草酸青霉菌HB1溶磷能力及作用機制

何 迪，耿麗平，郭 佳，陸秀君，劉文菊，李博文

草酸青霉菌HB1溶磷能力及作用機制

何 迪1，耿麗平1，郭 佳1，陸秀君2，劉文菊1※，李博文1

（1. 河北農業大學資源與環境科學學院，河北省農田生態環境重點實驗室，河北省蔬菜產業協同創新中心，保定 071001；2. 河北農業大學植物保護學院，保定 071001）

一些功能微生物具有溶磷能力且同一菌株對不同難溶性磷酸鹽的溶解能力存在差異。該研究以草酸青霉菌HB1為研究對象，通過固體平板培養試驗、搖瓶培養試驗和土壤培養試驗系統研究了不同磷源（磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鐵、磷酸鋁）與氮源（銨態氮、硝態氮）供應下HB1溶磷能力及其作用機制，并驗證了其在高、低不同磷水平土壤中的溶磷能力。結果表明，接種HB1的不同磷源培養基上均有溶磷圈出現，根據溶磷圈直徑/菌落直徑初步確定HB1溶解磷酸鈣的能力較強；搖瓶培養試驗表明供試磷源為磷酸鈣、磷酸鐵時HB1發酵液中有效磷含量為884、265 mg/L（銨態氮），或945、206 mg/L（硝態氮），其溶磷能力不受氮源形態影響；磷礦粉為磷源時，HB1發酵液中有效磷含量可達199 mg/L（供應銨態氮），為硝態氮供應的7.14倍；而磷酸鋁為磷源時，HB1發酵液中有效磷含量為120 mg/L（供應硝態氮），為銨態氮供應的3.29倍；此外，供應銨態氮條件下，HB1對難溶性磷酸鹽的溶解能力與介質中pH值呈顯著的負相關關系。HB1接種于不同磷水平的土壤中培養21 d，在低磷和高磷土壤中HB1均能有效定殖且增加了土壤有效磷含量，比不接菌對照分別增加45.00%和14.17%。綜上，草酸青霉菌HB1對磷酸鈣和磷礦粉的溶磷效果較好，并通過分泌氫質子酸解含磷礦物實現溶磷作用，且HB1在低磷土壤中溶磷能力較強。

磷；土壤；菌；難溶性磷源；土壤定殖；革酸青霉菌HB1

0 引 言

磷作為植物生長發育所必需的營養元素之一[1]，在土壤中儲量豐富，但95%是難以被植物直接吸收利用的無效態[2-3]。上個世紀80年代，中國約74%的農田土壤存在磷貧瘠現象[4]。因此，化學磷肥成為當時促進農業生產的主要磷素來源。然而，化肥磷素進入土壤后會因土壤本身的理化特性和磷酸鹽的化學行為而轉化為難溶性磷酸鹽，使磷肥的當季利用率降低，造成大量未被植物利用的磷素殘留在土壤中。近年來，固定在表層土壤中的大量磷素也會徑流進入地表水體而產生富營養的環境問題[4-6]。因此，探索土壤中難溶態磷活化的途徑和方法至關重要[2]。土壤中存在大量的微生物具有將難溶態含磷化合物轉化為有效態的能力，其數量約為土壤微生物總量的十分之一，且種類多樣[7]，這些微生物統稱為溶磷微生物或溶磷菌。長期以來，研究者一直致力于挖掘自然環境介質中存在的具有溶磷作用的功能微生物或功能菌的研究，以促進作物生育期內土壤磷素的釋放，提高土壤磷素利用率，從而減少大量施用含磷化肥造成的水體富營養化問題等[8]。

礦物態磷在中國土壤中的存在形式不一，在北方石灰性土壤中主要以磷酸鈣鹽的形式存在[9]；在南方酸性土壤中，主要以粉紅磷鐵礦、藍鐵礦和閉蓄態磷酸鐵、鋁鹽形式存在[7]。溶磷菌可活化難溶磷酸鹽，但同一菌株對不同磷酸鹽的溶解能力存在差異。另外，有研究表明，同一溶磷菌株在生長過程中供試氮源條件不同其溶磷效果也存在差異[10]。Whitelaw 等[11]研究證實青霉菌（）對Ca-P、Al-P的溶解能力較高，而對Fe-P的溶解能力很差。Reddy 等[12 ]研究了曲霉菌對不同磷礦石的溶解作用，發現不同曲霉菌菌株選擇不同的磷源作為其生長物質。趙小蓉等[13]研究表明，真菌的溶磷能力高于細菌，大多數真菌對Ca3(PO4)2的溶解能力較強，對Fe-P的溶解能力較低，并且有些菌株（如歐文氏菌4TCRi 22）完全不能溶解Fe-P和Al-P?；诖?，本研究以研究小組自主篩選的草酸青霉菌HB1[14]為供試菌株，通過固體平板和液體搖瓶培養試驗研究草酸青霉菌HB1溶解不同礦物態磷的能力及作用機制；通過土壤培養試驗明確其活化土壤磷的能力，以期提供一株可用于微生物肥料開發利用的優良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1）供試菌株：草酸青霉菌（） HB1，本課題組自主篩選并保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC No. 4842。

