香菇多糖中單糖組成分析技術的研究進展

邱雯曦，周禮仕，鐘輝云，王愛萍

(1.四川衛生康復職業學院藥學系，四川 自貢 643000；2.四川衛生康復職業學院基礎醫學部，四川 自貢 643000)

香菇多糖是從香菇中提取出的一種重要生物活性成分，有多種藥理活性，如：抗病毒[1]、抗腫瘤[2-3]、抗氧化[4]、抗輻射[5]、降血糖[6]等，其藥用價值甚高。香菇多糖是由不同單糖通過糖苷鍵連接而成的雜多糖，屬于高分子多聚物。1969年，香菇多糖第一次被發現并提取[7]，后被證明有抗腫瘤作用[8]，而引起了廣泛研究工作者的關注。研究藥物的構效關系具有重要意義，香菇多糖的結構與生物活性有著密切關系。對于香菇多糖結構的研究，單糖組成是最基本的研究對象。隨著人們對香菇多糖類藥品、食品和保健品的開發，質量控制的系統化研究迫在眉睫。多糖的單糖組成指紋圖譜可為香菇多糖類藥品保健品的質量控制提供重要參考。因此，單糖組成的分析研究尤為重要。

香菇多糖的單糖組成分析包括幾個步驟：將多糖水解為單糖、對單糖進行化學衍生、分離單糖組分、對分離后的單糖進行檢測分析。本文將從以上幾個方面，對香菇多糖單糖組成分析取得的進展及遇到的問題進行綜述。

1 降解香菇多糖為單糖方法的選取

降解多糖的方法較多，主要有超聲波降解法、電磁輻射降解法、高碘酸氧化、酶水解、酸堿水解法等。

1.1 超聲波法

超聲降解多糖分子屬于一種物理降解法。主要以自由基理論及機械剪切作用來解釋超聲波降解多糖分子的機理[9]。雖然此降解法操作性強具有綠色環保對外界污染小等優點，但難以將多糖分子徹底分解為單糖且影響因素較多[9-10]。因此，超聲波降解法不適合用于多糖水解產物單糖組成的分析。

1.2 酶解法

糖苷酶是目前降解多糖最常用的一類酶，通過降低多糖降解反應活化能，從而加速反應的進行。糖苷酶分為外切糖苷酶和內切糖苷酶兩類。酶法降解多糖條件溫和，反應時間短且反應效率高。β1,3-葡聚糖酶成功用于裂褶多糖的降解，凝膠滲透色譜法有效的監控了裂褶多糖降解反應程度[11]。酶催化降解多糖反應現在還存在許多不足：酶只能專一性的催化某一類底物；其次多數糖苷酶來源于生物體，難以實現大規模生產；酶需要固定載體上進行催化，若不將酶固定，則催化反應后需將其去除。但隨著研究的深入，酶解法有希望成為降解多糖的常用方法。

1.3 酸堿水解法

酸水解屬于化學方法，是分析多糖單糖組成目前最常用的降解多糖的方法。酸性溶液中有大量氫離子(H+)，利于將糖苷鍵中氧原子(O)進行質子化，從而打開糖苷鍵，苷元脫離，碳正離子溶劑化，最終質子脫去后產生單糖[12]。酸水解多糖比堿水解速率快，且單糖產物結構不易變化。早期的酸水解劑多使用鹽酸和硫酸混合酸，不僅操作麻煩且檢測結果不準確[13]。近年來，多數文獻報道以三氟乙酸(TFA)為酸水解劑[14]，但在水解氨基糖時不宜使用三氟乙酸。香菇多糖酸水解劑多使用三氟乙酸。

2 衍生試劑的選取

單糖分子結構缺乏發色官能團，不能被現在多數檢測器識別。而通用檢測器的靈敏度不夠理想，為了提高檢測靈敏度，可將單糖分子進行化學衍后進行檢測。衍生劑在不斷發展，胺和類胺化合物是較早用于單糖衍生化試劑。隨著研究的加深，出現了更多的衍生化試劑：α-萘胺、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolo, PMP)、1-(4-異丙基)苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(1-(4-isopropyl)phenyl-3-methyl-5-pyrazolone, PPMP)、2-氨基吖啶酮(2-aminoacridone, AMAC)、苯并吖啶酮-5-乙酰肼(benzoacridinone-5-acetyl hydrazine, BAAH)、3-氨基-9-乙基咔唑(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)等。PMP是最常用的單糖衍生化試劑，與糖的反應能在較溫和條件下進行且產物有較強紫外吸收，檢測限能達到皮摩爾級[15]。PMP不能衍生修飾果糖、甘露醇和山梨醇，香菇多糖降解產物因不含果糖、甘露醇及山梨醇可以選擇PMP[16]作衍生試劑。此外，α-萘胺[17]、AEC[18]也可用于香菇多糖降解單糖的衍生修飾。

3 單糖的分離檢測

香菇多糖是由葡聚糖和多種單糖通過糖苷鍵連接而成的雜環糖。分析檢測香菇多糖的方法很多，主要有氣相色譜法(GC)、毛細管區帶電泳法(CZE)、高效液相色譜法(HPLC)等。

3.1 毛細管電泳技術

毛細管電泳具有分離快速、靈敏度高及樣品用量少等優點，主要用于單糖和寡糖的分析檢測[19-21]。汲晨鋒等采用α-萘胺為衍生試劑，應用毛細管電泳對香菇多糖單糖組分及含量進行分析[17]，香菇多糖單糖組分毛細管區帶電泳譜圖見圖1。實驗結果與文獻報道基本符合。

