不同國家和地區傳統發酵食品及其發酵微生物研究進展

劉飛翔，董其惠，吳 蓉，邱益彬，黃燕燕，蘇二正,4,*

（1.南京林業大學輕工與食品學院，江蘇 南京 210037；2.亳州學院生物與食品工程系，安徽 亳州 236800；3.南京林業大學南方現代林業協同創新中心，江蘇 南京 210037；4.南京林業大學林業資源高效加工利用協同創新中心，江蘇 南京 210037）

自人類文明誕生以來，發酵技術就成為人們加工和保藏食品的重要工藝方法之一[1-2]。在新石器時代，人類就采用了發酵方式保存易腐敗的食物[3-4]。在隨后的幾千年里，各個地區不斷出現發酵飲料、發酵乳制品、發酵面團、發酵香腸等傳統的發酵食品。這些發酵食品對于科技不發達的古代人們而言，起到了保藏食品、豐富食品種類和有益身體健康的作用。即使是現代，對于一些經濟不發達的發展中國家，特別是對非洲地區的人們，發酵食品對于其日常飲食健康的作用依然十分明顯[5]。

由于世界上各個地區的飲食習慣以及工業化水平的發達程度不同，導致各個國家和地區的發酵食品的種類、工藝方法和監管措施有所不同。歐洲等發達地區的發酵食品商品化程度高，而非洲、亞洲和拉丁美洲等的發展中國家以傳統家庭式發酵食品為主，但隨著經濟的發展，有些傳統發酵食品正在逐漸消失[6]。以特定菌種為發酵劑的商品化發酵食品可以使產品質量更加穩定和安全，但往往不具備傳統家庭手工發酵食品所具有的風味。因此，近些年“天然”的家庭手工發酵食品更加受到人們的喜愛，但為了滿足不斷擴大的市場又必須進行工業化生產[2]。

自微生物學家列文虎克發現并描述微生物起，人類開始逐步認識到微生物對于生產和生活的重要性。對于自然發酵的傳統發酵食品而言，通常同時含有細菌、酵母和霉菌中的許多菌株。在發酵過程中，由于食品基質、工藝操作和微生物與微生物間相互作用等因素，使得某些微生物類群可以暫時占據主導地位。微生物的演替過程中，不同的微生物類群相繼發揮其功能，最終形成質量獨特的發酵食品。研究者們采用分離培養的方法，以揭示發酵食品中的微生物類群和演替規律。近年來，隨著分子測序技術的發展，特別是高通量測序的應用，人們得以逐漸認識各種發酵食品中微生物群體的多樣性分布、菌種間的相互作用、產品品質以及食品安全問題。

為此，本文從各個地區發酵食品的種類、主要食品微生物類群與監管制度、微生物群體對發酵食品的作用、食品微生物間的相互作用和宏組學方面在食品微生物中的應用進行綜述。

1 發酵食品、食品微生物及其監管制度

1.1 發酵食品的定義與分類

發酵食品是指通過微生物或酶的作用，使原料基質發生有益的化學變化，從而得到質地、口感和營養俱佳的食品[3,7-8]。世界各地的發酵食品根據原料的不同大致可分為9 類：動物奶類、谷物類、肉類、豆類、蔬菜類、植物根莖類、魚類、酒精飲料類及其他[8-10]（表1）。由于世界各地農作物的主產區不同，使得傳統發酵食品有著很強的地域民族特色。

表1 世界各地發酵食品的主要分類Table 1 Categories of fermented foods from around the world

1.2 食品微生物的定義和范疇

2012年，歐洲食品和飼料協會對食品用微生物給出了明確的定義，即可用于食品生產的活的細菌、酵母和霉菌[18]。

幾乎在所有的傳統發酵食品中都會有細菌的參與，其中最主要的類群是乳酸菌。乳酸菌包含了大約4 0 個屬的3 8 0 種細菌，主要的屬有Bifidobacterium、Enterococcus、Lactobacillus、Leuconostoc、Lactococcus、Pediococcus、Streptococcus、Tetragenococcus、Vagococcus和Weissella[19]。乳酸菌最主要的代謝功能是將食品基質中的糖類轉化為乳酸，降低環境的pH值，從而達到防腐保藏食品的目的。此外，乳酸菌還可代謝產生其他類型的有助于改善食品風味、增強食品營養和安全性的化合物，其機理將在下文中具體介紹。除了乳酸菌，一些發酵食品中還含有許多其他類型的細菌，如亞洲地區的發酵豆制品中含有芽孢桿菌屬（Bacillus），其最主要的功能是產生蛋白酶，將豆制品中的蛋白質水解成更易消化吸收的功能性小分子多肽和氨基酸[12]；在果醋和泡菜的發酵過程中含有醋酸菌屬（Acetobacter），可將其他微生物代謝產生的乙醇轉化成乙酸。

據報道，大約有21 個屬的酵母分別存在于不同的發酵酒精飲料和食品中，主要屬有Brettanomyces、Candida、Cryptococcus、Debaryomyces、Galactomyces、Geotrichum、Hansenula、Hanseniaspora、Hyphopichia、Kluyveromyces、Metschnikowia、Pichia、Rhodotorula、Saccharomyces、Saccharomycodes、Saccharomycopsis、Schizosaccharomyces、Torulopsis、Trichosporon、Yarrowia和Zygosaccharomyces[20]。其中，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）在面包、酒精性飲料等發酵食品中的應用最為廣泛，在發酵過程中主要把小分子糖類轉化成乙醇和二氧化碳，也可代謝產生少量的其他風味性物質。

在亞洲地區許多發酵食品的制曲過程以及西方國家的奶酪和香腸的成熟過程中，霉菌也是主要的微生物之一。主要的類群包括Amylomyces、Aspergillus、Monascus、Mucor、Neurospora、Penicillium、Rhizopus和Ustilago[20]。這些霉菌在發酵食品中的主要作用是產生各種水解酶類，把食品基質中的大分子物質轉化為易吸收的小分子物質，同時這些小分子物質也有助于細菌和酵母的生長代謝。