2）供試磷源：磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鐵、磷酸鋁。

3）供試培養基：

① PDA固體培養基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH=7.0；

② PDA液體培養基：去除PDA固體培養基中的瓊脂，其他成分不變；

③無機磷固體培養基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母粉0.40 g，磷源10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH=7.0；

④無機磷液體培養基-銨態氮：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母粉0.40 g，磷源10 g，蒸餾水1 L，pH=7.0；

⑤無機磷液體培養基-硝態氮：葡萄糖10 g，NaNO30.64 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母粉0.40 g，磷源10 g，蒸餾水1 L，pH=7.0。

4）供試土壤：試驗用土取自河北省永清縣大青垡村（39°12′47″N，116°30′20″E），分別在黃瓜溫室的棚內和棚外（2個溫室間的空地）取有效磷含量差異較大的土壤，取土時棚內種植越冬一大茬黃瓜，棚外種植玉米。棚內和棚外土壤質地相同，其他基本理化性狀見表1，土壤酸堿度（pH）、電導率（EC）、堿解氮、全磷、速效磷、速效鉀、有機質含量采用常規方法測定[15]。

表1 供試土壤的基本化學性質

由表1可以看出，棚內土壤養分含量高，棚外土壤養分含量低，與其他指標相比，2種土壤有效磷含量差異最大，因此棚內高養分含量土壤簡稱高磷土，棚外低養分含量土壤簡稱低磷土。

1.2 試驗方法

1.2.1 固體平板培養試驗

1）草酸青霉菌HB1菌株的活化：從保存的HB1斜面菌種上挑取一環轉接到PDA固體培養基上，于30 ℃培養48～72 h，待長滿整個平板。再從培養好的平板上挑取菌種，轉接到PDA固體培養基上，于30 ℃培養72 h，待長滿整個平板，備用。

2）試驗步驟：分別將20 mL含不同磷源的無機磷固體培養基倒入已滅菌的培養皿中，晾干備用。在PDA液體培養基中接入1環（直徑1.50 mm）活化好的HB1菌，搖床培養18 h（200 r/min），然后吸取20L分別放在4種磷源的無機磷固體培養基培養皿的中心，水分吸收后倒置于30 ℃培養箱培養8 d[12]。每個處理6次重復。

1.2.2 液體搖瓶培養試驗

1）草酸青霉HB1菌株活化：同1.2.1（1）。

2）草酸青霉HB1菌液的制備：將活化好的HB1菌株用無菌水制成孢子懸浮液，制成其孢子數量約為1×108cfu/mL。

3）試驗步驟：將50 mL無機磷液體培養基分裝于150 mL三角瓶中，再按固液比1∶100的比例稱取不同礦物態磷源，調節pH值至7.0，121 ℃，滅菌20 min。冷卻后，按1%的接種量接入HB1孢子菌懸液，30 ℃，200 r/min，培養7 d。同時以接入等量無菌水和等量滅活HB1菌液做對照。

共設置3個處理：CK（等量無菌水）、HB1（等量含HB1的孢子菌懸液）、滅活HB1（等量滅活HB1菌液）。每個處理設3次重復。

1.2.3 土壤培養試驗

1）草酸青霉HB1菌株活化：同1.2.1（1）。

2）草酸青霉HB1菌液的制備：同1.2.2（2）。

3）試驗步驟：分別稱取兩種磷水平風干土壤各30 g于離心管中，先加入6 mL的滅菌水潤濕土壤，再加入4 mL的HB1孢子菌懸液，接種后的起始濃度為1.33×107cfu/g，同時以加入等量的滅菌水為對照，保持土壤濕度30%～50%，用封口膜將離心管封口，放入生化培養箱中，于30 ℃下培養40 d[16]。

設置4個處理：低磷土+HB1、低磷土+滅菌水、高磷土+HB1、高磷土+滅菌水，每個處理3次重復。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 固體平板培養試驗

從第3天開始，每天測定菌落直徑、溶磷圈直徑，并計算溶磷圈直徑/菌落直徑[10]。

1.3.2 液體搖瓶培養試驗

1）上清液中有效磷、pH測定：選擇HB1菌在兩種氮源供應下取樣，氮源為銨態氮的處理分別于該菌在供應銨態氮的生長對數期內的72、108和132 h取樣；氮源為硝態氮的處理分別于該菌在供應硝態氮的生長對數期內的84、120和144 h取樣。取樣時將三角瓶內發酵液全部倒入離心管中，10 000 r/min，離心10 min，再將全部上清液保存至50 mL離心管中，備用。采用鉬藍比色法[15]測定上清液中磷的含量，同時測定上清液pH。