Rha：鼠李糖；Xyl：木糖；Man：甘露糖；Ara：阿拉伯糖；Gal：半乳糖；Glu：葡萄糖

3.2 氣相色譜技術

氣相色譜法靈敏度高、重現性好，已用于多種多糖單糖組分的分析檢測[22-23]。氣相色譜法適于揮發性物質的分析檢測，而單糖沸點高不具備揮發性需衍生化生成易揮發物質，衍生過程不僅繁瑣，且衍生樣品要求較高。李健等將香菇多糖水解單糖與六甲基二硅氨烷衍生，用氣相色譜法分析單糖組成及含量[24]。文中還采用了氣相色譜質譜聯用分析法比較分析香菇多糖單糖組成及含量。趙行等將糖腈乙酰化衍生-氣相色譜法用于香菇多糖單糖組成的分析。由于氣相色譜法對樣品的衍生要求高，單糖色譜峰存有干擾，某些單糖組分需進一步確認[25]。

3.3 高效液相色譜技術

高效液相色譜法不僅不需樣品氣化，且方法高效，操作簡便，穩定性好，技術較成熟，因此廣泛用于單糖的分析檢測。高效液相色譜法的檢測器種類較多，通用型檢測器有蒸發光散射檢測器和示差檢測器，可以直接檢測單糖分子。蒸發光散射檢測器分析糖類物質不可缺少的檢測器[26]。通用型檢測最大的缺點是不僅對糖類物質有響應，氨基酸、脂類、碳水化合物等等物質均有響應。香菇除了含有多糖還富含蛋白質、脂肪酸等，若采用高效液相直接檢測法勢必會有較大誤差。紫外可見吸收檢測器是高效液相運用較廣泛的檢測器。單糖無紫外吸收，則需衍生(柱前衍生或者柱后衍生)后方能被紫外檢測器識別。單糖常用的衍生的試劑在2中已討論。柱前衍生高效液相色譜法是分析糖類物質常用的方法[27-29]。

陳志輝等[30]將提純香菇多糖，經三氟乙酸(TFA)水解后與PMP發生衍生反應，再用高效液相-二極管陣列法進行分析，共標示出13個特征峰，鑒別了6個色譜峰：甘露醇、D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖、半乳糖、木糖和L-巖藻糖。10批香菇多糖樣品HPLC指紋圖片重疊圖如圖2，相似度>0.99，表明香菇多糖PMP柱前衍生HPLC指紋圖譜具有較好的穩定性和可控性，可作為香菇質量控制和評價指標的參考依據。高效液相指紋圖譜技術已成為中藥鑒別及質量控制的重要手段。馮賢達[31]用四種不同的提取法提取香菇多糖，并對四種工藝提取的香菇多糖進行HPLC指紋圖譜對比分析，研究其單糖組成的變化。單糖成分的區別會影響香菇多糖的生物活性，通過HPLC指紋圖譜的分析可指導企業對提取工藝的選取。

圖2 10批香菇多糖樣品HPLC指紋圖譜重疊圖[30]

超高效液相色譜法不僅可以縮短分析時間而且能提高色譜分離度，減少溶劑的消耗，在中藥化學成分識別、指紋圖譜等領域發展應用，促進中藥的質量控制[32]。趙行等[16]利用超高效液相色譜對香菇多糖片中單糖組分進行分析，完全酸水解法將香菇多糖降解為單糖，PMP柱前衍生，二極管陣列檢測器檢測香菇多糖的酸水解產物。主要單糖組成為甘露糖、葡萄糖和半乳糖，含有少量的巖藻糖和阿拉伯糖。結果表明PMP柱前衍生-超高效液相色譜法是檢測香菇多糖片中單糖組分分準確、可靠、快速的方法。

HPLC法和柱前衍生化技術結合在測定多糖單糖組成方面不斷發展應用，糖類衍生化試劑也在不斷創新。張萍等[33]以3-氨基-9-乙基咔唑柱前衍生劑(ACE)，考察了AEC對不同類型單糖的衍生效果，發現AEC對中性糖的衍生效果大于酸性糖。甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和木糖六種中性單糖-AEC衍生物高效液相色譜分離圖如圖3。香菇多糖水解后生成單糖-AEC衍生物，再由高效液相-二極管陣列法分析檢測。作者據此建立了AEC柱前衍生-HPLC法分析香菇多糖單糖組成，測定結果準確可靠，為香菇多糖的研究及產品評價提高了新的參考方法。

a: Gal; b: Man; c: Glc; d: Ara; e: Xyl; f:Rha

4 結論

香菇多糖單糖組成的分析對香菇多糖藥物、香菇多糖保健品、香菇藥材原料的鑒定起著重要作用。文中論述了香菇多糖單糖組成分析過程，水解、衍生、分離、檢測主要環節的技術的新進展。香菇多糖降解主要采用的是酸水解技術，但隨著生物技術及人工酶、納米酶的發展，酶解法可能發展成降解多糖的常用手段，在溫和的條件下實現多糖的降解。對比天然酶，人工酶及納米酶具有價格便宜、穩定性好、循環利用率高等優勢。未來有望發展水解多糖的人工酶或納米酶。隨著色譜技術的快速發展，有可能設計響應單糖的專屬檢測器，以省去衍生環節，不僅簡化單糖的分析檢測過程，而且避免衍生過程影響分離分析結果。