1.3 食品微生物的監管制度

在過去的幾十年中，食品微生物的應用直接或間接地被不同地區的監管制度約束著。然而，不同地區的監管體系中所規定的可用于食品的微生物清單卻不盡相同，為了防止誤用或亂用微生物的安全使用清單，需對各監管體系建立微生物清單的方法原理有所了解[21]。

美國聯邦食品與藥品法規定，任何加入食品中的物質都稱為食品添加劑，這些物質在產品上市之前必須經過食品藥品監督管理局（Food and Drug Administration，FDA）的審核和通過[22]。FDA采用“公認安全物質”（generally recognized as safe，GRAS）標準對添加到食品中的添加劑進行監管。個人或公司可以向FDA提交某物質屬于GRAS的申請，FDA審核通過后，某物質便可作為添加劑添加到食品中。FDA每月會對GRAS清單進行更新，截至到2019年7月，FDA官網公布的GRAS清單共847 條，其中與微生物相關的有253 條，共涉及81 種微生物。此外FDA也規定，對于1958年之前一直安全使用的添加劑，默認屬于GRAS。食品微生物是發酵食品中的一部分，1958年之前的傳統發酵食品有著悠久的食用歷史，所以這些傳統發酵食品中的微生物自然也屬于GRAS的范疇[18]。

歐洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）從2007年開始通過安全資格認證（qualified presumption of safety，QPS）體系，對食品微生物的安全性進行監管。與FDA類似，企業在使用不在QPS清單的微生物用于新食品生產時，必須提交申請，并對該微生物進行安全評估。根據2019年最新更新的QPS清單，QPS體系將微生物分為5 類：革蘭氏陽性不產孢子（59 種）；革蘭氏陽性產孢子（15 種）；革蘭氏陰性菌（3 種）；酵母（16 種）；病毒（2 個科）[23]。2014年之前，QPS清單每年更新一次，此后每6 個月出一份聲明，每3 年出版一份意見。此外，歐盟也對具有食用歷史的食品做出了規定，1997年之前的食品不屬于新型食品[24]。因此，屬于傳統發酵食品一部分的微生物同樣不受新型食品的監管。

2002年，國際乳品協會（International Dairy Federation，IDF）與歐洲食品與飼料菌種協會（European Food and Feed Cultures Association，EFFCA）出版了一份關于發酵乳制品的微生物清單，為乳制品行業提供參考。并在2012年，IDF/EFFCA將該清單范疇擴展到了以肉、魚、豆類、蔬菜和谷物等為原料的傳統發酵食品領域[18]。IDF/EFFCA的微生物清單盡可能詳盡地列出了傳統發酵食品涉及的微生物種類，并保持不斷更新。根據2018年更新的清單，共列出了321 種或亞種微生物，其中原核類226 種，真菌類95 種[25]。

對比以上3 類食品微生物監管體系及其清單發現，FDA的GRAS清單和EFSA的QPS清單的更新是建立在有企業或個人提交申請的基礎上的，是一種被動的更新。而IDF/EFFSA清單是一種主動的更新，微生物的種類比以上兩種清單要多很多。所以不在GRAS和QPS清單中的微生物并不一定是不安全的，可能是還沒有提交。值得注意的是IDF/EFFSA列出的微生物清單是指傳統發酵食品中的微生物，而FDA和EFSA等許多地區對于傳統發酵食品種的微生物并沒有單獨一一列出，而是強調食品的安全使用歷史。此外，清單中的微生物往往都規定了其使用范圍，及用在何種發酵食品中，如果改變其原有用途，則需要重新向相關監管體系重新提交申請[18]。

目前，我國在可用于食品的微生物（36 種）、嬰幼兒食品和保健食品益生菌（11 種）、保健食品真菌（11 種）中分別規定了相關微生物的清單，并強調“傳統上用于食品生產加工的菌種允許繼續使用”。但按照《新食品原料安全性審查管理辦法》，用于開發新食品的傳統食品中的微生物，則需要向國家相關部門重新提交申報和審批[26]。由于微生物在不同的食品基質和微生物區系中，其新陳代謝的途徑已有所不同，因此將傳統發酵食品中的微生物在新食品中進行應用，需要重新考慮其安全性。

2 不同國家地區傳統發酵食品的種類和微生物類群

由于世界各地主要糧食作物、微生物環境和飲食習慣的不同，所以傳統地域性發酵食品的種類也隨之各異。隨著大航海時代的開始到當今的全球化大發展，不同的發酵食品被不同文化的地區或國家逐漸接受。Soni[9]從全球視角綜述了發酵食品的主要類別，以一個整體的觀點識別各種發酵產品。本節從歐美、非洲、拉丁美洲和亞洲4 個地區，分別闡述當地土著人民的主要的傳統發酵食品及其微生物類群，以揭示其主要特色和功能。

2.1 歐美地區

如表2所示，歐美國家的主要發酵食品主要包括面包、酸奶、奶酪、開菲爾、發酵香腸和葡萄酒等。埃及金字塔上的壁畫表明，在公元前3 000 年左右人類已經開始學會制作面包[27]。烘焙面包是西方國家的主食之一，制作的主要原料為小麥粉、水、鹽和酵母菌，面團經發酵后在高溫烘焙形成面包；在和面過程中，也可加入乳酸菌劑、雞蛋、奶粉和乳化劑等可選的輔助材料，以產生不同風味類型的面包[27]。在小麥和黑麥面包的制作時，古時人民往往將上批次發酵好的酸面團留下小部分，作為下一批次和面時的發酵劑[28]。酸面團中的酵母可產生醇、醛和酯等揮發性風味化合物，從而賦予面包獨特的香甜味，乳酸菌產生的乳酸是酸性面包的酸味來源[29]。同時，酵母和乳酸菌產生的二氧化碳氣體使面包形成蓬松的質地。除了形成風味化合物和特有的質地外，發酵面包中水分的保持和抗真菌化合物的形成，可以延長面包的保質期。此外，酸面團發酵過程中發生的生化反應可以提高面包的營養價值[27,30]。直到19世紀，商業化面包發酵劑開始應用于工廠中面包的生產，但是酸面團面包的獨特風味和更加有益健康的優點，使其更受人們歡迎[31]。