2）有機酸種類的測定：試驗步驟同1.2.2 1）～3），氮源為硫酸銨，設置2個處理：CK（等量滅活HB1菌液）、HB1（等量含HB1的孢子菌液），每個處理設3次重復。在培養72 h后，將三角瓶中發酵液全部倒入離心管中，10 000 r/min，離心10 min。用10 mL的注射器取2 mL上清液，過0.22 μm濾膜后，通過HPLC-MS來測定上清液中有機酸的種類[17]。

1.3.3 土壤培養試驗

分別在加入孢子菌懸液后第1、3、5、7、10、14、21、37天隨機取3份土樣，用打孔器取部分土壤用于測定菌株定殖情況，剩下的土壤風干過1 mm篩后用于測定土壤pH及有效磷含量。

菌株的定殖情況測定采用稀釋平板法[18-20]：取1 g新鮮土壤溶于10 mL無菌水（含0.01%吐溫80）中，振蕩4 min后靜置1 min，做105倍的濃度梯度稀釋，取100L的1×105稀釋梯度液涂布于PDA固體培養基（含100g/mL氯霉素，100g/mL卡那霉素，100g/mL鏈霉素），涂6個板。置于30 ℃培養箱中培養3 d，每天觀察菌落形態并計數。

土壤pH值、有效磷含量采用常規方法測定[15]。

1.4 數據分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進行數據分析及單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 草酸青霉菌HB1溶磷能力的初步鑒定

試驗結果顯示，草酸青霉菌HB1在這4種難溶性磷源的固體培養基上均生長良好（圖1），其溶磷圈和菌落直徑測定結果如表2所示。

供試磷源為磷酸鈣時，HB1菌培養8 d時其溶磷圈和菌落直徑分別比第3天時極顯著增加了199%和236%（<0.05），其溶磷圈直徑/菌落直徑為1.10～1.23；磷礦粉為磷源時，HB1菌培養8 d時其溶磷圈和菌落直徑分別比第3 天時極顯著增加了184%和234%（<0.05），其溶磷圈直徑/菌落直徑的范圍為1.01～1.22；磷酸鐵為磷源時，HB1菌培養8 d時其溶磷圈和菌落直徑分別比第3天時極顯著增加了114%和125%（<0.05），其溶磷圈直徑/菌落直徑為1.03～1.09；磷酸鋁為磷源時，HB1菌培養8 d時其溶磷圈和菌落直徑分別比第3天時極顯著增加了85%和93%（<0.05），溶磷圈直徑/菌落直徑為1.03～1.07。同時，在3～8 d的培養時間內，HB1在含有磷酸鈣的固體培養基上其菌落直徑和溶磷圈直徑/菌落直徑均顯著高于磷礦粉、磷酸鐵、磷酸鋁（<0.05）（表2）。綜上，按其溶磷圈直徑/菌落直徑初步鑒定HB1溶解磷酸鈣中磷的能力較大。

表2 草酸青霉菌HB1在固體培養基上的溶磷能力初步鑒定

注：表中不同的小寫字母代表相同培養時間內不同磷源條件下其溶磷圈直徑、菌落直徑、溶磷圈直徑：菌落直徑差異顯著性比較（<0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences between phosphate solubilizing zone, bacterial colony, the ratio of phosphate solubilizing zone and bacterial colony at the same time (< 0.05) .

圖1 草酸青霉菌HB1在4種難溶性磷源固體培養基上的生長情況

2.2 草酸青霉菌HB1對4種難溶性磷源的溶磷能力

2.2.1 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鈣的能力

1）溶磷能力

在液體培養條件下對HB1溶解磷酸鈣的能力進行了分析，結果表明，與CK（無菌水）、滅活菌液相比，接種HB1孢子菌懸液其發酵液中有效磷含量均顯著增加（圖2）。

NH4+-N為氮源條件下（圖2a），接種HB1菌的發酵液中有效磷含量在132 h達到最大值，為884 mg/L；相同培養時間內，HB1發酵液中有效磷含量均顯著高于對照和HB1滅活菌液（<0.05），分別增高了19.29%和20.92%、68.39%和61.07%、69.47%和61.01%。

NO3--N為氮源時（圖2b），接種HB1菌的發酵液有效磷含量在144 h達到最大值，為945 mg/L；相同培養時間內，HB1發酵液中有效磷含量均顯著高于對照和滅活菌液（<0.05），分別增高68.15%和71.32%、76.96%和64.27%、85.91%和76.14%。

