一種來源嗜熱古菌的耐熱β-葡萄糖苷酶制備鳶尾苷元的工藝研究

王 仲，方 偉，董 青，李麗娜

(1.武漢華夏理工學(xué)院，湖北 武漢 430223；2.湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心，湖北 武漢 430064)

1 緒論

野葛花[1]是我國傳統(tǒng)藥物，為豆科植物野葛的花。主要有效成分為異黃酮類化合物，是野葛花生長過程中形成的一類次生代謝產(chǎn)物，具有解酒保肝、抗腫瘤、抗炎、抗氧化[2][3]等生物活性。異黃酮大部分以糖苷形式存在，常見如葛花苷、鳶尾苷、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷、尼泊爾鳶尾素-7-O-β-D-葡萄糖苷[2]等。其中鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷是葛花異黃酮的主要成分，但是鳶尾黃素是主要藥效活性物質(zhì)。β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，簡稱BGL)[4]又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，它屬于纖維素酶類，是一種能催化水解芳基或烴基與糖基原子團之間的糖苷鍵生成葡萄糖的酶。目前從嗜熱古菌中分離出一些BGL，由于其高度耐熱穩(wěn)定性及高活性，顯示出工業(yè)化優(yōu)勢，因此日益受到人們的重視。

2 儀器與試藥

儀器 PHS-25 pH計(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)、BS124電子分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司FNA/JAN系列)、TG16-WS醫(yī)用離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司)、Waters2695高效液相色譜儀

試藥β-葡萄糖苷酶(自制)、鳶尾黃素、鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷對照品(自制)、甲醇、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、(以上試藥均為分析純)、乙腈(色譜級)、超純水&蒸餾水(實驗室自制)

3 法與結(jié)果

3.1 HPCL法檢測鳶尾苷元[6]

色譜條件：色譜柱：Waters sunfire C18(2.1 × 150 mm，3.5 um)；柱溫40 ℃；檢測波長260 nm；進樣量6 ul；流速0.3 ml/min。流動相：乙腈梯度洗脫。

3.2 底物溶液和酶溶液的配置

精密稱取鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷用pH值6.0的緩沖液定容，配置得到濃度為1 mg/mL的底物溶液，備用。

精密稱量BGL，用pH值6.0的緩沖液定容，配置得到濃度為1 mg/mL酶溶液，離心，取上清液，0.45μm微孔濾膜過濾。酶溶液須現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.3 鳶尾苷元的制備方法

取0.1mg鳶尾黃素-7-O-木糖葡萄糖苷及0.5 mgBGL，加入pH6.0的緩沖液定容，在實驗條件下反應(yīng)一定時間，反應(yīng)過程中每間隔20 min劇烈震搖10次，反應(yīng)完成后精密量取酶解液0.3ml，并加入甲醇定容至1 ml使酶失活，按3.1項中方法進行HPLC檢測鳶尾苷元含量。

3.4 單因素試驗

將反應(yīng)液pH值、反應(yīng)溫度、酶與底物的質(zhì)量比、反應(yīng)時間分別固定在6.0、90 ℃、5∶1、4h，以鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率為衡量指標，只改變其中一個條件進行試驗，每個試驗平行做3分，考察制備過程中各因素水平的影響。

3.4.1 酶與底物質(zhì)量比

酶與底物質(zhì)量比分別設(shè)為1∶1、2∶1、5∶1、8∶1、10∶1、20∶1進行反應(yīng)，結(jié)果表明隨著酶用量增大，轉(zhuǎn)化率增大，但越往后增大的幅度逐漸變小。所以當?shù)孜锖兔纲|(zhì)量比1∶5時轉(zhuǎn)化率最佳。

3.4.2 反應(yīng)溫度

反應(yīng)溫度分別為80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃進行反應(yīng)，結(jié)果表明鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率先隨著溫度的升高而升高，在90 ℃時達到最大值，后開始下降。

3.4.3 pH值

分別用緩沖液pH值為4.5、5.0、5.5、6.0進行反應(yīng)，測定鳶尾苷元峰面積，計算出轉(zhuǎn)化率并作圖。結(jié)果表明酶解反應(yīng)受pH值的影響不大，當pH值為6.0時，轉(zhuǎn)化率略高于其他pH值，故確定后續(xù)響應(yīng)面實驗時緩沖液pH值保持為6.0。