奶是哺乳動物產生的一種富含蛋白、脂肪、糖類、維生素、礦物質等營養的分泌物，以保證初生后代的生長發育。考古證據表明在公元前9 000 年，人類已在巖石上刻畫了擠奶的場景，表明人類很早就從馴化后的哺乳動物汲取奶類，以增強自身的營養，但是這些高營養的自然奶同時也利于一些腐敗菌的生長，導致其不宜貯存[32]。在一些主產奶地區，人們把各種動物奶通過發酵作用制作成酸奶、奶酪和開菲爾等奶制品。發酵奶制品中最常見的微生物為乳酸菌，例如酸奶是在嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌共同參與下形成的。除了乳酸菌等細菌以外，奶酪和開菲爾中還含有真菌[33-34]。發酵后的奶類，由于富含乳酸、細菌素等抗菌性物質，能有效延長防止腐敗菌或病原菌的生長[35-36]。同時，酸奶中富含許多對人體健康有益的益生菌，如雙歧桿菌和嗜酸乳桿菌等[37]。

在歐洲地區發酵香腸也有著悠久的食用歷史，一般采用豬肉或其他動物的鮮瘦肉和鮮脂肪為主要原料，其發酵和后熟的過程中，會有乳酸菌、酵母和霉菌的參與，經過微生物的新陳代謝和相互作用，便可形成風味獨特的發酵香腸[11]。與其他發酵食品一樣，發酵后的香腸相對于其原料本身有著更長的保質期和更豐富的風味物質。

一些富含糖類的水果可經發酵作用變成水果酒，最常見的水果酒為葡萄酒。根據葡萄的種類、發酵的方式可將葡萄酒分為若干類型，但所應用的微生物均包括酵母菌和乳酸菌。酵母菌所主導的乙醇發酵是釀酒過程中的最主要的發酵過程，期間一些酵母菌可形成不同的特征型風味物質。此外，在葡萄酒發酵的后期，乳酸菌可將蘋果酸轉化形成乳酸，從而使酒體的酸味更加柔和[38]。

表2 歐美地區主要發酵食品的類別和主要微生物類群Table 2 Main microbial groups in various categories of fermented foods in Europe and America

2.2 非洲地區

由于非洲獨特的自然環境，使得該地區的農作物以薯類為主，其次是谷物。谷物以玉米、高粱等粗糧為主，而營養價值更高的大米和小麥很少種植。因此，非洲地區主要的發酵食品分為兩大類：發酵木薯類和發酵谷物類，但發酵奶制品和發酵蔬菜等發酵食品也少量存在。發酵谷物類，是以高粱粉、玉米粉和小米為原料，與水和成面團后，經乳酸菌和酵母自然發酵，再經水蒸或烘烤制作而成，其制作過程類似西方的面包和我國的饅頭。在非洲不同的地區根據原料和具體工藝的不同，又可分為Hussuwa、Kenkey、Kisra和Injera等不同的發酵谷物食品[14]。另一種重要的發酵食品為發酵木薯，根據不同的地區發酵工藝的不同也可分為很多的類型，其中Gari是非洲分布最廣的發酵木薯食品[39]，其發酵過程涉及的微生物類群比較廣泛，包括乳酸菌、芽孢桿菌、酵母和霉菌。經微生物發酵后，木薯的營養價值不僅可得到提升，還可去除其中的有毒物質[2,39]。

2.3 拉丁美洲地區

同非洲地區類似，拉丁美洲地區的土著居民也主要使用谷物類和根莖類作為發酵食品的原料，但谷物類主要包括玉米、大米、花生和棉籽等，根莖類除了木薯以外還包括紅薯和馬鈴薯[40]。同樣的，由于不同的地理環境和文化信仰差異，該地區的傳統發酵食品也因地而異，大致分為非酒精性發酵飲料（Cauim、Yakupa、Pozol、Tejuino、Calugi）、酒精性飲料（Tarubá、Caxiri、Chicha、Champú、Pulque、Cacha?a）及其他發酵食品（Masa agria、Tocosh、Cacao）[40-41]。這些傳統發酵食品基本采用自然發酵的方式進行，所涉及到的微生物基本包括酵母、乳酸菌、醋酸菌以及部分好氧的腸桿菌[41]。

非酒精性飲料多采用玉米和薯類作為原料，發酵后具有清爽提神的作用，是拉丁美洲地區土著人民日常飲食的一部分。以木薯為原料的Cauim為例，其制作流程為：首先將木薯進行浸泡、削皮、切片、日曬、粉碎、調漿和蒸煮處理，再加入經人口腔咀嚼后的木薯，最后發酵24～48 h后，可直接飲用[42]。咀嚼后的木薯中含有人的唾液淀粉酶，可將淀粉成分水解為小分子的發酵糖類。采用咀嚼將淀粉酶添加原料中的方式，同樣出現在酒精性飲料的產品中。以Chicha為例，南美地區土著部落中的婦女和孩子坐在一起，將咀嚼后的玉米吐到裝有溫水的容器中，經發酵后便得到一種黃色的渾濁酒，乙醇體積分數可達到6%左右[41]。由于不衛生和潛在的危險，使得這種方法在許多國家被禁止。現在Chicha的生產采用經浸泡發芽后含有淀粉酶的玉米進行發酵，從而解決淀粉糖化的問題，但此方式發酵后的酒產品卻缺少了原始發酵方式獨有的酸味[43]。酒精性飲料方面，拉丁美洲還有兩種蒸餾酒，即以甘蔗汁為原料的Cacha?a和以龍舌蘭屬植物為原料的龍舌蘭酒。除飲料外的其他發酵食品，主要包括發酵玉米面團（Masa agria）、發酵土豆（Tocosh）和發酵可可（Cacao）。