2種氮源對HB1溶解磷酸鈣的能力影響不顯著（圖 2）。

2）HB1溶解磷酸鈣的作用機制

分別以硫酸銨、硝酸鈉為氮源，接種草酸青霉菌HB1，測定了各處理培養液pH值的變化（各處理培養前pH調到7.0）（表3）和分析了HB1發酵液中是否存在有機酸。結果發現，HB1在難溶性磷酸鈣作為磷源的情況下，培養72 h后發酵液中沒有檢測到有機酸，以下其他難溶性磷源存在相同的情況。供應NH4+-N時，培養72 、108 和132 h后，HB1發酵液的pH值顯著降低（<0.05），分別比對照和HB1滅活菌液降低了12.89%和7.27%、18.95%和14.19%、17.77%和11.65%，且培養液pH值與有效磷含量之間存在極顯著負相關關系（=―0.89**，=27）；供應NO3--N時，培養84 、120 和144 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比無菌水對照降低了2.97%、3.15%和3.18%，差異顯著（<0.05），但與滅活菌液相比差異不顯著（>0.05），且無菌水對照與HB1處理發酵液pH值和有效磷含量之間呈顯著的負相關（=-0.83**，=18）。這說明無論是供應NH4+-N還是NO3--N，接種HB1菌后，其在生長和發育過程中分泌氫質子，從而使發酵液pH降低，低pH促進了培養液中磷酸鈣的溶解與磷的釋放，即溶磷能力增強。

注：不同小寫字母表示同時間不同處理間的差異顯著（P<0.05），下同。

表3 磷酸鈣為磷源時各處理培養液中pH值的變化

注：同列數據后不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（<0.05），下同。

Note: Different lowercase letters in the same column showed significant differences among different treatments (< 0.05), the same below.

2.2.2 草酸青霉菌HB1溶解磷礦粉的能力

1）溶磷能力

供試菌株草酸青霉HB1在以磷礦粉為唯一磷源的液體培養基中生長，能夠有效溶解、轉化磷礦粉中的難溶態磷為自身所用（圖3）。

供試氮源為NH4+-N時（圖3a），接種HB1菌的發酵液中有效磷含量在132 h達到最大值199 mg/L。相同培養時間內，接種HB1菌的發酵液有效磷含量均顯著高于對照和滅活菌液（<0.05），分別增加了77.63和42.68、350和98.01倍、189和900倍。

供試氮源為NO3--N時（圖3b），HB1菌的發酵液有效磷含量在144 h達到最大值27.86 mg/L。相同培養時間內，接種HB1菌的發酵液有效磷含量均顯著高于對照和滅活菌液（<0.05），分別增加了23.07和9.95倍、52.18和12.23倍、161和12.02倍。

在兩種氮源條件下，HB1均能不同程度地溶解磷礦粉，但氮源為銨態氮條件下HB1的溶磷能力要顯著高于硝態氮，前者為后者的7.14倍（<0.01）。

2）HB1溶解磷礦粉的作用機制

供應NH4+-N時，培養72 、108和132 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比對照和滅活菌液降低了32.19%和30.12%、35.24%和34.37%、36.04%和35.35%，差異顯著（<0.05）；供應NO3--N時，培養84、120和144 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比對照和滅活菌液降低了20.00%和18.87%、21.18%和19.30%、21.48%和19.61%，差異顯著（<0.05）。此外，在培養后期供應銨態氮使生長介質pH下降的幅度大于硝態氮供應（表 4）。

表4 磷源為磷礦粉時各處理液體培養基中pH值的變化

圖3 草酸青霉菌HB1溶解磷礦粉的能力

同時，供應NH4+-N時或供應NO3--N時，3個處理的培養液pH值與其有效磷含量之間均存在極顯著負相關關系（=-0.89**,=27；=-0.95**,=27）。這說明在磷礦粉為供應磷源的情況下，HB1菌在生長繁殖過程中可分泌氫質子使生長介質中的pH降低，通過酸解作用將磷礦粉中的磷釋放出來。

2.2.3 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鐵的能力

1）溶磷能力

在中國南方，大部分土壤的pH都較低，土壤中的有效磷多被Fe、Al等金屬離子吸附固定，以鐵鋁磷酸鹽的形式存在。因此，針對此類現象，探究了HB1菌對磷酸鐵的溶解能力（圖4）。

結果表明，供應NH4+-N時（圖4a），在72 h接種HB1菌的發酵液中有效磷含量達到最高，為265 mg/L，比132 h的有效磷含量高出46.96%，差異達到顯著水平（<0.05）。在相同培養期間內，接種HB1菌的發酵液有效磷含量分別高于對照和滅活菌液2.56和2.01倍、1.97和2.49倍、1.84和2.32倍，差異顯著（<0.05）；供應NO3--N時（圖4b），HB1菌的發酵液有效磷含量在84 h達到最高，為206 mg/L，比120 h顯著高出11.61%（<0.05）。在相同培養期間內，接種HB1菌處理的有效磷含量分別高于對照和滅活菌液1.78和1.25倍、1.82和2.00倍、1.84和1.80倍，差異顯著（<0.05）。

