[12]；能促進腦細胞代謝，同時還能改善腦細胞代謝活動，恢復腦細胞功能，從而起到改善睡眠、提高記憶力的作用[13]。綜上所述，γ-氨基丁酸是一種食品級的、天然存在并對人體和動物具有多種功效的安全物質。本文將通過改變酵素生產工藝中的發酵條件進行分析，確定不同條件對γ-氨基丁酸含量及酵素品質的影響。實驗結果將優化水果酵素生產的工藝條件，提高酵素的品質和口感，為后續酵素的工業化生產奠定基礎，也將為其他水果酵素進行同類研究提供經驗和技術支持。

2 材料與方法

2.1 實驗菌種和原輔料

德巴利酵母、植物乳桿菌、醋酸菌等均由衡水學院發酵工程實驗室保藏。試驗材料包含枸杞、樹莓、冰片糖、單晶冰糖、低聚果糖、黃砂糖等。其中枸杞購于衡水桃城區衡杞枸杞種植專業合作社，樹莓購于河北長益生物科技有限公司，單晶冰糖、冰片糖、黃砂糖和低聚果糖購于衡水市桃城區新興糖酒銷售部。

2.2 試驗方法

酵素的制備：選取枸杞、樹莓兩種鮮水果，枸杞15 kg，樹莓5 kg，清洗、除梗后破碎混合，加入輔料糖和復合的三種菌種后發酵。調配：發酵結束后的枸杞復合酵素需要過濾，然后進行合理調配。灌裝：500nm微濾，在無菌條件下灌裝。

2.3 γ-氨基丁酸測定法

按照T/CBFIA 08003—2017規定的方法，制作標準曲線、測定酵素γ-氨基丁酸含量并記錄實驗數據[14,15]。

2.4 最佳發酵溫度和時間的確定

枸杞、樹莓兩種鮮水果清洗后按3:1的比例破碎混合，加入占水果重量30%的黃砂糖和占水果重量1%的復合菌種，在24℃、27℃、30℃、33℃、36℃溫度下分別發酵，每月測定不同發酵溫度和發酵時間的酵素中γ-氨基丁酸的量，共測定12個月，同時進行感官鑒評，綜合確定最優發酵溫度及最優發酵時間。

2.5 輔料糖的確定

分別加入黃砂糖、單晶冰糖、低聚果糖、冰片糖等四種輔料糖，參照上一步實驗結果在33℃溫度下發酵8個月，然后測出γ-氨基丁酸的量，確定最優的輔料糖。

2.6 單因素試驗

德巴利酵母加入量確定：分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%的德巴利酵母，參照上述實驗條件確定出德巴利酵母最優添加量。

植物乳桿菌加入量：分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%的植物乳桿菌，參照上述實驗條件確定植物乳桿菌的最優添加量。

醋酸菌加入量：分別加入0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%和3.5%的醋酸菌，參照上述實驗條件確定出醋酸菌的最優添加量。

2.7 正交試驗法

為進一步明確酵素菌種最佳配比，優化正交試驗進行分析。

表1 枸杞酵素菌種優化正交表

2.8 品評試驗法

采取嗅覺、視覺、味覺等感官評鑒方式對不同配比的樣液進行評鑒。

表2 枸杞酵素感官鑒評表

2.9 酸度測定法

按照T/CBFIA 08003—2017規定的方法，測定總酸度并記錄實驗數據。

2.10 固形物成分比例測定法

使用阿貝折光儀對樣品進行測量，讀數，計算樣品固形物成分比例并記錄。

3 結果與討論

3.1 γ-氨基丁酸標準曲線

由圖1標準曲線可知y = 0.112x-0.127、R2= 0.999，該標準曲線的線性較好適于后續試驗。

3.2 發酵時間及發酵溫度的確定

由圖2可知，發酵初期，γ-氨基丁酸的含量隨發酵時間的延長和溫度的升高而增多，在30℃和33℃進行發酵時，從第6個月開始γ-氨基丁酸的含量隨發酵時間的増長而下降。在36℃發酵時，γ-氨基丁酸的含量要比33℃時要低得多，在第8個月后隨著發酵時間的增長而迅速降低，低于24℃條件下的γ-氨基丁酸的含量。因此最佳的發酵溫度為33℃，發酵時長為6-10個月。

圖2 時間及溫度對γ-氨基丁酸含量的影響

從感官評鑒分值來看(圖3)，水果酵素會隨發酵時間的增長而變得香氣濃郁、酸甜適口。在24℃和27℃下發酵制成的酵素感官評分分值相差不多，24℃條件下的酵素分值較低但后期分值增長較快。30℃和33℃條件下制成的酵素分值相近，33℃時分值略高，8個月后分值變化都不大。而在36℃條件下制成的酵素因溫度過高而導致口感不佳，分值低于30℃時的分值而高于27℃時的分值。可知最優的發酵溫度為33℃，發酵時長為8-12個月。

圖3 發酵時間及溫度對感官評鑒的影響

從以上分析可得，γ-氨基丁酸含量在33℃下發酵第6個月時最高。而感官評分則在33℃發酵8～12個月分值變化不大。綜合以上兩個指標及成本考慮，最佳溫度是33℃，最佳時間是8個月。