2.4 亞洲地區

亞洲地區的傳統發酵食品主要有發酵豆制品、酒類、泡菜、饅頭、醋、發酵茶等。本節主要介紹特色鮮明的發酵豆制品、酒類和發酵蔬菜。

發酵豆制品大多起源于我國，如豆醬、醬油、豆豉、腐乳等在我國已有約2 000 年的食用歷史，后傳播到周邊國家，逐漸形成了自己獨特的產品，如日本的納豆和印度尼西亞的丹貝[44-45]。大部分發酵豆制品的工藝過程比較類似，以豆醬為例主要過程包括：浸泡、蒸煮、瀝干、制曲、加入鹽水和發酵[46]。傳統的自然制曲過程中，各種霉菌會在基質表面生長，并分泌許多水解酶類將大分子有機化合物水解為小分子類，結合后續細菌和酵母的發酵，便得到味道鮮美、醬香濃郁的豆醬。這種發酵后的黃褐色半固態醬醅，經過濾得到的醬汁，可作為日常的調料品，即醬油[45]。值得一提的是，納豆的生產沒有制曲的過程，瀝干的大豆被包埋在經水煮后的稻草中，水煮后的稻草含有耐高溫的芽孢桿菌屬細菌，接種到納豆后，經約40 ℃發酵20 h左右即可得到表面富含黏性物質的豆制品。這些發酵豆制品因含有活性肽、納豆激酶等生物活性物質，因此也被認為是營養價值比較高的功能性食品[44-46]。

亞洲地區的傳統酒類主要是以谷物原料釀造的黃酒、燒酒和白酒。黃酒起源于我國，在我國已約有5 000 年的歷史，在我國、韓國、日本和東南亞地區都有著傳統的飲用習慣，是著名的三大發酵酒之一[47]。黃酒的生產以糯米、稻米和小麥等為主要原料，經蒸煮、糖化、發酵、儲存和煎酒等工藝單元釀造而成。黃酒的操作過程的特點是需加入麩曲作為糖化劑，水解產生的單糖可被酵母及時利用，從而實現邊糖化邊發酵的模式，可避免高糖濃度對酵母的影響，發酵終乙醇體積分數最高可達20%[48]。黃酒的制曲和發酵的過程所涉及的微生物主要包括曲霉、根霉、毛霉、酵母、醋酸菌和乳酸菌等微生物[49]。自蒸餾技術出現后，將發酵后的黃酒蒸餾，便得到晶瑩透明的蒸餾燒酒，一般乙醇體積分數在20%左右，目前該酒在日韓較流行。我國的白酒也屬于蒸餾酒，但采用固態發酵法釀制，釀造工序和涉及的微生物也比日韓的燒酒復雜的多。白酒除了水和乙醇這兩種主要成分外，還含有約1%的風味物質成分，其中已經發現的風味化合物多達一千多種，按照這些風味化合物的組成比例，可將白酒分為12 種香型[50]。白酒釀造屬于開放式的自然發酵過程，釀造廠所周圍的特定環境和微生物區系，是形成不同風味的白酒典型特征的主要原因之一。所涉及的微生物種類主要來自曲、酒醅和窖泥中，具體的物種也比較繁多，也正是這種復雜的微生物種類，才能形成白酒的眾多風味化合物，造就白酒不同的風格[51]。

蔬菜屬于季節性種植產品，古時人們采用發酵的方式可以很好地達到貯存的目的，并且在風味口感上得到提升。所用原料也比較廣泛，主要包括白菜、甘藍、蘿卜、黃瓜等，加工制作過程中也可根據個人喜好，加入辣椒、花椒、生姜和酒等輔料[52]。發酵蔬菜主要包括醬菜、腌菜和泡菜[53]，其特點均包含加鹽腌制和乳酸菌發酵兩個過程[52]。高鹽分有利于植物上的一部分乳酸菌生長，產生的乳酸使pH值降低，進一步促進了更多乳酸菌的生長。此外，異型乳酸菌發酵過程中，除產生乳酸外，產生的乙醇、乙酸等微量成分，有利于風味物質的進一步形成。

3 微生物發酵對食品的作用

如圖1所示，食品微生物對食品的作用可概括為5 個方面：延長食品的保質期、改善營養價值、去除抗營養因子、改善腸道菌群和提升食品感官品質[2,10,18,21]。

圖1 微生物發酵對食品的作用[2,10,18,21]Fig. 1 Effect of microbial fermentation on foods[2,10,18,21]

3.1 延長食品保質期

發酵食品最初的目的就是為了保藏食品，延長食品的貨架期[2,54-55]。發酵保存食品的原理在于，碳水化合物及其衍生物會被氧化為有機酸類、醇類和二氧化碳等發酵的初級或次級代謝產物，這些物質可以抑制腐敗微生物的生長；并且這些物質的氧化只是部分氧化，所以食品還保留足夠的營養[2,54]。