圖4 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鐵的能力

2種氮源對HB1溶解磷酸鐵的能力影響不顯著。

2）HB1溶解磷酸鐵的作用機制

供應NH4+-N時，培養72、108和132 h，接種HB1菌后溶液的pH值最低（3.05～3.60）分別比對照和滅活菌液顯著降低33.55%和27.38%、21.92%和17.19%、2.41%和14.89%（<0.05）；供應NO3--N時，培養84、120和144 h，接種HB1菌后溶液的pH值最高（5.51～5.75），分別比對照和滅活菌液顯著升高了21.63%和33.09%、25.95%和35.99%、25.82%和38.55%（<0.05）。這是因為加純水處理的培養液初始培養液pH 7.0，培養3 d后培養液pH降為4.38～4.59，說明磷酸鐵在溶解過程中，該礦物中包裹的H+得以釋放（表5）。

供應NH4+-N時，對照、接種HB1菌、HB1滅活菌液3個處理培養液pH值與其有效磷含量之間存在極顯著負相關關系（=-0.85**，=27），這與HB1分泌氫質子溶解磷酸鈣的作用機制相同；然而，供應NO3--N時，3個處理的發酵液pH值和有效磷含量之間存在顯著的正相關關系（=0.93**,=27），這與磷酸鈣為磷源的趨勢不同，分析原因是HB1吸收硝態氮后釋放出OH-，與沒有接菌的處理相比一定程度上升高了培養液pH，且菌的活性越強，吸收的硝態氮就越多，pH提升的幅度就越大，溶解磷酸鐵的能力就越強，從而發酵液中有效磷含量就越高。

表5 磷源為磷酸鐵時各處理液體培養基中pH值的變化

2.2.4 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鋁的能力

1）溶磷能力

供試氮源為NH4+-N時（圖5a），相同培養時間內，接種HB1菌的發酵液有效磷含量均顯著高于對照和滅活菌液（<0.05），分別增加了2.10和3.87倍、2.17和4.00倍、2.06和3.69倍。供試氮源為NO3--N時（圖 5b），相同培養時間內，接種HB1菌的發酵液有效磷含量均顯著高于對照和滅活菌液（<0.05），分別增加了3.69和8.01倍、4.07和3.89倍、3.99和6.84倍。

HB1溶解磷酸鋁的能力在NO3--N條件下大于NH4+-N條件下（<0.01），有效磷含量最大為120 mg/L，前者為后者的3.29倍。由此可見，當磷源為磷酸鋁時，最適宜的供試氮源為硝態氮。

2）HB1溶解磷酸鋁的作用機制

供應NH4+-N時，培養72、108和132 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比對照和滅活菌處理降低43.26%和38.02%、42.65%和35.83%、40.73%和32.22%，差異均顯著（<0.05）；供應NO3--N時，培養84、120和144 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比對照和滅活菌處理降低了22.14%和16.17%、23.99%和18.57%、23.22%和17.06%，差異顯著（<0.05）（表6）。

供應NH4+-N或供應NO3--N時，3個處理的培養液pH值與其有效磷含量之間均存在極顯著負相關關系（=-0.84**,=27；=-0.88**,=27），說明HB1菌也是通過“酸解”作用來促進磷酸鋁溶解的，從而獲取自身生長和繁殖所需要的磷素。

圖5 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鋁的能力

表6 磷源為磷酸鋁時各處理液體培養基中pH值的變化

2.3 草酸青霉菌HB1在高、低2種磷水平土壤中的溶磷能力研究

為了進一步明確草酸青霉菌HB1溶磷的能力，研究了HB1在高磷和低磷土壤中的定殖情況及其活化土壤磷的能力。

2.3.1 草酸青霉菌HB1在土壤中的定殖情況

菌株在土壤中的定殖情況直接影響著菌株在土壤中發揮溶磷作用，其中溶磷菌能否在作物根際土壤成功定殖至關重要[21-22]。一般而言，溶磷菌株在土壤中的定殖能力越強，代謝分泌物越多，其功能就越顯著。菌株在土壤中的定殖能力是衡量菌株溶磷能力的一種有效方法[23]。因此，本研究采用了平板計數法來探究草酸青霉菌HB1在不同磷水平土壤中的定殖情況，將菌株HB1接種到兩種不同有效磷水平土壤中，結果表明菌株HB1在土壤中均能很好的定殖（圖6）。