3.4.4 反應(yīng)時間

反應(yīng)時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h進行反應(yīng)，結(jié)果表明1.5 h內(nèi)隨著時間的延長鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率逐漸上升，1.5h后轉(zhuǎn)化率保持平緩。說明鳶尾苷元在1.5 h內(nèi)已經(jīng)反應(yīng)完全。

3.5 Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計[5]及結(jié)果

以反應(yīng)溫度(A)、反應(yīng)時間(B)、底物與酶質(zhì)量比(C)三個因素為自變量，每個因素取三個水平，分別以+1、0、-1編碼，以鳶尾苷元的轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值R，進行三因素三水平響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計試驗(見表1)，進行15組試驗(試驗安排及檢測結(jié)果見表2)。

表1 響應(yīng)面因素水平與編碼

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及轉(zhuǎn)化率

采用Design-Expert.V8.0軟件對表結(jié)果進行響應(yīng)面回歸分析，得擬合方程：R=63.33-1.50A-1.25B+5.00C-0.75 AB-0.25AC+2.25BC+0.21A2-12.29B2-23.29C2。

方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果見表3。該模型P<0.0001，表明二次方程擬合極顯著。失擬項P=0.5352>0.05(不顯著)，失擬項對純誤差沒有顯著相關(guān)性，說明未知因素對試驗結(jié)果干擾小。模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9957和調(diào)整系數(shù)Adj R2=0.9879，均表明該模型擬合程度好。測量的信噪比為35.34(>4為合理)，說明該模型可靠。以上統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)均說明方程與實際擬合良好，該模型可用于優(yōu)化酶解鳶尾苷元的工藝條件。

表3 回歸方程方差分析表

從三個因素的顯著性檢驗結(jié)果可知，各因素影響大小的排列順序為：底物與酶質(zhì)量比(C)>反應(yīng)溫度(A)>反應(yīng)時間(B)。由回歸方程可得出各因子交互作用的響應(yīng)面3D圖和等高線分析圖(見圖1)。圖中可以分析出多個自變量變化對相應(yīng)值的影響以及響應(yīng)值對不同自變量變化的敏感程度。由此同樣得到各因素影響的排列大小：C>A>B，同樣與上述方差分析結(jié)果吻合。

圖1 各因素兩兩交互作用對鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率影響的響應(yīng)圖(A溫度，B時間，C底物與酶質(zhì)量比)

對實驗?zāi)Ｐ瓦M一步解析，得到理論最佳酶解條件為：(1，-0.07，0.1)即反應(yīng)溫度85 ℃，反應(yīng)0.965 h，底物與酶質(zhì)量比1∶5.5，并且在pH為6.0時鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率最高。結(jié)合實際操作，將上述理論最優(yōu)工藝條件調(diào)整為反應(yīng)溫度85 ℃，反應(yīng)1h，底物與酶質(zhì)量比1∶5.5，并且在pH為6.0的情況下重復(fù)3此實驗驗證酶解效果。結(jié)果測得平均轉(zhuǎn)化率為62.09 %，RSD=2.23%。該結(jié)果與相應(yīng)預(yù)測值62.35%接近，證明該工藝穩(wěn)定，重現(xiàn)性較好。

4 討論

酶解反應(yīng)完成后，我們采取的是凍存的方式，但經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)，在-20 ℃的環(huán)境中該酶依舊有一定的活性，這樣就無法考察反應(yīng)時間對鳶尾苷元轉(zhuǎn)化率的影響。因此，酶解反應(yīng)結(jié)束后，立即精密量取一定量的反應(yīng)液，再加入甲醇定容，甲醇加入后會使酶完全失去活性，然后再進行色譜檢測。

5 結(jié)論

本實驗采用響應(yīng)面分析法中的Box-Behnken試驗設(shè)計法，優(yōu)化了β-葡萄糖水解酶轉(zhuǎn)化制備鳶尾苷元的工藝。本課題選擇的這種β-葡萄糖水解酶是來源于嗜熱古菌，該酶的反應(yīng)溫度較之普通的葡萄糖水解酶高出許多，因此轉(zhuǎn)化效率高，具有現(xiàn)實意義。通過實驗也驗證了該酶的轉(zhuǎn)化速率快，一般在一個小時左右就能轉(zhuǎn)化全完，且操作簡單方便，適合工業(yè)推廣。