基因工程在重組激素生產中的應用

（上海市吳淞中學，上海 200940）

0.引言

近年來，生物技術在制藥工業中得到了廣泛應用。應用基因工程技術，可以高效地生產激素、細胞因子、抗體等重組蛋白。目前，已經有超過75種重組蛋白被用作藥物，有360多種基于重組蛋白的新藥物處于臨床試驗階段[1]。

重組激素是一類十分重要的重組蛋白藥物。目前，與重組激素生產相關的基因工程技術已經十分成熟。科學家可以設計生物活性更高、半衰期更長的重組激素。然而，在生產重組激素的過程中，科學家遇到了一些較為普遍的問題。如何改進現有技術，提高激素的療效，降低激素的生產成本，是一個十分關鍵的問題。

1.基因工程

運用科學手段將從某種生物中人工分離特定的DNA片段，將其導入另一種生物中，使生物體的性狀發生可遺傳改變，這就是基因工程。基因工程在農業、工業、醫藥等領域都有著十分廣泛的應用。

1.1 基因工程的主要工具

科學家在研究生物大分子的過程中，發現了大量可以切割、連接DNA雙鏈的酶。應用這些酶，可以重組來自不同生物的DNA分子，對于構建符合人類需求的重組細胞是至關重要的。此外，科學家還發現，細菌體內能自主復制的環狀DNA分子—質粒可以成為基因工程中的重要載體[2]。

1.1.1 工具酶

限制性核酸內切酶可以在特定位點切割DNA分子，在獲取目的基因的過程中，限制性核酸內切酶發揮著重要的作用。目前，人類已經發現了數千種限制性核酸內切酶。使用能夠連接DNA分子的酶—DNA連接酶，可以將外源DNA與載體相連接。在連接DNA與載體后，篩選連接成功的重組DNA分子。

1.1.2 載體

質粒是最常見的載體。質粒載體通常帶有一個或一個以上的選擇性標記基因（如抗生素抗性基因）和一個人工合成的含有多個限制性核酸內切酶識別位點的多克隆位點序列，并去掉了大部分非必需序列，使分子量盡可能減少，以便于基因工程操作[3]。

1.2 應用基因工程生產重組蛋白

在應用基因工程技術生產重組蛋白的過程中，科學家需要從細胞中獲得的待克隆的DNA鏈（目的基因），將其與質粒連接在一起，形成環狀結構。將重組質粒導入大腸桿菌或其他受體細胞，使基因在受體細胞內高效表達，從而合成大量所需蛋白質。為了成功表達重組基因并產生重組蛋白質，科學家可能需要改造編碼蛋白質一級結構的DNA序列，然后加上控制啟動、終止轉錄過程的其他序列[5]。

2.基因工程在重組激素生產中的應用

2.1 重組人類生長激素

應用基因工程技術，可以高效地生產重組人生長激素（rhGH）。1979年，Goeddel等人成功利用大腸桿菌表達出人類生長激素（hGH）。目前，Somatrem（一種基因重組生長激素）已獲得FDA的批準，用于治療多種人類疾病。據估計，每周約有4000～5000名兒童接受這種激素的治療。Somatonorm的結構與垂體產生的天然hGH十分相似，其生理活性較高。許多臨床研究表明，兩種hGH制劑的生物學作用幾乎完全相同。多項藥理學和毒理學研究表明，Somatonorm幾乎不會引起人體的不良反應[6]。

2.1.1 rhGH的生產

在生產人類生長激素的過程中應用的目的基因部分是通過人工合成產生的，部分是通過人類垂體細胞的mRNA反轉錄產生的。科學家通過人工合成方法，獲得編碼前23個氨基酸的核苷酸序列，這部分序列來自hGH的已知氨基酸序列，含有翻譯起始密碼子；將垂體mRNA逆轉錄為cDNA，可以得到編碼第24-191個氨基酸的核苷酸序列。將核苷酸序列的兩個部分融合，并將其插入到表達質粒phGH407中，用該質粒轉化大腸桿菌K12RV308，向孵育培養基中添加四環素，可以篩選出轉化成功的重組細菌，因為只有含質粒的生物可以在含有四環素的培養基中存活。進行常規發酵后，將細胞與培養液分離并勻漿以破壞細胞壁，離心去除細胞壁和碎片后，剩余的裂解物中含有大量的hGH，不過，還需要裂解物進行純化，才能得到高純度的hGH[7]。

2.1.2 rhGH的純化

在生產rhGH的過程中，去除裂解物中的大腸桿菌多肽（ECP）是非常重要的。不同的蛋白質的分子量和所帶電荷不同，離子交換色譜可以分離帶有不同電荷的蛋白質，凝膠過濾可以分離分子量不同的蛋白質。因此，可以應用離子交換色譜和凝膠過濾等常規色譜方法，有效去除裂解物中的ECP，提高rhGH的純度，降低不良反應發生率。獲得rhGH純化產物后，進行無菌過濾，將終產物放入玻璃小瓶中并凍干，即可得到rhGH成品。

載體質粒和宿主細胞的穩定性和完整性是生產rhGH的發酵過程中關鍵指標。核酸實驗表明，在細胞復制25代后，轉入基因仍然是非常穩定的。科學家還測試了細胞對四環素、鏈霉素的抗性以及發酵半乳糖的能力，評估大腸桿菌細胞的基因組穩定性。多數研究表明，載體質粒和宿主細胞在整個發酵過程中都是較為穩定的[8]。

