RAP1A和EPAC1在卵巢子宮內膜異位癥組織中的表達及意義*

沈利聰，板得瑩，張瑜

（中南大學湘雅醫院 婦科，湖南 長沙410008）

子宮內膜異位癥是最常見的婦科慢性疾病之一，育齡期婦女發病率為10%～15%[1]。子宮內膜異位癥主要引起疼痛、不孕和盆腔包塊，70%～93%青少年期女性痛經因其引起，而15%～50%的女性不孕癥是由其導致[2]。據中國婦科疾病負擔調查顯示，子宮內膜異位癥的疾病負擔為婦科疾病的第3 位[3]。子宮內膜異位癥是良性疾病，卻具有惡性腫瘤的一些特性，如侵襲性、復發性及遠處轉移，約有1%患者可能惡變，被稱為“良性腫瘤”[4]。但目前子宮內膜異位癥的發病機制尚不清楚。

多種假說如經血逆流種植學說、免疫學說、體腔上皮化生學說、干細胞學說、細胞增殖與凋亡失衡等從不同角度闡釋可能引起子宮內膜異位癥的病因及發病機制，然而，沒有一種學說能完全解釋其內在機制[1，5]，表明子宮內膜異位癥是一種多因素、多種機制參與導致的慢性疾病。RAS 相關蛋白1（Ras-associated protein 1, RAP1）是RAS 小G 蛋白家族中的一員，通過調節多種信號通路參與腫瘤的發生、發展。RAP1由2 種異構體組成，即RAP1A 和RAP1B。研究發現，RAP1A 在肝癌、胰腺癌、食管癌、宮頸癌、卵巢癌等多種腫瘤中高表達，通過參與細胞增殖、侵襲、遷移、凋亡失衡等多種生物學過程促進腫瘤的發生、發展[6-11]。環磷酸腺苷交換蛋白1（the exchange protein directly activated by cAMP1, EPAC1）是一種非蛋白激酶A 依賴的信號分子，是環磷酸腺苷cAMP 的下游效應分子。EPAC1 參與GDP/GTP 交換，將RAP1 結合的鳥苷二磷酸置換為鳥苷三磷酸，引起RAP1 激活。EPAC1/RAP1 通路參與細胞增殖、分化、黏附等多種生物學功能[12-14]。然而，RAP1A 和EPAC1 在子宮內膜異位癥的作用尚無研究報道。

本研究通過免疫組織化學法及Western blotting 法檢測RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內膜異位癥及正常子宮內膜的表達，并探討兩者的相關性。

1 資料與方法

1.1 研究對象

2019年6月—2020年1月中南大學湘雅醫院婦科因卵巢子宮內膜異位癥行腹腔鏡手術患者18 例，年齡22 ～45 歲，平均（32.72±4.95）歲；取異位及在位內膜組織各18 份。取15 例卵巢單純性囊腫或畸胎瘤（鏡下未見卵巢及盆腔內膜異位病灶）患者的子宮正常內膜組織作為對照，年齡20 ～43 歲，平均（30.28±4.41）歲。所有組織經甲醛固定、脫水后石蠟包埋。所有研究對象均為月經周期規律的育齡期婦女，根據末次月經及病理檢查證實所有內膜組織均為增生期，術前3 個月未接受任何激素治療，術后病理檢查證實為卵巢子宮內膜異位癥或子宮正常內膜。根據r-AFS 分期標準，卵巢子宮內膜異位癥患者均為Ⅲ、Ⅳ期。各組年齡比較差異無統計學意義（P＞0.05）。本研究獲得醫院醫學倫理委員會審查并批準執行（#201910255）。

1.2 試劑及儀器

兔抗人RAP1A 單克隆抗體（MA1-103）購自美國Invitrogen 公司，兔抗人EPAC1 單克隆抗體（ab109415）購自美國Abcam 公司，免疫組織化學試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司，HRP 標記山羊抗兔IgG、RIPA 裂解液及BCA 蛋白定量試劑盒購自武漢賽維爾生物科技有限公司。電泳儀購自北京六一儀器廠，掃描儀購自愛普生（中國）有限公司，顯微鏡購自德國Leica 公司，轉膜儀、圖像分析儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.3 免疫組織化學檢測

石蠟包埋的組織標本進行4 μm 連續切片，將切片置于65℃恒溫箱烤片30 min，接著予松節油脫蠟、梯度酒精水化。切片經檸檬酸鹽緩沖液微波抗原修復15 min，3%過氧化氫室溫孵育20 min 滅活內源性過氧化物酶，牛血清白蛋白封閉20 min，一抗孵育（RAP1A 按1 ∶200 稀釋，EPAC1 按1 ∶100 稀釋，陰性對照用PBS 代替一抗）4℃冰箱過夜，37℃復溫45 min，清洗后加入二抗室溫孵育1 h。最后，經DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片后，倒置顯微鏡下觀察并采集圖片。