許多發酵食品都含有乳酸菌，關于微生物延長發酵食品保質期的功能研究也多集中在乳酸菌類群上，研究表明乳酸菌類群中的一些菌種對于食品腐敗和致病菌有著較好的抑制作用[56-60]。乳酸菌在發酵食品中首先產生抑菌效應，是乳酸菌通過產生的酸類物質，降低基質的pH值實現的[36]。其主要機理為：乙酸、乳酸、丙酸等有機酸可干擾細菌細胞質膜的膜電位維持，抑制膜的主動運輸作用[61]。它們對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌以及酵母和霉菌均有抑制作用[2,62]。例如美國食品藥品監督局批準的一種由費氏丙酸桿菌Shermanii亞種（Propionibacterium freudenreichii subsp. Shermanii）生產的富含丙酸的發酵液，可用于生產干酪[36]。乳酸菌除了產生上述的有機酸、醇類和二氧化碳，還可產生過氧化氫、雙乙酰等小分子抗菌物質[60]。乳酸菌可在有氧條件下，由黃嘌呤氧化酶或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸過氧化物酶作用產生過氧化氫，其對膜脂和細胞蛋白有較強的氧化作用，從而達到抗菌的作用[63]。此外，乳酸菌通過檸檬酸代謝產生的雙乙酰，除了是許多發酵食品中的重要風味物質之一，也是重要的抗菌物質之一，革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌對其較敏感[2,64]。

除以上小分子的抗菌物質外，乳酸菌還可以產生一些被認為是“天然防腐劑”的多肽物質，稱為細菌素[35,65]。細菌素可以殺滅或抑制食品中的腐敗菌和病原菌，從而使其產生菌株或同種下的相近菌株獲得生長優勢[2]。細菌素的作用目標往往是細胞膜，由于革蘭氏陰性菌細胞壁外還有脂多糖的保護，因此細菌素只對革蘭氏陽性菌有活性[66]。對于革蘭氏陰性菌可采用食品級的螯合劑，如乙二胺四乙酸和檸檬酸鹽來去除其脂多糖的鎂離子，從而增加細菌素對革蘭氏陰性菌的抑制作用效率[67]。因此產生細菌素的菌株可作為發酵食品發酵劑的一部分或輔助物，以提高食品安全性和質量。

細菌素相對于傳統抗生素的一個優點是消化酶可以破壞它們，對人體健康沒有任何毒性影響，且沒有改變食物的感官特征，可作為化學防腐劑的替代品，所以將細菌素或產生細菌素的乳酸菌應用于生物防腐領域，具有廣闊的前景[68-69]。目前乳酸鏈球菌素A/Z和片球菌素PA-1已經被商業化生產，并被許多國家批準使用[70]。乳酸鏈球菌素和片球菌素由于具有抗菌譜廣、低濃度抗菌能力強和穩定性高等優勢，所以也是被研究的熱點[69,71]。近些年有許多研究不斷發現新的細菌素種類，但產品的安全性和經濟性是細菌素商業化的主要挑戰。

3.2 改善食品的營養價值

發酵過程中微生物可產生各種水解酶，將大分子的糖類、蛋白質和脂類等物質降解成更加容易吸收的功能性小分子活性物質，從而增加食品的生物利用率，并產生功能性營養成分[72]。

被降解的小分子物質可為后續微生物發酵提供必備的物質基礎，保障了發酵過程的順利進行。在我國和亞洲其他地區，在制作白酒、醬油的過程中，往往先通過制曲的方式，從環境中富集大量微生物，使其誘導產生碳水化合物水解酶類、蛋白酶類和脂肪酶類。這些酶類將谷物原料中的大分子物質降解成小分子物質，從而可被后續發酵過程中的釀酒酵母、乳酸菌等不可利用大分子的微生物吸收利用[2]。其次，在大分子水解的過程中可產生許多功能性小分子。例如，在亞洲的許多發酵豆制品中，原料中富含的蛋白質可被芽孢桿菌（Bacillus sp.）產生的蛋白酶水解成生物活性肽[12]。發酵食品中的生物活性肽對人體免疫調節[73]、抗血栓[74]和抗高血壓[75]均有一定的功效。此外，食品發酵過程中產生的酶類本身也具有一定營養功效。如在我國，由面粉、青蒿、蒼耳草、辣蓼、赤小豆、苦杏仁和麥麩等經天然發酵制成的六神曲，可被用于治療消化不良，其原理也在于曲中含有各種消化酶類[76]。又如，日本納豆中的枯草芽孢桿菌納豆亞種（Bacillus subtilis subsp. Natto）可產生納豆激酶，顯示具有纖溶活性，其可水解血管中纖維凝塊，從而有效治療和預防血栓[77]。

除了大分子的糖類、蛋白質和脂肪，用于發酵食品的植物基原料中還含有大量的多酚類化合物，經過發酵處理后，營養價值也可顯著提高[78]。在谷物、水果和蔬菜等植物中多酚類化合物的類群比較廣泛，比如，酚類化合物、類胡蘿卜素、花青素和生育酚等[79]。并且這些多酚類化合物，通常以酯鍵、醚鍵或糖苷鍵與細胞壁組分結合，從而以不溶形式存在。但在發酵過程中，微生物會產生不同的胞外酶，經水解作用從基質中提取或釋放多酚類物質，同時通過微生物的二次代謝產生新的多酚類化合物[80]。例如在亞洲地區的許多發酵豆制品中，各種大豆異黃酮葡萄糖苷被水解成相應的大豆異黃酮糖苷配基，相應的發酵食品有我國的豆豉[81]、日本的納豆[82]等。

3.3 去除食品中抗營養成分

一些用于食品發酵的原料含有一些有毒的物質或者抗營養因子，經發酵處理后，其可被顯著去除[83]。最典型的例子是非洲的Gari和Fufu這兩種以木薯為原料的發酵食品。木薯是非洲地區的主要經濟作物之一，但由于含有生氰糖苷這一高毒性的物質，其不可以直接食用[2]。木薯經明串珠菌、乳酸菌和鏈球菌發酵后，生氰糖苷被轉化為低沸點的氫氰酸，在烘焙過程中從脫水漿中脫出，從而變成了可安全食用的發酵食品[84-85]。

植酸屬于植物基食品中一種廣泛的抗營養因子，能很強地結合鐵、鋅等礦物質，使它們無法在體內吸收[86]。玉米、高粱和小米等不同谷物中的植酸，可通過乳酸發酵激活植酸酶，有效地減少植酸的含量，從而提高礦物質的利用率[87]。