在低磷土壤中（圖6a），培養到第3 d時，HB1菌的菌落數達到最大，為1.30×108cfu/g，是初始菌落數的9.77倍，之后開始逐漸下降，到第37天時，菌落基本全部消亡。

在高磷土壤中（圖6b），HB1菌接入土壤后的第一天菌落數迅速增加，達到1.60×108cfu/g，是初始菌落數的12.03倍。雖然在之后的培養時間內菌落數開始呈下降的趨勢，在第37天時菌落數達到最低值，但其仍舊高于初始菌落數，為初始菌落數的1.19倍。

綜上所述，說明HB1菌均可很好的在低磷土壤和高磷土壤中定殖。

圖6 草酸青霉菌HB1在土壤中的定殖情況

2.3.2 草酸青霉菌HB1對土壤有效磷含量變化的影響

從圖7可以看出，在2種磷水平土壤中，與對照相比，接種菌株HB1的土壤速效磷含量隨著培養時間的增加均呈升高趨勢，說明草酸青霉菌HB1具有較好的溶磷效果。

低磷土壤中（圖7a），接種HB1菌的土壤速效磷含量在培養第10天時達到最大值。在培養3～21 d內，比對照增加了17.44%～45.00%，差異顯著（<0.05），溶磷效果明顯；在培養第37 d時土壤速效磷含量比對照增加了14.28%，但差異不顯著（>0.05）。高磷土壤中（圖 7b），從培養的第一天開始，接種HB1菌土壤的速效磷含量高于對照，比對照增加了0.96%～14.17%。

同時在整個培養期間，無論是低磷土還是高磷土中，對照處理土壤中速效磷含量也有一定增加，這是因為土壤微生物系中也有一定的溶磷菌在發揮作用。

注：不同小寫字母表示不同處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters showed significant differences among different treatments (< 0.05).

圖7 草酸青霉菌HB1對土壤速效磷含量的影響

Fig. 7 Effects ofHB1 on the content of available P in soil

3 討 論

平板解磷圈法是研究微生物解磷能力最常用的方法，溶磷圈直徑、菌落直徑及其溶磷圈直徑/菌落直徑是表征溶磷菌相對解磷能力的指標[10]。有研究報道，青霉菌屬菌株在以磷酸鈣為磷源的培養基上可良好生長，且具有較高的溶磷效果[24]，其中草酸青霉菌P8在以磷酸鈣為磷源的固體培養基上培養5 d時溶磷圈直徑/菌落直徑為1.26[25]，草酸青霉菌P22、P29和P36在以磷酸鈣為磷源的固體培養基上培養3 d時溶磷圈直徑/菌落直徑為1.22～1.29[7]。本研究草酸青霉菌HB1在以磷酸鈣為磷源的固體培養基上培養3 d時溶磷圈直徑/菌落直徑為1.23，與前人研究相比HB1菌溶解磷酸鈣的能力較好；另外，草酸青霉菌P36在固體平板上溶解磷礦粉的溶磷圈直徑/菌落直徑為1.00[7]，而草酸青霉菌HB1溶解磷礦粉溶磷圈直徑/菌落直徑最大達到1.22，因此HB1菌溶解磷礦粉的能力也較好；范丙全[10]研究草酸青霉菌P8和Pn1時發現兩株菌株在以磷酸鐵為磷源的瓊脂培養基上溶磷圈直徑/菌落直徑分別為1.07和1.08，HB1菌在以磷酸鐵為供試磷源時其溶磷圈直徑/菌落直徑達到1.09，說明三個草酸青霉菌株對磷酸鐵的溶解能力相似。

草酸青霉菌Mo-Po溶解磷酸鈣的有效磷含量為64.87 mg/L[26]，草酸青霉菌C’溶解磷酸鈣的有效磷濃度最高達642 mg/L[27]，本研究中，草酸青霉HB1菌在銨態氮和硝態氮條件下溶解磷酸鈣的有效磷濃度分別達884 mg/L和945 mg/L。王光華等[24]發現供應銨態氮，青霉菌（）P66培養72 h對磷礦粉的活化率達到40%左右；鐘傳青等[28]研究溶磷細菌（）P17時發現，該菌在銨態氮的供應下可以較好地溶解磷礦粉而釋放出磷。在本研究中，HB1菌也能夠有效地溶解、轉化磷礦粉中的難溶磷，而且在兩種氮源條件下，接種HB1菌處理的有效磷含量分別與未接菌和滅活菌處理相比，差異均達到顯著水平（<0.05），且在銨態氮條件下溶磷能力顯著大于硝態氮（<0.01），其有效磷含量達到199 mg/L。這說明，草酸青霉菌HB1能夠更好地利用銨態氮來提高自身的溶磷能力。而范丙全[10]研究青霉菌P8和Pn1溶解磷礦粉的過程中卻發現，使用硝態氮時兩株溶磷菌的溶磷能力高于銨態氮。由此說明草酸青霉不同溶磷菌株供應的氮源不同，從而導致其溶磷能力存在差異，因此，應用溶磷菌株時需找到其最佳的氮源供應條件。