每張切片計數5 個高倍鏡視野（×40），染色結果判讀采用免疫反應評分（IRS），分別記錄染色強度（SI）和陽性細胞百分比（PP）。陽性結果為細胞核、細胞質或細胞膜出現淺黃色至棕褐色顆粒，每次閱片時需保證白平衡、亮度等參數設置一致。根據陽性信號強弱將染色強度分為4 個等級：0 分為陰性，1 分為弱陽性，2 分為中度陽性，3 分為強陽性。根據陽性細胞所占百分比分為5 個等級：0 分，＜5%；1 分，5% ～25%；2 分，＞25% ～50%；3 分，＞50%～75%；4 分，＞75%。最后計算IRS 值，IRS=SI×PP，獲得組織染色半定量評分。IRS 為0 ～12 分，IRS ≤3 分定義為低表達，IRS＞3 分定義為高表達。

1.4 Western blotting 檢測

組織剪碎后加入RIPA 裂解液，置于冰上裂解，離心后提取總蛋白；用BCA 蛋白定量試劑盒測蛋白濃度；將蛋白溶液按照4 ∶1 的比例加入5×蛋白上樣緩沖液，沸水浴變性；取50 μg 總蛋白行SDSPAGE 電泳；恒壓100 V 轉膜1 h；5%脫脂牛奶封閉1 h；1 ∶1 000 稀釋RAP1A 一抗，1 ∶1 000 稀釋EPAC1 一抗，1 ∶1 000 稀釋GAPDH 一抗，4℃孵育過夜；在室溫下用TBST 洗膜3 次，加入1 ∶3 000稀釋的二抗，于搖床上室溫孵育1.5 h；用TBST 洗膜3 次，加入ECL 溶液進行顯色反應，曝光，最后顯影和定影。保存圖片并用Alpha 軟件處理系統分析目標蛋白條帶的灰度值。

1.5 統計學方法

數據分析采用SPSS25.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析用Pearson 法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組內膜RAP1A 的表達

RAP1A 表達于細胞質，在異位內膜和在位內膜的表達明顯高于正常內膜，在在位內膜腺上皮細胞呈強陽性表達（見圖1）。免疫組織化學半定量評分顯示，異位內膜、在位內膜及正常內膜的IRS 分別為（5.688±0.651）分、（8.700±1.144）分、（0.787±0.053）分，3 組比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=45.005，P=0.009）；異位內膜、在位內膜的IRS 水平均高于正常內膜（P＜0.05）；異位內膜與在位內膜比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（見圖2）。

2.2 各組內膜EPAC1 的表達

圖1 RAP1A 在各組內膜的表達 （免疫組織化學×40）

圖2 RAP1A 在各組內膜的IRS 比較 （±s）

EPAC1 在腺上皮細胞的細胞質表達，在間質細胞的細胞質和細胞核都有表達；其在異位內膜和在位內膜的表達明顯高于正常內膜，在腺上皮細胞的細胞質呈強陽性表達（見圖3）。免疫組織化學半定量評分顯示，異位內膜、在位內膜及正常內膜的IRS 分別為（8.100±1.153）分、（8.878±1.829）分、（2.520±0.138）分，3 組比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=42.850，P=0.002）；異位內膜、在位內膜均高于正常內膜（P＜0.05）；異位內膜與在位內膜比較，差異無統計學意義（P＞0.05）（見圖4）。

2.3 各組內膜RAP1A 蛋白相對表達量的比較

RAP1A 在異位內膜、在位內膜及正常內膜的蛋白相對表達量分別為（0.518±0.059）、（0.479±0.381）、（0.177±0.012），3 組比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=6.664，P=0.006）；異位內膜、在位內膜均高于正常內膜（P＜0.05）；異位內膜與在位內膜比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

2.4 各組內膜EPAC1 蛋白相對表達量的比較

EPAC1 在異位內膜、在位內膜及正常內膜的蛋白相對表達量分別為（0.813±0.067）、（0.829±0.052）及（0.228±0.041），3 組比較，經方差分析，差異有統計學意義（F=24.069，P=0.005）；異位內膜、在位內膜均高于正常內膜（P＜0.05）；異位內膜與在位內膜比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖5。

圖3 EPAC1 在各組內膜的表達 （免疫組織化學×40）

圖4 EPAC1 在各組內膜的IRS 比較 （±s）

圖5 各組內膜中RAP1A 和EPAC1 的表達

2.5 RAP1A 和EPAC1 表達的相關性

采用Pearson 法對RAP1A 和EPAC1 在各組內膜的表達分別進行相關性分析，結果顯示：RAP1A 和EPAC1 的表達在異位內膜（r=0.635，P=0.033）和在位內膜（r=0.697，P=0.005）及正常內膜（r=0.436，P=0.018）均呈正相關。

3 討論

子宮內膜異位癥是育齡期婦女的常見病，在育齡期長期處于活躍狀態，由于發病機制尚不明確，目前臨床尚缺乏針對性的、長期有效的生物治療手段。尋找在子宮內膜異位癥差異表達的分子，探索可能的治療生物靶點，具有重要意義。本研究發現RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內膜異位癥的表達升高，表明其可能參與疾病的發病過程。