3.4 改善腸道菌群

益生菌是指當被宿主以適當劑量攝入時，能夠有益宿主健康，且具有生命活性的微生物類群[88]。食品中的益生菌，除了有上述提高食品的保質期、營養價值和安全性作用外，其對宿主腸道健康也有著很大的積極作用。益生菌必須具有抵抗胃液和膽汁的能力，并能夠在消化道中增殖和定植[89]。益生菌對宿主最顯著的益處在于可以抵抗腸道病原菌，其機理總結有4 點：競爭營養和空間、產生抗菌物質、改變腸道的環境和提高宿主的免疫力[89]。

如表3 所示，常見的益生菌主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）、腸球菌屬（Enterococcus）和雙歧桿菌屬（Bifidobacterium）[89]。近年來，酵母菌和其他微生物也被開發成為潛在的益生菌[90]。發酵乳制品是益生菌中乳酸菌最重要的傳統來源[72]。此外，在泡菜、香腸、紅酒等發酵食品中也可分離出許多的益生菌[91-92]。因此，食用富含益生菌的發酵食品，對身體健康有良多益處。

表3 可用作益生菌的微生物[89]Table 3 Microorganisms used as probiotics[89]

3.5 提升食品的感官品質

微生物發酵可從食品的色、香、味和質地4 個特征上提升食品的感官品質[2,6,10,18,72]。食品中風味包括了人口腔的味覺、鼻腔的嗅覺和三叉神經的感覺[93]。發酵食品的風味物質可分為揮發性成分和非揮發性成分。發酵食品的香氣成分是由揮發性風味物質組成，通過人的嗅覺被感知，令人愉悅的香氣可以增加人的食欲，增強人的消化功能；非揮發性風味物質通過味覺和三叉神經的感覺被感知[93-94]。

發酵食品風味物質的形成主要包括原料基質的水解反應、微生物代謝產物的合成反應或酶催化各分子進行的生化反應[95]。如前所述，發酵過程中微生物會產各種水解酶，將食品原料大分子物質水解成小分子物質。以富含蛋白質的原料制品為例，蛋白質經水解后可形成不同氨基酸組成的多肽，這些多肽不僅具有生物活性功能還具有鮮味[96]。此外，還可水解產生游離的氨基酸，其中谷氨酸和天冬氨酸呈現鮮味，丙氨酸和甘氨酸呈現甜味[97-98]。經酶解形成或原料中自身含有的小分子物質可作為營養物質或風味物質的前體，被微生物吸收和利用后產生新的代謝產物，或經微生物產生的酶催化合成新的物質，這是許多發酵食品風味物質的重要來源。如原料水解后的還原性單糖、氨基酸和脂肪酸可被酵母、乳酸菌等微生物吸收轉化為醇類、醛類、酸類、酯類、酮類、萜類和吡嗪等呈香呈味物質[97,99-100]。

4 發酵食品中微生物間的相互作用與發酵劑的開發

4.1 食品微生物間的相互作用對發酵劑開發的意義

傳統發酵食品往往采用自然接種的方式，微生物來源于周圍環境和原料基質本身，但微生物種類的波動，或一些腐敗致病菌的出現，會直接影響到發酵的成功與否，并會導致產品質量和安全的不穩定。為了能夠更好地對發酵過程進行控制，人們采用特定菌種的發酵劑接種，或使用回滾方式進行接種，即使用上批次成功發酵后的含有有益菌種的培養物接種[10,101]。但該方法的缺陷會造成產品失去多樣化，缺失地域風格，所以家庭手工式發酵食品因具有獨特的風味而更加受到人們的喜愛。為此，目前商業化的發酵劑面臨的挑戰之一就是使用發酵劑大規模生產質量穩定的發酵食品，但同時又不失去傳統產品的獨特風味[2]。

目前使用的發酵劑主要是乳酸菌、酵母和一些霉菌，這些微生物經過數千萬年的進化，通過基因的獲得和缺失的方式，使自身能夠在發酵食品的生物環境中獲得相應的生態位[102]。發酵食品中這些特征型微生物被分離出來，被用作發酵劑，從而保證食品的穩定性，但食品自然發酵過程中所涉及的微生物大多是復雜多樣的。多樣的微生物通過相互作用使自身的功能特性發生改變，從而使整個發酵食品系統內的整個微生物體系的種類構成和功能發生改變，最終將影響到發酵食品的品質和安全性[103]。詳細了解這些交互作用是優化和控制發酵食品質量的先決條件[104]。目前很多文獻報道了發酵食品中微生物間的演替過程，但這些都屬于描述性的研究，微生物間相互作用的機理仍然不夠清晰，使得開發混合菌種的發酵劑遇到阻礙[101]。因此，厘清發酵食品中微生物間相互作用的機理，可以幫助人們開發出新的混合菌種的發酵劑，更好地調控發酵過程參數，從而生產出品質穩定、優良的發酵食品。