一般而言，微生物的溶磷機制存在以下兩種情況：一是微生物在代謝過程中通過呼吸作用和NH4+同化作用分泌氫質子，使其培養介質pH下降，導致磷酸鹽溶解；二是微生物分泌的有機酸降低了pH值，與Ca2+、Al3+、Fe3+等離子結合，使難溶性磷酸鹽溶解[29]。有大量研究表明溶磷菌在培養過程中pH與解磷量之間的變化呈顯著相關關系[29-30]。本研究中，接種HB1菌后培養液中并未檢測到主要有機酸的存在，但是發酵液中pH顯著低于未接菌處理，這說明草酸青霉菌HB1主要是通過第一種溶磷機制來促進難溶性磷酸鹽溶解并釋放磷素的。當供試氮源為銨態氮，磷源為磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鐵、磷酸鋁，對照、HB1菌處理、滅活HB1菌3個處理的培養液中pH值與有效磷含量之間也均存在極顯著負相關關系（=-0.89**、=-0.89**、=-0.85**、=-0.84**），這進一步說明HB1主要是通過第一種溶磷機制來促進難溶性磷酸鹽的溶解并釋放出磷素；當供試氮源為硝態氮，磷源為磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鋁，與CK相比，接種HB1菌處理的pH值也均顯著降低（<0.05），且pH值與有效磷含量之間也均存在極顯著負相關關系（=-0.83**、=-0.95**、=-0.88**）。眾所周知，微生物吸收NO3--N并不具有向外釋放H+的能力，而是微生物協同吸收NO3--N和H+，所以使溶液中OH-數量增多，進一步導致培養液的pH值升高。當微生物吸收利用1 mol NO3-時，就會消耗掉等量的H+或釋放出等量的OH-，使培養介質的pH升高[31]。因此，硝態氮供應條件下接種HB1菌的發酵液pH顯著降低的原因是HB1菌吸收NO3--N和H+的同時并通過自身呼吸作用向外釋放CO2，后者對pH的降低程度大于前者對pH升高的程度時就導致液體培養基pH降低，達到“酸解”釋放磷的目的。此外，已有的研究也發現溶磷量與培養介質的pH之間并不總是呈負的相關性[32-33]。在本研究中也發現了這一點：當供試磷源為磷酸鐵，氮源為硝態氮時，不僅接種HB1菌處理的pH值與對照和滅活菌處理相比顯著升高（<0.05），而且3個處理的發酵液pH值和有效磷含量之間存在顯著的正相關關系（=0.93**,=27）。分析原因發現，對照、HB1菌、滅活HB1處理的初始液體培養基pH 7.0，培養3 d后培養液pH分別降為4.47～4.57、5.51～5.75、4.14～4.15（表5），說明礦物態磷酸鐵中含有一定量的氫，搖瓶培養一段時間后，磷酸鐵在溶解過程中，該礦物中包裹的H+得以釋放導致液體培養基的pH急劇降低，尤其是對照和滅活HB1處理。接種HB1菌的處理的液體培養基中pH降低幅度較小，其原因是因為HB1在生長和繁殖過程中需要吸收氮源來完成其生命周期，當生長介質中只有NO3--N時，HB1菌協同吸收硝態氮和氫質子，使培養基中OH-的濃度增加，中和了一部分因磷酸鐵溶解釋放出的H+所致，這也間接說明HB1保持了活性進而促進了磷的釋放。

菌株在土壤中的定殖能力對其溶磷效果起著決定性作用[34]。溶磷棘孢青霉菌（）Z32可以很好地在土壤中定殖，并在第21天時HB1溶磷菌株的活菌數高出初始數量的10倍[15]。草酸青霉菌HB1在兩種土壤中展現出了不同的定殖趨勢，其原因與土壤中有效磷含量的多少有極大的關系。低磷土壤中，有效磷含量低，接入的HB1菌需要溶解土壤中的難溶性磷源來供給自己的生長和繁殖需要，故出現培養時間在第3天時菌數增多的現象；而在高磷土壤中，有效磷含量充足，HB1菌可以直接吸收土壤中的有效磷來滿足自己的生長需求。

4 結 論

1）固體平板培養初步鑒定草酸青霉菌HB1溶解難溶性磷酸鹽溶解磷酸鈣的溶磷能力較強，其溶磷圈直徑/菌落直徑為1.10～1.23。

2）供應NH4+-N和磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鐵和磷酸鋁時，HB1菌發酵液pH與有效磷含量之間存在極顯著負相關關系，初步探明HB1菌的溶磷作用機制為在生長過程中增加培養基質中H+質子降低pH值，通過酸解達到溶磷的效果。