RAP1A 通過調控多種分子信號通路參與腫瘤的發生、發展。RAP1A 通過激活ERK/MAPK/Notch 信號通路調控上皮間質轉化，從而促進卵巢癌生長和轉移[11]。RAP1A 基因多態性導致肝移植后肝癌的復發風險升高[6]。LI 等[9]通過體內及體外實驗發現，RAP1A 可通過激活Akt 信號通路促進上皮間質轉化、刺激細胞遷移和侵襲，從而促進食管癌的轉移。LIU等[15]發現RAP1A 在結直腸癌高表達，并揭示其通過激活PTEN/FOXO3/CCND1 通路促進結直腸癌的侵襲。劉立果[16]發現RAP1A 可通過PTEN/FOXO3/CCND1信號通路調控上皮間質轉化，進而促進結直腸癌的發生、發展，并通過臨床回顧分析發現RAP1A 可作為結直腸癌患者總體生存的獨立預后因素。有研究進一步發現，在前列腺癌細胞敲除RAP1A 后，癌細胞的增殖、黏附和侵襲能力下降[17]。上述研究表明，RAP1A在細胞增殖、侵襲、黏附等多種生物學過程中發揮重要作用。本研究發現，RAP1A 在卵巢子宮內膜異位癥異位內膜和在位內膜的表達高于正常內膜，提示RAP1A 可能在子宮內膜異位癥的發生、發展中具有重要意義，可能參與子宮內膜異位癥的細胞增殖、侵襲、黏附等過程。有趣的是，孫樹凱等[18]發現脊髓神經損傷小鼠的RAP1A 表達升高，機械痛閾明顯降低，而脊髓組織分離培養的星形膠質細胞的自噬標志分子表達及自噬水平均升高，表明RAP1A 高表達促進神經病理性疼痛的發展，該過程可能與RAP1A 對星形膠質細胞自噬水平的調節有關。因此，筆者推測，RAP1A 在子宮內膜異位癥高表達，不僅參與疾病的發生過程，還可能通過自噬參與痛經的發生過程，后續進一步研究RAP1A 及自噬在子宮內膜異位癥的作用將可能揭示發生痛經的新機制。

EPAC1 是細胞內一種非依賴PKA 的介導cAMP 效應的重要分子，在多種生物學功能中發揮核心作用[19-20]。EPAC1 可活化鳥苷三磷酸酶，促進RAP1A 結合鳥苷三磷酸變成活化形式。EPAC1基因缺失在體外抑制微血管形成，在病理性血管生成的進展中起關鍵作用。EPAC1-RAP1A-NHE3通路可能調節血管緊張素Ⅱ誘導的炎癥細胞因子的表達，促進腎小管間質炎癥發生[21]。在結直腸癌中，EPAC1 呈高表達，且對評估患者預后具有重要價值[22]。近年來，多個研究發現EPAC1 激活可能引起痛覺受體過敏，從而導致機體疼痛發生[23-24]。本研究發現，EPAC1 在卵巢子宮內膜異位癥異位內膜和在位內膜的表達高于正常內膜，推測其可能通過促進腹腔子宮內膜異位癥病灶新生微血管生成參與子宮內膜異位癥的病理生理過程。本研究發現，EPAC1 與RAP1A 的表達呈正相關，推測兩者可能相互協同，共同促進子宮內膜細胞增殖、侵襲和黏附過程。最近研究表明[25]，炎癥在子宮內膜異位癥發病過程中可能發揮重要作用，EPAC1 高表達也可能通過促進炎癥過程而參與子宮內膜異位癥的發生及發展。子宮內膜異位癥引起疼痛的確切機制尚不清楚，RAP1A 及EPAC1兩者高表達，可能協同參與子宮內膜異位癥發生的慢性疼痛。

在子宮內膜異位癥的發病機制研究中，“經血逆流種植學說”是最早被廣泛接受的學說，活性的子宮在位內膜通過輸卵管逆流到腹腔，在腹腔環境下，需經過黏附、侵襲和血管形成才能在腹膜或卵巢等盆腹腔形成異位病灶。在該過程中，在位內膜的分子生物學特征起重要作用，決定了異位內膜的生物學行為，這就是郎景和院士提出的經典的“在位內膜決定論”[26]。本研究中，異位內膜及在位內膜RAP1A 和EPAC1 的表達差異無統計學意義，表明兩者在異位內膜與在位內膜的表達均具有相似的特征，進一步證實在位內膜是子宮內膜異位癥的根源，符合“在位內膜決定論”學說。由此可見，RAP1A 和EPAC1 可能成為子宮內膜異位癥潛在的分子診斷和治療靶點。

綜上所述，本研究發現RAP1A 和EPAC1 在卵巢子宮內膜異位癥異位內膜和在位內膜中高表達，且兩者的表達呈正相關，推測RAP1A 和EPAC1 可能相互協同，參與疾病的發生、發展及痛經的調控過程。EPAC1 表達升高，可能加速置換鳥苷三磷酸，促進RAP1A 激活，進而增強在位內膜和異位內膜細胞的增殖、侵襲、黏附及新生微血管形成能力，還可能通過調節細胞自噬參與痛經的發生發展。本研究為進一步探索子宮內膜異位癥的發病機制及探索可能的治療新靶點提供了思路。