2.2 人重組卵泡刺激素（rhFSH）

2.2.1 促卵泡激素的簡介

促卵泡激素（FSH）是垂體分泌的一種復雜的異二聚體糖蛋白，與男性和女性性腺中生殖細胞的發育密切相關。人類FSH藥物制劑在治療人類不孕不育中發揮著重要的作用。FSH可以刺激卵泡發育，促進婦女排卵，增加受孕的可能性。如今，FSH已經成為刺激體內多卵泡發育的常規治療方法，在得到成熟的卵細胞后，可以通過體外受精（IVF）和胚胎移植等輔助生殖技術，獲得將生理活性高的胚胎并將其移植到婦女體內，提高懷孕的幾率。在男性體內，FSH可以與人絨毛膜促性腺激素（HCG）結合，促進精子生成。因此，FSH還可以用于治療與性腺功能減退相關的不育癥[9]。

最初，科學家從垂體中提取可以用于臨床的人FSH，事實上，這是20世紀60年代治療與排卵相關的不孕癥的主要方法。此后不久，一些研究人員發現，從絕經婦女尿液中提取的FSH也是有效的，這種方法降低了FSH生產成本。然而，人體體液中的FSH含量較低，提取步驟較多，工藝十分復雜，應用這種方法生產的FSH不能滿足臨床需求。研發安全和療效更高的新型FSH治療劑，成為了科研人員面臨的主要問題之一。

2.2.2 天然FSH的特征

天然的FSH是一種糖蛋白，包含兩種不同的亞基（α亞基和β亞基）。基因工程生產的不同亞基，經過內質網糖基化加工后，以特定的形式結合為異二聚體，并進行翻譯后修飾。等電聚焦分析和色譜聚焦分析表明，從垂體、血清或尿液中分離出的人FSH的性質不同。這些同工型FSH帶有不同的電荷，它們的受體結合能力和體內半衰期也有一定的差異，這種差異可能與天冬酰胺連接的寡糖類型相關[10]。

2.2.3 應用基因工程生產rhFSH

應用基因工程技術，科學家可以改造哺乳動物細胞，從而高效地生產用于臨床治療的人FSH。在應用基因工程技術生產重組人FSH時，選擇合適的工程細胞是非常重要的，原核細胞無法形成二硫鍵，不能對肽鏈進行復雜的翻譯后修飾，因此，科學家通常用真核細胞生產FSH。中國倉鼠卵巢（CHO）細胞是廣泛使用的生產FSH的工程細胞，它能夠對肽鏈進行翻譯后修飾，合成生物活性較高的rhFSH。科學家通常將人FSH基因導入CHO細胞，使其高效地表達人FSH，并應用先進的蛋白質純化工藝（免疫親和純化或高效液相色譜）對培養液進行純化，提取能夠用于臨床治療的高純度rhFSH[11]。

在應用基因工程生產rhFSH的過程中，科學家遇到了一些問題，FSH的結構十分復雜，它的亞單位內富含由二硫鍵和與天冬酰胺連接的寡糖鏈，這些特殊的結構對維持激素的生物學活性是至關重要的。在生產過程中，還原劑可能會破壞二硫鍵，降低FSH制劑的活性。在體外實驗中，缺乏糖鏈的rhFSH不具有信號傳導功能，而體內唾液酸化作用則可能導致rhFSH末端半乳糖部分的暴露，降低其體內活性。因此，在生產rhFSH的過程中，必須保持所有翻譯后修飾的完整性。必須選擇哺乳動物細胞作為工程細胞，才能保證產物的結構的完整性。此外，在導入基因時，科學家一般將編碼3個亞基的FSH基因分別導入工程細胞，并在這些序列前面插入不同的基因元件，從而確保這些基因的表達產物能夠形成結構完整的rhFSH[12]。

3.重組激素生產中的典型問題

3.1 表達下降

大規模生產重組激素的必要條件是目的基因的有效表達。但是，由于在進行基因重組的過程中，目的基因的結構可能會發生變化，在進入新細胞后，目的基因的表達量可能會逐漸下降。這可能與所選的質粒或病毒的種類和基因整合位點有關。

3.2 翻譯后修飾

許多天然激素的結構十分復雜，它們含有大量的二硫鍵和糖鏈，這些結構有助于維持激素的生物學活性。在生產重組蛋白的過程中，一些新生多肽鏈不能在工程細胞中構成正確的空間結構，甚至形成天然不溶性折疊中間體，這可能影響產物的療效，提高重組激素的生產成本。此外，一些用細菌細胞生產的新生多肽鏈缺乏糖鏈修飾，這可能重組激素無法與細胞上的受體結合，影響其療效。

許多科學家致力于解決重組激素生產中的問題。他們發現，正確選擇基因載體、在目的基因的上游插入合適的元件，對維持目的蛋白的表達水平十分重要[13]。此外，應用哺乳動物細胞生產的激素大多具有與天然激素相似的結構和生物學活性，然而，哺乳動物細胞的培養成本較高，如何改進生產技術，平衡產品質量與生產成本問題，是將基因工程廣泛應用于合成藥物生產所面臨的重要挑戰。

4.結語與展望

基因工程在制藥領域有著廣泛的應用。目前，重組激素的制備技術已經非常成熟，科學家應用多種基因表達系統，成功地生產了數百種重組激素。應用基因工程技術生產重組激素，可以大大提高產物的純度，擴大生產規模，降低生產成本。此外，適當改造編碼激素的基因，可以延長激素在體內的半衰期，降低不良反應的發生率。目前，已經有數百種重組激素處于臨床試驗階段。可以說，重組激素有著極高的商業價值，重組激素將成為需求增長最快的重組蛋白藥物之一[14]。研發人員應當深入研究重要工程菌性狀表現的機制，以及影響基因表達調控的因素，不斷改進現有技術，提高產物的生物活性和穩定性，降低激素的生產成本。制藥公司需要在重組激素研發方面投入更多的資金，助力激素產業的發展。