3）草酸青霉菌HB1可在土壤中定殖并表現出溶磷效果，其在低磷土壤中的溶磷效果要好于高磷土壤。

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Ability and mechanism ofHB1 solubilizing phosphates

He Di1, Geng Liping1, Guo Jia1, Lu Xiujun2, Liu Wenju1※, Li Bowen1

(1.,,,,071001,; 2.,,071001,)

We all know that some functional microorganisms can dissolve insoluble phosphates and it is different from the abilities of the same strain mobilizes different phosphates. The experiments of plate cultivation and shaking culture were carried out to explore the abilities and mechanisms ofHB1 to mobilize different insoluble phosphates (Ca3(PO4)2, phosphate rock powder, FePO4, AlPO4) when different forms of nitrogen (NH4+-N, NO3--N) were supplied in the growth medium. Furthermore, a soil incubation experiment was conducted to verify the capacity of HB1 solubilizing insoluble phosphate in two types of soils with low and high levels of available phosphorus. The results of plate cultivation showed that phosphate dissolving zone was observed on each plate with different phosphates of Ca3(PO4)2, phosphate rock powder, FePO4and AlPO4. The calculated ratios of phosphate solubilizing zone and bacterial colony followed the trends of Ca3(PO4)2> phosphate rock powder > FePO4> AlPO4,which indicated that the ability of HB1 to dissolve Ca3(PO4)2was better than others. In order to prove the abilities of HB1 mobilizing different insoluble phosphates further, the shaking cultural experiment was set up and the results clarified that the phosphate solubilizing capacity of HB1 varied with different mineral phosphates and two different forms of nitrogen in growth mediums. When Ca3(PO4)2or FePO4was supplied, the concentrations of phosphorus (P) in the nutrient solution with HB1 were 884 mg/L or 265 mg/L on the condition of NH4+-N, and 945 mg/L or 206 mg/L with NO3--N addition, respectively. However, there was no significant difference in P concentrations of solution between NH4+-N or NO3--N addition. Meanwhile, HB1 enhanced phosphorus released from Ca3(PO4)2markedly compared withFePO4, which illustrated that P concentrations in solution with HB1 and Ca3(PO4)2were 2.34-3.59 folds higher than those of FePO4in the growth medium. Moreover, when phosphate rock powder and NH4+-N supplied, the concentration of phosphorus in the solution with HB1 was 199 mg/L, which was 7.14 times of that of NO3--N situation. However, the concentration of phosphorus in the nutrient solution with HB1 was 120 mg/L when AlPO4and NO3--N applied, which was 3.29 times of that of NH4+-N. Therefore, shaking cultural experiment demonstrated thatHB1 dissolved the P from different insoluble phosphates indeed and the rank of P mobilizing ability followed Ca3(PO4)2> phosphate rock powder and FePO4> AlPO4when NH4+-N supplied in growth medium, whereas followed Ca3(PO4)2> FePO4> AlPO4> phosphate rock powder when NO3--N applied. It suggested that different N forms in growth medium did not affect the ability of HB1 dissolving P from Ca3(PO4)2and FePO4, but influence this ability for AlPO4and phosphate rock powder. NH4+-N is better for HB1 to mobilize phosphate rock powder, and NO3--N applied is a benefit for HB1 to dissolve AlPO4. Furthermore, there were significant negative relationships between P levels and pH in growth medium with NH4+-N, which indicated the possible mechanisms thatHB1 could exudate H+to the solution, then decreased pH in the growth medium, and finally enhanced the releases of P from different insoluble phosphates. The ability of HB1 dissolving insoluble P was proved in the experiment of soil incubation as well. The results showed that concentrations of available phosphorus in HB1 treatments increased by 45.00% and 14.17% in low-phosphorus soil and high-phosphorus soil after incubation for 21 days, respectively. In summary, HB1 had the strongest phosphate-dissolving capacity for Ca3(PO4)2, followed by FePO4andphosphate rock powder when NH4+-N addition, which was dissolved through H+exudate byHB1. It would be a better pathway to use HB1 mobilizing insoluble phosphate in soils with low available phosphorus.

phosphorus; soils; bacteria; insoluble phosphate; soil colonization;HB1

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2019-08-01

2019-12-25

河北省應用基礎研究計劃重點基礎研究項目（17962902D）；國家科技支撐計劃（2015BAD23B01）

何迪，主要從事土壤環境質量研究。Email：hedinuannuan@163.com

劉文菊，博士生導師，教授，主要從事土壤環境質量研究。Email：liuwj@hebau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.02.030

S154.3

A

1002-6819(2020)-02-0255-11