4.2 食品微生物間相互作用類型與機制

微生物間的相互作用主要可分為5 種類型：偏害共生（-/0）、競爭（-/-）、互利共生（+/+）、寄生（+/-）和偏利共生（+/0）[105-106]。偏害共生是指微生物產細菌素、有機酸和乙醇等發酵終產物對其他微生物造成傷害，而這些終產物對產生菌無不利影響。例如，乳酸乳球菌產生的乳酸鏈球菌素可抑制李斯特菌或其他乳酸菌的生長[101]。但這些終產物并不能保證其產生者在整個發酵食品的生態環境中占據主導地位，因為仍然存在著一些對這些抑菌物質不敏感的菌種，與其爭奪營養物質和空間。這種相互爭奪基質中的營養與生存空間的相互作用稱為競爭。例如，在一些食品的發酵過程中，微生物相互爭奪奶酪中的氮源、紅酒中的硫胺素等，這種競爭關系在微生物的演替中起著決定性的作用[107]。互利共生是指不同微生物間在共生的過程中均從對方受益的一種相互作用。典型的例子是在酸奶發酵過程中，保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）為嗜熱鏈球菌（Streptococcus salivariussubsp.thermophilus）提供多肽和氨基酸，嗜熱鏈球菌以此產生甲酸、葉酸和二氧化碳，反過來再促進保加利亞乳桿菌的生長[108-109]。偏利共生是指一種微生物因另一種微生物而受益，但另一種微生物不受影響的相互作用。如可以產蛋白質水解酶的乳酸乳球菌陽性菌株（prt+），可以向陰性菌株（prt-）提供氮源，但陽性菌株本身不受影響。食品微生物中的寄生現象主要是指噬菌體的感染。噬菌體的寄生，一方面可通過噬菌體的轉導作用，增加微生物物種間基因重組的概率，豐富遺傳的多樣性[110]；另一方面，可在微生物的演替中消滅有關微生物[111]。

上述各種相互作用的類型多是通過營養上的競爭、功能的互補或產生抑制物等作用機制來介導的。此外，運用細胞間群體感應（quorum sensing，QS）解釋食品微生物間相互作用的機制，是該領域研究的熱點內容之一。據報道，在發酵蔬菜、酸面團、乳制品、葡萄酒等多種不同發酵食品的生產過程中，存在大量微生物的QS，表明QS在這些發酵食品的發酵過程中起著重要的作用。如調節發酵食品中微生物的生物膜的形成、耐酸性脅迫、細菌素的產生、黏附、形態轉換和定向生長等[112]。QS涉及到信號分子的合成、分泌和檢測。正在增殖的微生物細胞將合成的信號分子分泌到胞外，并且信號分子的濃度和細胞濃度成正比例關系，當這些信號分子達到一定閾值時，細胞會相應地同時調控自身相關基因的表達[113-114]。

目前細菌中報道的信號分子主要包括3 類：酰基高絲氨酸內酯（acylhomoserine lactones，AHL）、自誘導多肽（autoinducer peptides，AIP）和自誘導物2（autoinducer-2，AI-2）[115]。AHL主要是革蘭氏陰性菌產生的一種群體信號分子，當AHL達到一定閾值濃度時，會和相應的轉錄激活蛋白LuxR結合，從而啟動相關基因的轉錄表達，但由于LuxR對AHL具有很強的特異性，因此AHL介導的QS用于種內的信息交流。食品中許多的腐敗菌多屬于革蘭氏陰性菌，如熒光假單胞菌是發酵牛奶中主要的腐敗菌之一，其QS的信號分子為六烯基高絲氨酸內酯，研究者通過添加呋喃有效抑制了腐敗菌的QS，從而延長了發酵牛奶的保質期[116]。

AIP作為革蘭氏陽性菌QS系統中的信號分子，是一種分子質量小且具有特異性的多肽類物質。前文所述的細菌素屬于典型的AIP分子，對于發酵食品中微生物的演替和防腐起到重要作用。例如，在發酵蔬菜汁中，當植物乳桿菌的細胞濃度達到一定時，植物乳桿菌素介導的QS系統可有效抑Bacillus megateriumF6的生長[117]。

在許多的文獻報道中，AI-2在革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中都有存在，且其合成相關的luxS基因在不同菌種之間具有高度的保守性，因此可把AI-2作為不同菌種間的通用“語言”，在種間和種內的交流中起到重要作用[112]。AI-2是發酵食品中微生物的交替中起到重要作用，已經在泡菜[118]、奶酪[119]、發酵肉制品[120]、酸面團[121]中發現了AI-2的存在，發酵過程中不同微生物可通過感知食品基質中AI-2的濃度獲取周圍環境信息，從而調控自身的生物行為。

此外，在真核微生物中也發現了QS的存在，但目前對真核微生物QS的機制了解甚少。在酵母已經發現的QS信號分子為法尼醇、酪醇、色醇和苯乙醇[112]。如前所述酵母是許多發酵食品中的主要微生物之一，有報道顯示，這些醇類分子對奶酪中的漢斯德巴氏酵母菌（Debaryomyces Hansenii）的黏附和滑動有著重要的影響[122]。

雖然QS在食品發酵過程中的許多微生物作用中起著重要的作用，但目前在食品發酵過程中對QS的了解還處于初級階段，而且有限的分析檢測工具使得用于實驗的發酵食品生態模型是被簡化后的。隨著下一代測序、非培養等技術在微生物領域的進一步應用，在未來人們可加深對發酵食品中QS的了解，使食品工業能夠積極利用QS在產品風味、質地和抑菌性等方面改善發酵食品[112]。

5 宏組學技術在發酵食品中的應用

如前所述，微生物的群體種類和之間的相互作用，深刻影響著發酵食品的質量和安全性。在過去，微生物學者們采用傳統的分離培養技術，揭示了發酵食品中典型的微生物群落分布和演替規律。但是這些種群層面的描述性研究不能完全闡釋食品微生物對于發酵食品品質影響的具體機理。并且對于復雜的微生物種群，有些發酵食品中存在著許多實驗室還不可培養的微生物。此外，對于低豐度的微生物也可能不會被分離到，但這些低豐度的微生物可能對于產品的質量起著重要的作用。隨著分子生物學的進步，基于核酸測序的非培養技術可以有效克服這些缺陷[123]。

2001年，在各國的努力下，科研人員采用桑格測序技術，花費30億 美元，終于完成了人類基因組的計劃[124]。自此，不斷涌現出許多的測序技術。在近10 年，第二代高通量測序技術的到來，使得研究者可以以更少的花費和更快的速度，獲得許多已知微生物的全基因組。這些基因組整合在一起，形成了一個公共性的龐大數據庫，為采用組學技術研究食品微生物提供了良好的基礎。對于發酵食品而言，通過提取整個樣品中所有微生物的DNA、RNA、蛋白質和代謝物進行研究稱為宏組學技術，相應地涵蓋了宏基因組學、宏轉錄組學、宏蛋白質組學和宏代謝組學4 個方面[125-126]。