3.3 輔料糖的確定

由圖4可知，當添加冰片糖時，γ-氨基丁酸的含量最高，為55.38 mg/L其次是黃砂糖、低聚果糖和單晶冰糖。黃砂糖也叫做金砂糖，是富含一定營養元素的砂糖，除了蔗糖外還有很多天然礦物質及微量元素。單晶冰糖除蔗糖外幾乎不含其他成分。低聚果糖是由蔗果三糖、蔗果四糖和蔗果五糖等幾種糖混合組成的，精制的食品級低聚果糖幾乎不含微量元素和礦物質成分。冰片糖內除蔗糖外還富含多種維生素、天然酸類、抗氧化物質、礦物質和色素調節物質，維生素以胡蘿卜素、煙酸和葉酸為主，礦物質則主要為鋅、鎂、銅等元素。枸杞復合酵素發酵過程是幾種微生物協調互補、相互協作的代謝繁殖模式，而冰片糖中含有的多種碳源、生長因子和微量元素，有利于本實驗中復合菌種的發酵，促進菌種生長繁殖，并且充分利用菌種間的協同作用進而使得植物乳桿菌產γ-氨基丁酸的量較高。由此分析可知應以冰片糖作為輔料糖最佳。

圖4 輔料糖種類對γ-氨基丁酸含量的影響

3.4 單因素試驗

(1)德巴利酵母加入量的確定

由圖5可知，德巴利酵母的加入量在0.5%-2.0%范圍時，γ-氨基丁酸的含量與德巴利酵母加入量成正比，當加入量到達2.0%，γ-氨基丁酸的含量達到最高值53.5 mg/L。在隨后的三個濃度中，γ-氨基丁酸的含量則隨著加入量的增多而減少。由此可知最優加入量應處于1.0%-3.0%之間。

圖5 德巴利酵母加入量對γ-氨基丁酸含量的影響

(2)植物乳桿菌加入量的確定

由圖6可知，當植物乳桿菌加入量加入量為1.0%時，γ-氨基丁酸的含量最多，達到54.8 mg/L。當植物乳桿菌加入量在1.5%-3.5%范圍時，γ-氨基丁酸的含量則會隨著植物乳桿菌加入量的增多而逐漸減少。由此可知最優加入量范圍為0.5%-1.5%。

圖6 植物乳桿菌加入量對γ-氨基丁酸含量的影響

(3)醋酸菌加入量的確定

由圖7可知，當醋酸菌加入量為1.0%時，γ-氨基丁酸的含量最多，達到56.1 mg/L。當醋酸菌加入量在1.5%-3.5%范圍內時，γ-氨基丁酸的含量則會隨著醋酸菌加入量的增多而逐漸減少。由此可知最優加入量的范圍為0.5%-1.5%。

圖7 醋酸菌加入量對γ-氨基丁酸含量的影響

3.5 菌種正交試驗結果

水果酵素菌種選擇植物乳桿菌、醋酸菌、德巴利酵母三種，不同的菌種配比γ-氨基丁酸的含量不同(表3)。

表3 酵素菌種試驗結果

由表3可知，不同配比菌種的添加根據R值對比各因素的影響大小，結果為B>A>C(植物乳桿菌>德巴利酵母>醋酸菌)，植物乳桿菌對γ-氨基丁酸的含量影響最大，其次是德巴利酵母、醋酸菌。分析K值能夠得出幾種菌種的最優組合是A2B3C2，即德巴利酵母的加入量應為2.0%，植物乳桿菌的加入量為1.5%，醋酸菌的加入量應為1.0%。但A2B3C2組合并未在正交實驗中出現，因此需進行驗證實驗。驗證實驗證實A2B3C2組合的γ-氨基丁酸含量為71.35 mg/L，高于正交實驗中最高量68.72 mg/L，說明正交實驗得到的最優組合確為γ-氨基丁酸含量最高的菌種配比。由表4方差分析結果可得，植物乳桿菌對復合酵素的影響最為顯著，德巴利酵母和醋酸菌兩種菌種對γ-氨基丁酸的含量幾乎沒有影響。

表4 因素方差分析

3.6 產品指標

根據T/CBFIA 08003—2017，取50 ml樣品于干燥潔凈的樣品杯中，置于非直射日光下，用目測觀察外觀及色澤，鼻嗅其氣味。制得的水果酵素外觀顏色為黃棕色，色澤艷麗，香氣濃郁，產品均勻，爽口柔和。

根據T/CBFIA 08003—2017，可溶固形物(20℃折光計法)成分比例為21%；總酸(以檸檬酸計)成分比例為0.7%。

4 結論

現代的果蔬酵素發酵流程，是將新鮮的水果以及蔬菜經過洗凈、破碎后添加相應輔料，在特定溫度下發酵，最后檢測調配灌裝。故研究生產工藝要從發酵時間、發酵溫度、輔料糖種類及菌種比例的確定等關鍵因素進行研究。通過設置不同的發酵溫度和時間，依據γ-氨基丁酸含量、感官評分確定發酵溫度為33℃、發酵時間為8個月，最佳的輔料糖為冰片糖。正交實驗確定德巴利酵母、植物乳桿菌和醋酸菌的加入量分別為2.0%、1.5%和1.0%。在此條件下，γ-氨基丁酸含量達到71.35mg/L，水果酵素色澤艷麗、具有枸杞和樹莓特有的香氣。

本研究提高了γ-氨基丁酸的含量和酵素的品質，為后續工業化生產奠定了基礎，同時也為其他水果酵素進行同類研究提供經驗和技術支持。