宏基因組學技術根據測序的內容可為兩類：擴增子測序和鳥槍法測序。擴增子測序是采用聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）技術擴增微生物特定的保守序列，然后進入數據庫進行比對，從而得出微生物的類群種類，根據讀段數的占比，得知相應微生物的豐度[123]。被擴增的保守序列，一般使用細菌的16S rRNA基因和真菌的rRNA基因的間隔區[127-128]。基于擴增子測序的宏基因組學技術，在發酵食品中的應用主要體現在：可以更加快速準確地揭示發酵食品不同生產和成熟過程中的微生物組成的差異[123]。由于該技術已經相當成熟且成本降低，目前相關的研究已經很多，涵蓋了幾乎所有種類的發酵食品，如發酵奶類、豆類、肉類、谷物類、蔬菜類等。但由于這些基因的保守型，使得擴增子測序在一些情況下只能鑒定到屬水平。此外，PCR的操作過程中，由于方法的偏好性，也不能保證所有的微生物全部被克隆[129-130]。鳥槍法測序是將樣品中所有微生物的DNA打斷，測序后再重新組合。所以，鳥槍法測序的片段數自然也比較多，費用也遠比擴增子測序高。但鳥槍法測序不但可以得知樣品中的微生物分布和豐度，還可以根據特定的基因或基因簇預測微生物群體所具有的代謝潛能。雖然鳥槍法測序的應用尚處于發展之中，但在發酵食品領域已有數篇相關報道，如奶酪[131]、韓國泡菜[132]和發酵可可豆[133]。以其中的韓國泡菜為例，通過基于鳥槍法測序的宏基因組學分析發現，與單糖和寡糖代謝相關的Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293 和Lactobacillus sakei subsp. sakei 23K兩株菌的基因在微生物群中的豐度比較高，表明其在韓國泡菜的發酵過程中具有重要的作用[132]。在食品發酵的不同時間，由于微生物與微生物之間、微生物與環境之間的相互作用的變化，各微生物的基因表達情況也會不同，這種以mRNA為對象，研究在特定時間特定環境下的全部基因的轉錄水平稱為宏轉錄組學。宏轉錄組學在提取mRNA后，還需要將RNA經逆轉錄形成cDNA文庫，然后同宏基因組測序步驟一樣用于測序。采用宏轉錄組學對奶酪皮進行的分析表明，與蛋白水解和脂水解相關的基因在白地霉（Geotrichum candidum）中高度表達，這表明該物種對奶酪的風味形成起著重要作用[134]。同樣地，采用宏轉錄組學方法揭示了韓國泡菜風味物質形成相關的基因在腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides）中高度表達[135]。

宏蛋白質組學和宏代謝組學是對環境中微生物的全部蛋白質組成和代謝產物組成研究的組學技術。將高通量測序技術與蛋白質組學和代謝組學技術結合，可以更加清晰地從基因型到表現型水平上解釋發酵過程中微生物群體分布、相互作用和代謝產物的合成等之間的關系[126,130]。近些年，這種多組學結合的技術已經應用到了發酵食品領域，如普洱茶[136]、魚露[137]、鎮江香醋[17]和開菲爾[138]等。以發酵普爾茶為例，Zhao Ming等[136]首先采用擴增子測序技術確定普洱茶中的細菌和真菌組成，然后采用液相色譜-質譜聯用技術鑒定微生物的蛋白質組成。該研究結果表明，發酵普洱茶中的細菌主要為變形桿菌，真菌主要為曲霉，且75%的細菌蛋白來自變形桿菌，56.68%的真菌蛋白來自曲霉，這些結果為參與普洱茶發酵的微生物和相關蛋白的鑒定提供了直接證據，并表明真菌在這一過程中發揮了重要作用。

6 結 語

不同地區各具特色的傳統發酵食品，凝聚了各民族勞動人民的智慧。但目前許多發展中國家的傳統發酵食品，仍然有待進一步研究。雖然發酵食品相比于其原始未加工的原料，有著諸多的優勢，但因發酵作用產生的一些對健康不利的物質（如氨基甲酸乙酯、亞硝酸鹽等）同樣需要關注。為此，在評價一種發酵食品的優劣時，應當從多角度分析，而不應該只強調其益處，這樣消費者才能更加合理選擇適合自己的產品。

隨著全球城鎮化的不斷加深，傳統發酵食品也必將逐步實現工業化生產，以滿足人們的需求。如何實現工業化生產而又不喪失發酵食品的傳統風味，是研究人員面臨的最直接問題之一。微生物是發酵食品中風味物質產生的驅動者，其群體組成和動態的演替關系影響著發酵食品的安全和品質。已有許多企業通過接種商業化的微生物發酵劑，規模化生產產品質量恒定的發酵食品。但目前的商業化發酵劑微生物組成依然比較簡單，雖然可產生該類型產品的主要特征性風味物質，但可能整體上的風味物質種類相較于原始傳統發酵要少得多。

采用多組學結合技術，進一步分析認識傳統發酵食品中微生物的特有基因庫和群體間的相互作用，可解釋發酵過程中功能性成分、危害成分和風味物質的產生途徑。并以此為基礎，優化發酵過程工藝和開發微生物組成更加合理的發酵劑。然而，目前宏組學技術依然面臨一些問題，如數據庫中的數據不夠豐富完備，以致某些樣品的序列無法得到比對或被正確地注釋。但隨著測序技術、檢測技術和大數據分析技術的不斷進步，宏組學技術一定會對傳統發酵食品產生更加深刻的積極影響。